siRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体的制作方法

专利名称：siRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属生物医学领域，特别涉及siRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋 白融合靶基因表达载体。 现有技术
RNA干扰(RNAinterference, RNAi)技术是涉及基因功能、基因治疗、 药物靶分子筛选等领域的重要研究手段。其中，筛选具有生物活性的小干扰 RNA ( small interference RNA, siRNA)是RNAi技术应用的关键步骤。目前， 商品化的RNAi筛选系统以lac为报告基因，与耙基因序列重组构建融合基 因表达载体。
(1)目前有invitrogen公司开发的商品化的RNAi目标筛选系统 ——BLOCK-IT RNAi目标筛选系统。该筛选系统工作原理为从任一 Gateway 中间载体或Ultimate ORF克隆.重组目的基因到 pSCREEN-IT/lacZ-DEST Gat,eway载体，并使用RNAi抑制试剂进行共转染。 表达基因将与lacZ融合。通过分析检测e-半乳糖苷酶的活性，将产生的结 果与从qRT-PCR获得的结果进行比较。P -半乳糖苷酶水平是目的基因RNAi 诱导降解量的指示剂，P-半乳糖苷酶的水平越低，介导RNAi试剂的效果就 越好。该筛选系统的不足之处在于需要的实验步骤与实验试剂过多，不能 直接从细胞内检测到筛选效果，而需要单独的半乳糖苷酶量化试剂盒，步骤 繁多，而且价格昂贵，不适于大面积推广(2) Xiu-Min ZHOU, Ju-Sheng LIN, Yi SHI，et al.Establishment of a Screening System for Selection of siRNA Target Sites Directed against Hepatitis B Virus Surface GeneJ.Acta Biochimica et Biophyska Sinica2005, 37(5): 310"316.该文献研究的siRNA筛选系统的原理是扩增目的基因， 在其引物5'端分别设计///^////和/^"/两个内切酶位点，并将其重组入pGEM-T 载体中，即构成筛选psiRNA-HBs的载体pHBs-EGFP，将psiRNA-HBs和 pHBs-EGFP共转染至HeLa细胞中，通过荧光显微镜检测HBs-GFP融合蛋白的 表达来判断有效的psiRNA-HBs。该文献存在的问题是其表达载体上用于连 接目的基因的两个内切酶位点是随机选用的，不能实现商品化生产。 发明内容为了克服上述现有技术不足，本发明的目的就是提供siRNA筛选系统的 通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体，通过检测荧光强度可以非常方便 快速地鉴定相应siRNA序列的沉默效果，从而筛选出最有效的siRNA序列。本发明的技术方案是这样实现的本发明包括该载体以pEGFP-Cl载体 为基础，在1336-1363 ^造SSe8387I和Notl两个内切酶位点，其竿体大小 为4695bp，载体命名为pEGFP-RNAi，序列,如下1 TAGTTATTAA TAGTAATCAA TTACG&GGTC ATTAGTTCAT AGCCCATATA TGGAGTTCCGSI CGTTACATAA CTTACGGTAA ATGGCCCGCC TGOCTGACCG CCCAACGACC CCCGCCCATT121 GACGTCAATA ATGAGGTATG TTCCCATAGT AACGCCAATA GGGACTTTCC ATT&ACGTCA181 ATGGGTGGAG TATTTACGGT AAACTGCCCJL CTTG&CAGTA CATCAAGTGT ATCATATGCC241 AAGTACGCCC CCTATTGACG TCAATGACGG TAAATGGCCC GCCTGGCATT ATGCCCAGTA301 CATGACCTTA T&GGACTTTC CTACTTG&CA GTACATCTAC GTATTA&TCA TCGCTATTAC3" CATGGTGATG CGGTTTTGGC AGTACATCAA TGGGCGTGGA TAGC&GTTTG ACTCACGGGG421 ATTTCCAAGT CTCCACCCCA TTGACGTCAA TG&GAGTTTG TTTTGGCACC AAAATCAACG481 GGACTTTCCA AAATGTCGTA ACAACTCCGC CCCATTGACG CAAATGGGCG 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之配套的携带SSe8387I和Notl酶切位点上、下游引物的接头，保证siRNA 靶基因片段方便地插入新型pEGFP-RNAi载体。本发明构建的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体，可以通过检测 荧光强度非常方便快速地鉴定相应siRNA序列的沉默效果，从而筛选出最有 效的siRNA序列。本发明在成功构建通用性绿色荧光蛋白融合耙基因表达载 体后，用一条针对MAPK基因的siRNA来验证该载体是否能正常工作。结' 果显示不同浓度siRNA与通用性绿色荧光蛋白融^ MAPK基因衷达载体 共转染后，用激光共聚焦显微镜检测到在各siRNA浓度组，细胞内 MAPK-GFP融合蛋白的表达量均有不同程度的下降。证实该通用性绿色荧光 蛋白融合耙基因表达载体可以成为siRNA的筛选系统。


图l是通用性绿色荧光蛋白融合耙基因表达载体示意图及其内切酶位点
详细序列(插入的两个新的内切酶位点位置在1336-136b); 图2 (A)为MAPK的PCR产物； 图2 (B)为pMAPK-EGFP的双酶切结果；图3是具体实施例中对照组及通用性绿色荧光蛋白融合MAPK表达载体 与siRNA共转染各组激光共聚焦图像；图3 (A)荧光对照组；图3 (B) siRNA5nM组； 图3 (C) siRNA10nM组；图3 (D) siRNA25nM组； 图3 (E) siRNA50nM组。 图4是具体实施例中流式细胞荧光检测结果；图4 (A)细胞空白组；图4 (B)细胞荧光对照组；图4 (C) siRNA 50nM组；图4 (D) siRNA 25nM组； 图4 (E) siRNA10nM组；图4 (F) siRNA5nM组。下面结合附图对本发明的内容作进一步详细说明。
具体实施方式
siRNA筛选系统的通用,绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体，包括孕用 性绿.色荧光蛋白融合靶基因表达载体、感受牵细菌、质粒提取试剂盒、 HEK293细胞。参照图1所示，包括通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体，该载体 以pEGFP-Cl载体为基础，包括人巨细胞病毒CMV启动子，增强的绿色荧 光蛋白基因EGFP，单纯疱疹病毒HSV胸苷激酶TK多腺苷酸化信号，SV40 早期启动子组成元件，在1336-1363增加SSe83871和Notl两个内切酶位点， 其载体大小为4695bp，载体命名为pEGFP-RNAi。 SiRNA筛选流程
1) 设计目标基因的PCR引物针对pEGFP-RNAi载体的SSe83871和NotI 酶切位点，设计靶基因PCR引物。在上游引物5，端增加CCTGCAGG(SSe83871酶切位点)，下游引物5'端增加GCGGCCGC (Notl酶切位点)。
2) PCR扩增靶基因片断。
3) 通过TA克隆，把目的基因连接到T载体，测序确认。
4) 双酶切重组T载体及pEGFP-RNAi，电泳分离并提取靶基因和线型 pEGFP-RNAi，连接耙基因和线型pEGFP-RNAi，绿色荧光报告-耙基 因载体(融合基因载体)，测序确认。
5) 将融合基因载体转染HEK293细胞，形成siRNA筛选系统(靶基因与 GFP融合蛋白的表达率与siRNA的有效率成反比)。
6) 根据siRNA设计原则(遗传2006， 28 (11 ) 1457-61)设计多条siRNA 序列，化学合成或体外转录后备用。
7) 应用筛选出的有效siRNA转染融合基因载体-HEK293细胞，以激光共 聚焦显微镜、^光显微镜或流式细胞仪检测siRNA沉默效，果。
MAPK-EGFP荧光报告载体构建及有效siRNA的筛选验证实验目的构建MAPK-EGFP荧光报告载体并利用此系统快速筛选验证有效的siRNA序列。
实验步骤
1) MAPK基因片断的获取提取正常人小肠组织总RNA，逆转录为cDNA，根据NCBI数据库提供的 MAPK基因序列(NM—002745)设计引物，'序列为sense: 5， gcgcctgcagggggtgtagaggtaaccagtagc 3，(含SSe8387I酉每切位点)，antisense: 5， cccgcggccgcgttcaggaggatgaggagatg 3，(含NotI酶切位点)；PCR后将产物连入 pMD19-T载体并酶切鉴定阳性克隆。2) pMAPK-EGFP荧光报告载体构建及鉴定将MAPK重组T载体及pEGFP-RNAi分别用SSe8387I及Notl双酶切，凝胶电泳后分别回收纯化酶切片断，通过T4连接酶16'C连接过夜后，将连接产物 转化入大肠杆菌TOP10菌株中扩增，筛选阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定重 组子并测序确认。3) 针对MAPK基因的siRNA序列的设计与合成综合最新的各种有效siRNA序列的设计原则，通过siRNA设计系统软件 选择针对MAPK基因的特异性干扰区域(目标区域为MAPKcDNA: 5， GGCACCTGACTTGTAAAAA3')，再根据Ambion公司的Silencer siRNA转 录试剂盒说明书合成siRNA转录模板，序列为sense, 5， aatttttacaagtcaggtgcccctgtctc 3 ， ， antisense ， 5 ， aaggcacctgacttgtaaaaacctgtctc 3 ，。4) 荧光报告载体与siRNA共转辯入HaLa细胞待细胞进入对数增殖期，通过脂质体2000把pMAPK-EGFP重组质粒及 siRNA共转染入HaLa细胞，siRNA干扰组设4个浓度5nM， 10nM， 25nM及 50nM。转染后24小时检测荧光强度变化。5) 激光共聚焦检测荧光强度置爬片于24孔板内并种植Hala细胞，24小时后用脂质体2000共转染荧光报 告载体及siRNA， 4小时后换全培养基继续培养24小时，PBS洗涤细胞2次后
取出爬片于激光共聚焦显微镜下观测荧光强度。 6)流式细胞仪检测荧光强度种植HaLa细胞于6孔板内，24小时后用脂质体2000共转染荧光报告载体 及siRNA， 4小时后换全培养基继续培养24小时，胰酶消化并用PBS洗漆细胞 2次，用流式细胞仪检测绿色荧光蛋白表达情况。 实验结果1) 荧光报告系统pMAPK-EGFP载体的构建参照图2 (A)、图2 (B)所示，采用RT-PCR成功地从人小肠组织扩增出 MAPK基因片断，大小约为1.2kb。 PCR产物连接于pMD-T载体后双酶切，再 与pEGFP-RNAi连接，双酶切鉴定显示重组成功测序结果亦显示与NCBI上的序列一致。2) 激光共聚焦结果参照图3所示，共转染后24小时取出爬片检测，以荧光对照组为标准， 固定激光共聚焦各个参数，每组各取细胞10个左右，方差分析显示RNA干扰 各组荧光强度明显下降，在10nM浓度组达最高降幅70X。3) 寧式细胞结果 ，参照图4所示，以正常细胞为标准调节各参数后，每组各获取10000个 细胞并计数，结果显示正常细胞有微弱荧光，荧光对照组有强荧光表达，而 各个RNA千扰组荧光表达均有明显的下降，其中10nM及25nM具有最高荧' 光下调率达60%。上述实施例证明该系统可以很好的评价siRNA的千扰效果。该荧光筛选 系统亦可作为研究有效siRNA设计原则的良好工具。
序列表1TAGTTATTAATAGTAATCAAATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGCGTTACATAACTTACGGTAACCCAACGACCCCCGCCCATT121GACGTCAATATTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCA181AAACTGCCCACATCAAGTGTATCATATGCC241CCTATTGACGTAAATG&CCCGCCTGGCATTATGCCCAGTA301CATGACCTTATGGGACTTTCCTACTTGGCAGTACJLTCTACGTATTAGTCATCGCTATTAC361CATGGTGATGCGGTTTTGGCAGTACATCAATAGCGGTTTG421ATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATTTTGGCACCAAAATCAACG481GGACTTTCCAAAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGS41GTCTATATAATTTAGTGAACSOIGCCCATCCTG6S1ACGGCGACGTAAACGGCCAC721GATGCCACCTACGGCAAGCTTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTG781CCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCCCGCTACCCC841GACCACATGACttcttCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAC'&AG301CGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCC3"TGGTGAACCG1021ACGTCTATAT10S1ACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGA1141GTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCC1201CCCGACAACCCACCCAGTCCAAGACCCCAAC&AGAAGCGCTCCTGCTGGAGTTCGTGACCTCACTCTCGG1321A&GGAATTCCCGCATTCTAGATAACT&ATC13S1ATJUTCAGCCTTACTTG€TTTAAAAAACCTCCCACACCTC1441CCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCAATTGTTGTTGTTAACTTGTTTATTGCAGCT1S01TATAATGGTTACAAATAAAGCAAATAAAGCATTTTTTTCACTGCATTCTAGTTGTGGTTTGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGTAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAJUTTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCATCCCTTATAAATCAAAAGAA1741TGTTGTTCCA1801GCGAAAAACCGTCTATCAGGCCATCACCCTAATCAAGTTT1SS1TTTGGGGTCGAAGCACTAAATCGGAACCCTCCCGATTTAG1921CGAAAGGAGC19S1CACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGC2041GCTTAATGCGTGGCACTTTTTGCGCGGAAC2101CCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACC2701CCGGCTGTCAGCCCGGTTCTACCGACCTGTCCGGTGCCCTGAATGAACTGCAGCGCGGCTGCGTTCCTTG2S21CGCAGCTGTGTCACTGAAGC28S1GATCTCCTGTCATCTCACCTTGCTCCTGCCCCATCATGGC2341TCCGGCTACCTGCCCATTCGACCACCAAGC3001GAAACATCGCCiLCGTACTCG30S1GAGCATCAGGTTCGCCAGGC3121CATGCCCGACTCGTCGTGACCCATGGCGATGCCTGCTTGCCGAATATCAT31S1GGCCGCTTTTCTGGATTCATCGACTGTGGC12 3241ATAGCGTTGOCTACCCGTGA3301TGACCGCTTCCTC&TGCTTTCGCTCCCGATTCGCAGCGCATCGCCTTCTA33"TCGCCTTCTTCGACCAAGCG3421ACGCCCAACCTGCCATCACGAGATTTCGATTCCACCGCCGCCTTCTATGA3481TTCGGAATCGTTTTCCGGGAATGATCCTCCTCTCATGCTG3S41GAGTTCTTCGCCCACCCTAG3601AATAAAAAGACAGAATAAAATGGGTCGTTTGTTCATAAACTGGCACTCTGTCGATACCCC3721CJlTTGGGGCCAATACGCCCGCGTTTCTTCCTTTTCCCCACCCCJLCCCCCC3781CAACGTCGGGCTGCCATAGCCTCAGGTTAC3S41TCATATATACTTTA"TTGATTTAAAACTTCATTTTTAAT3901ATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCGCGCGTAATC4021TGCT&CTT&CAAACAAAAAATTTGTTTGCC4081CTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCJLGAGCGCAGATACCAAATACTGTC41"CTTCTAGTGTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATAC4201CTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCGATAAGTCGTGTCTTACCATTACCGCCATGCAT
权利要求
1、 siRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体，其特 征在于，该载体以pEGFP-Cl载体为基础，在1336-1363改造SSe83871和 Notl两个内切酶位点，其载体大小为4695bp，载体命名为pEGFP-RNAi，序 列如下1TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGGGGTCATTAGTTCATAGCCCATATATGGAGTTCCGSlCTTJLCGGTJUCCCAACGACCCCCGCCCATT121GACGTCAATAATGACGTATGTTCCCATAGTAACGCCAATAGGGACTTTCCATTGACGTCA1S1TATTTACG&TAAACTGCCCACATCAAGTGT241AAGTACGCCCCCTATTGACGTAAATGGCCCATGCCCAGTA301CTACTTGGCAGTACATCTACTCGCTJLTTAC3S1CGGTTTTGGCA(VTACATCAAACTCACGGGG421ATTTCCAAGTCTCCACCCCATTGACGTCAATTTTGGCACC4S1AAATGTCGTAACAACTCCGCCCCATTGACGCAAATGGGCGGTCTATATAATTTAGTGAACCGTCAGATCCS01CCGGTCGCCAGCCCATCCTGSS1AAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGA721GATGCCACCTTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTG7S1CCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCCCGCTACCCC841TCCGCCATGC901CGCACCATCT3S1GGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGACTTCAAGGAGGACC'GCAAC1021ATCCTGG&GCAACAGCCACAACGTCTATAT1081AAGATCCGCCACAACATCGA11"CCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCG1201CCCGACAACCACTACCTGAGCACFCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAATCACTCTCG&1321CTGTACAAGTCCGGACCTGCAGGGAATTCC1381'ATAATCAGCCATACCACATTTTACTTGCTTCCCACACCTC144丄CCCCTGAACCTGAAACATAAAATGAATGCATTAACTTGTT1S01TJtTAAT&GTTACAAATAAAGCAATAGCATCACAAATTTCACAAATAAAGCATTTTTTTCA1SS丄CTGCATTCTAGTCCAAACTCATCAATGTATCTTAACGCGTAAATTGTAAGTTTTTGTTAATTTTTAACCA1SS1TCCtTTATAA1741TGTTGTTCCAGTTT&&AACAATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGG1S01GCGAAAAACCGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTT18S1TTTC'GGGTCGAAGCACTAAATCGGAACCCTCCCGATTTAG1321AGCTTGACGG1981CACCCGCCGC2041GCTTAATGCGTGGCACTTTT2101CCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAiLATATGTATCCGCTCATGA <formula>formula see original document page 3</formula>
2、根据权利要求1所述的siRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋白融合 耙基因表达载体，其,征在于，pEGFP-RNAi载体1336-1343为，SSe8387I 内切酶位点CCTGCAGG， 1356-1363为Notl内切酶位点GCGGCCGC。
全文摘要
本发明公开了siRNA筛选系统的通用性绿色荧光蛋白融合靶基因表达载体，该载体以pEGFP-C1载体为基础，包括人巨细胞病毒CMV启动子，增强的绿色荧光蛋白基因EGFP，单纯疱疹病毒HSV胸苷激酶TK多腺苷酸化信号，SV40早期启动子组成元件，在1336-1363增加SSe8387I和NotI两个内切酶位点，其载体大小为4695bp，载体命名为pEGFP-RNAi。本发明通过检测荧光强度可以非常方便快速地鉴定相应siRNA序列的沉默效果，从而筛选出最有效的siRNA序列。
文档编号C12Q1/68GK101121939SQ20071001785
公开日2008年2月13日 申请日期2007年5月15日 优先权日2007年5月15日
发明者刘利英, 宋土生, 许德晖, 辰 黄 申请人:西安交通大学