专利名称：一种枯草芽孢杆菌生产γ-谷氨酰转肽酶的方法
技术领域：
本发明涉及一种枯草芽孢杆菌生产Y-谷氨酰转肽酶的方法，属于食品生物 技术领域。
背景技术：
y-谷氨酰转肽酶(Y-glutamyltranspeptidase， y-GTP， EC 2. 3. 2. 2),即y-谷 氨酰转移酶，是生物体内谷胱甘肽代谢的相关酶之一，也是催化转移L-Y-谷氨酰
基的特异性酶。Y-谷氨酰转肽酶可以催化以下3类反应
(1) 转肽反应Glutathione+amino acid^~~ y-glu-amino acid+Cys-Gly
(2) 自转肽反应Glutathione ^~ y-glu-glutathione+Cys-Gly (3沐解反应Glutathione+H20 ^~ glutamine+Cys-Gly
它在生物体中分布相当广泛，从细菌到高等哺乳动物体中都有该酶的存在。 血清中Y-谷氨酰转肽酶活性是肝胆疾病的相当灵敏的指示剂，在临床上已经用于 肝脏细胞癌变和肝癌形成的检测指标物，现也研究其在其他组织病变过程中的 作用。该酶还是Y-谷氨酰循环中的关键酶，在细胞中通过转肽反应可以进行细胞 间的氨基酸分子运输。目前，广大研究者更为关注的是该酶在生物催化合成中 的重要应用(l)催化合成药物或药物前体，如帕金森综合症的前体药物L-Y-谷氨 酰-L-多巴的合成、谷胱甘肽的合成、L卞谷氨酰-牛磺酸的合成(该物质会影响 脑中的单胺的浓度、猫的攻击性行为、以及电击引起的失忆症，还有抗癫痫等)， ，D-谷氨酰-L-色氨酸(SCV-07)合成(SCV-07是一种新型的广谱免疫调节类化合 物，其作用类似胸腺素al)、以及茶氨酸的合成(该物质更是具有降血压、抗 肿瘤、提高免疫力、抗抑郁、神经保护作用、改善经期综合征、减轻体脂等保 健作用)。(2)氨基酸的修饰和改性，将具有苦味的氨基酸(L-型的芳香氨基酸、 碱性氨基酸及有支链的氨基酸)通过Y-谷氨酰化可对其进行风味的改变，通过Y-谷氨酰化还能增强某些物质的稳定性和可溶性，如胱氨酸通过Y-谷氨酰化转变为 Y-谷氨酰-胱氨酸后，其可溶性极大增强；Y-谷氨酰-皮啡肽因其稳定性增强可用 作具有镇痛作用的前体药物。(3)氨基头孢菌烷酸(7-ACA)的制备，7-ACA是生
产头孢菌素的关键性中间体。
Y-谷氨酰基化合物是一类重要的氨基酸衍生物，在食品、医药、化妆品等领 域具有广泛的应用前景。利用Y- GTP生物催化合成，谷氨酰基化合物是制备系
列Y-谷氨酰基化合物的有效手段。
，谷氨酰转肽酶制备主要有这样两个途径 一是从动植物中富含酶的组织中
提取纯化；二是微生物法生产酶蛋白。由于以前采用这两种方法获得，GTP都 比较困难，导致，GTP的产量较低，使得采用酶法合成Y-谷氨酰基类化合物一 直处于实验室的研究阶段。自从1952年有人尝试从普通变形杆菌中分离Y-GTP， 才开始了微生物法生产酶蛋白的研究。此后Suzuki等利用基因工程构建E.Coli 的"GTP生产菌，但由于Y-GTP含量极低，无法分离而不具有商业价值。近来 浅田芳宏等发现有些芽孢杆菌可在体外分泌y-GTP，并得到一株最高可产Y-GTP 每毫升3.0U的菌株。国内南京工业大学徐虹教授等人从土壤里筛选分离得到一 株产胞外Y-GTP的Bacillus subtilisNX-2，其酶活力达到每毫升3.2 U。可见采用 产酶性能优良的菌种，尤其是产胞外Y-谷氨酰转肽酶的菌株，摸索出成熟的工 艺条件，对以后大规模生产Y- GTP至关重要。
发明内容
本发明目的是提供一种枯草芽孢杆菌生产Y -谷氨酰转肽酶的方法。 本发明所使用的枯草芽孢杆菌，是本发明人等先前从发酵食品虾酱中筛选
得到的一株可以高产Y-谷氨酰转肽酶的菌株，其分类命名为枯草芽孢杆菌 (Bacz7/"wwto'fe) SK11.004，己保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏日期为 2008年7月10日，保藏编号CCTCCNO: M208083。
本发明的技术方案 一种枯草芽孢杆菌生产，谷氨酰转肽酶的方法 (1)对，谷氨酰转肽酶产生菌枯草芽孢杆菌(Bac!7/iwswMfc) SK11.004
进行斜面、种子、发酵三级培养；
斜面培养培养基组分以g/L计蛋白胨8 10，牛肉膏3 5，氯化钠3 5，琼脂20， pH7.0 7.2， 12rC灭菌20min，培养条件为培养温度35 40。C， 培养时间8 16小时；
种子培养培养基组分以g/L计葡萄糖15 20，酵母膏10 15，玉米浆 8 12， MgSO4.7H2O0.3 0.5， K2HPO40.5 2，含消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三 油0.5mL/L， pH7.0 7.2， 12rC灭菌20min;培养条件为250mL三角瓶装 液30mL，摇瓶转速200rpm,培养温度37X:，培养时间8 12小时； 一级种子 培养基按体积百分2.5 %接入装液量为18升液体种子培养基的30升二级种子罐 中，培养条件为搅拌速度200rpm，控制通风量0 5小时为8 10L/min， 5 12小时为12 15L/min;控制培养温度为35 40°C ，培养时间8 12小时；
发酵培养培养基组分以g/L计蔗糖15 35，胰蛋白胨5 8，玉米浆 12 15， MgSO4.7H2O0.3 0.5， K2HPO40.5 2，消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油 2mL/L， pH7.0 7.2， 12rC灭菌20min，调pH7.0 7.2;种子培养基按体积 百分2.5%接入装液量700升液体发酵培养基的1吨发酵罐中，培养条件为搅 拌速度200rpm，控制通风量0 8小时为10 12L/min， 8 16小时为14 16L/min;控制培养温度为35 40°C ，培养时间14 16小时；
(2)从发酵液中分离纯化得到Y-谷氨酰转肽酶酶粉；
将制得的发酵液经离心或板框过滤去菌体，制得发酵液上清液，经超滤除
去盐和杂蛋白，再经20°/。酒精沉淀，离心得沉淀，最后将沉淀进行冷冻干燥， 即得Y-谷氨酰转肽酶酶粉。
本发明中的谷氨酰转肽酶活性，是通过使酶作用于Y-谷氨酰对硝基苯胺和 双甘肽，定量所生成的对硝基苯胺而测定。该酶的单位定义为每1分钟生成 lpmol对硝基苯胺的酶量。
本发明的有益效果枯草芽孢杆菌SK11.004最初来源于发酵食品虾酱，是 无人体寄生性的高度安全的菌类，通过细菌进行液体发酵生产成本低。本发明 得到的枯草芽孢杆菌所产Y-谷氨酰转肽酶酶活可达4U/mL以上。其发酵产品无 毒，可以直接用于生产许多有价值的Y-谷氨酰类化合物，如L-Y-谷氨酰-L-多巴、 Y-谷氨酰牛磺酸、Y-谷氨酰色氨酸、谷胱甘肽、茶氨酸等。
具体实施例方式
实施例1
将枯草芽孢杆菌SK 11.004在下述条件下进行发酵
斜面培养培养基组分(g/L):蛋白胨IO，牛肉膏5，氯化钠5，琼脂20， pH7.0， 12rC灭菌20min，培养条件为培养温度37'C，培养时间14小时；
种子培养:培养基组分(g / L):葡萄糖20，酵母膏10，玉米桨10，MgSO4 '7H20 0.5， K2HP041， pH7.0, 12rC灭菌20min，培养条件为250 mL三角瓶装液 30mL，摇瓶转速200rpm,培养温度37。C，培养时间12小时； 一级种子培养基 按体积百分2.5 %接入30升二级种子罐(装液量18升)液体种子培养基中，其 中消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.5 (mL/L)，培养条件为搅拌速度200rpm， 控制通风量0 5小时为10L/min， 5 12小时为15 L/min;控制培养温度为 37°C，培养时间12小时；
发酵培养:培养基组分(g/L):蔗糖25，胰蛋白胨5，玉米桨15，MgSCV7H20 0.5， K2HP041，消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油2 (mL/L)， pH 7.2， 121。C灭菌 20min;种子培养基按体积百分2.5 %接入1吨发酵罐(装液量700升)液体发 酵培养基中，培养条件为搅拌速度200 rpm，控制通风量:0 8小时为12 L/min， 8 16小时为15L/min;控制培养温度为37"C，培养时间16小时，得到发酵液 的酶活为4.1U/mL;
实施例2
酶粉的制备
将制得的发酵液经离心(4000rpm)去菌体，制得发酵液上清液，再经截流 分子量为l万的超滤膜超滤除去盐和杂蛋白，后经20%酒精沉淀，离心得沉淀， 最后将沉淀进行冷冻干燥，即得Y-谷氨酰转肽酶酶粉，酶活达3.8U/mL。
权利要求
1、一种枯草芽孢杆菌生产γ-谷氨酰转肽酶的方法，其特征在于(1)对γ-谷氨酰转肽酶产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SK11.004进行斜面、种子、发酵三级培养；斜面培养培养基组分以g/L计蛋白胨8～10，牛肉膏3～5，氯化钠3～5，琼脂20，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min，培养条件为培养温度35～40℃，培养时间8～16小时；种子培养培养基组分以g/L计葡萄糖15～20，酵母膏10～15，玉米浆8～12，MgSO4·7H2O 0.3～0.5，K2HPO4 0.5～2，含消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油0.5mL/L，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20min；培养条件为250mL三角瓶装液30mL，摇瓶转速200rpm，培养温度37℃，培养时间8～12小时；一级种子培养基按体积百分2.5％接入装液量为18升液体种子培养基的30升二级种子罐中，培养条件为搅拌速度200rpm，控制通风量0～5小时为8～10L/min，5～12小时为12～15L/min；控制培养温度为35～40℃，培养时间8～12小时；发酵培养培养基组分以g/L计蔗糖15～35，胰蛋白胨5～8，玉米浆12～15，MgSO4·7H2O 0.3～0.5，K2HPO4 0.5～2，消泡剂聚氧乙烯氧丙烯甘三油2mL/L，pH 7.0～7.2，121℃灭菌20 min，调pH 7.0～7.2；种子培养基按体积百分2.5％接入装液量700升液体发酵培养基的1吨发酵罐中，培养条件为搅拌速度200rpm，控制通风量0～8小时为10～12L/min，8～16小时为14～16L/min；控制培养温度为35～40℃，培养时间14～16小时；(2)从发酵液中分离纯化得到γ-谷氨酰转肽酶酶粉；将制得的发酵液经离心或板框过滤去菌体，制得发酵液上清液，经超滤除去盐和杂蛋白，再经20％酒精沉淀，离心得沉淀，最后将沉淀进行冷冻干燥，即得γ-谷氨酰转肽酶酶粉。
全文摘要
一种枯草芽孢杆菌生产γ-谷氨酰转肽酶的方法，属于食品生物技术领域。本发明对γ-谷氨酰转肽酶产生菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SK11.004进行斜面、种子、发酵三级培养；从发酵液中分离纯化得到γ-谷氨酰转肽酶酶粉。本发明提供的利用枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)SK 11.004生产γ-谷氨酰转肽酶的方法，其育种工作量小，费用低，安全性能可靠，可以进行液体发酵生产，成本低，可用于大规模生产，本发明使用的枯草芽孢杆菌所产γ-谷氨酰转肽酶酶活可达4U/mL以上。其发酵产品无毒，可以直接用于生产许多有价值的γ-谷氨酰类化合物，如L-γ-谷氨酰-L-多巴、γ-谷氨酰牛磺酸、γ-谷氨酰色氨酸、谷胱甘肽、茶氨酸等。
文档编号C12N9/10GK101363014SQ200810021188
公开日2009年2月11日 申请日期2008年8月19日 优先权日2008年8月19日
发明者帅玉英, 涛 张, 波 江 申请人:江南大学