专利名称：：与水稻抗白背飞虱基因相连锁的分子标记及其开发方法
技术领域：
：本发明属于农业生物技术工程，特别涉及与水稻白背飞虱抗性基因相连锁的分子标记及其获得方法。
背景技术：
：水稻白背飞虱(Sogatellaftircifera,Horvdth)是我国和东南亚水稻产区的主要害虫之一，80年代以来，随着我国高产杂交稻技术的推广及可能与杂种优势有关的作物生理因素，白背飞虱已成为水稻主要害虫。据中国农业年鉴记载，在稻飞虱重发年份，受害面积超过我国水稻总面积的50%。1991年，我国发生的大范围稻飞虱为害造成近16亿公斤稻谷的损失，受害面积达2,933万hm2;2005年稻飞虱又大爆发，加之与稻纵巻叶螟的叠加效应，稻飞虱为害达2.6亿亩次以上。因此，对白背飞虱的防治已成为保障粮食生产的重要内容。大面积种植的主要水稻品种不带抗性基因，是白背飞虱爆发的内在原因，加上化学肥料的大量施用，茂盛生长的感虫水稻为白背飞虱的快速繁殖提供了充足的食源。长期以来，白背飞虱的防治主要是依靠施用化学杀虫剂。然而，农药杀虫剂的滥用，杀死了稻田中的稻飞虱天敌，反而诱发白背飞虱的再猖獗。另外，白背飞虱属大范围迁飞性害虫，每年的水稻生长季节，白背飞虱随春夏暖湿气流，由南往北逐代逐区迁入我国稻区。白背飞虱发生初期，若虫的虫体小，隐蔽性强，不易被农民发现，防治不及时使其得以大量繁殖，虫害便得以流行；虫害爆发的水稻成熟灌浆期，稻株长势旺盛，将杀虫剂施到稻株基部的操作非常困难，加上成虫有很好的移动性和较强的抗药性，结果屡屡造成危害和减产。水稻抗病虫育种实践证明，利用抗白背飞虱基因培育新品种是水稻白背飞虱综合防治中最为经济有效的方法。栽种的水稻品种即使只带有中等水平的抗性基因，也足以将白背飞虱的群体控制在造成危害的水平以下，不会导致白背飞虱大爆发、或实际危害及产量损失。另一方面，随着分子生物学的发展，使难以鉴定、易受环境影响的抗病虫性状采用分子辅助育种已成为可能，该技术不仅可在早代进行准确、稳定的选择，而且可克服分离单株的显隐性和纯杂合问题，从而加速育种进程，提高育种效率，但该技术的基础是必须拥有优良的目标基因及与之紧密连锁的分子标记。为实现上述任务，挖掘新的抗性基因，发展紧密连锁的新标记成为水稻抗白背飞虱分子育种的关键。最早对水稻白背飞虱抗性开展分子定位研究的是McCouch，首先应用TN1(台中本地1号)/IR36近等基因系将^&;jW定位到两个RFLP标记RG146和RG445之间，但由于该RFLP标记是多拷贝标记，而难以用作选择标记；此后，『6;/z2和『*/26w也先后被定位，但它们的遗传距离分别为25.6cM和21.2cM，实际应用仍有很大困难。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一种与水稻抗白背飞虱基因相连锁的分子标记及其开发方法，本发明所得的分子标记与白背飞虱抗性基因紧密连锁，能用于水稻白背飞虱抗性辅助选择育种。为了解决上述技术问题，本发明提供一种与水稻抗白背飞虱基因相连锁的分子标记，以水稻作为物种，该分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5'—3'，RM6917正向CTGGTTGTTTTCTGAACTCCGT反向GCATTAACCATAGCTGTCCACTC;AP4741正向AATCATGCTAGGTTATTACTCG反向GTGCAGAGATCATGCTTTTG。作为本发明的分子标记的改进RM6917定位于水稻第6染色体上；AP4741也定位于水稻第6染色体上。本发明还提供了上述分子标记的开发方法，包括以下步骤1)、以粳稻品种春江06作为抗虫基因供体亲本与作为感虫品种的台中本地1号进行杂交，从而获得作为杂交后代的抗虫单株；2)、用CTAB(十六烷基三乙基溴化铵，HexadecyltrimethylammoniumBromide)法提取水稻亲本幼苗及杂交后代幼苗基因组DNA;3)、采用SSR(简单重复序列，simplesequencerepeat)和/或STS(序列标签位点sequence-taggedsite)分子标记方法进行水稻白背飞虱抗性分子标记的筛选；4)、筛选出一个SSR分子标记RM6917和一个STS分子标记AP4741。与水稻抗白背飞虱基因相连锁的分子标记RM6917和AP4741,具体是用下述方法得到的1)、抗虫基因供体亲本来自中国水稻研究所的粳稻品种春江06(CJ06)，与感虫品种普通籼稻品种台中本地l号(TN1)进行杂交，抗、感虫单株是通过杂交、回交和自交，获得的抗、感虫近等基因系用于配组和基因定位。2)、用CTAB法提取水稻亲本幼苗及杂交后代幼苗基因组DNA。3)、采用SSR和STS分子标记方法进行水稻白背飞虱抗性分子标记的筛选；4)、筛选出一个SSR分子标记RM6917和一个STS分子标记AP4741,经连锁分析，发现这两个标记与水稻抗白背飞虱基因相连锁。采用SSR和STS分子标记进行筛选与水稻抗白背飞虱基因相连锁的分子标记的方法具体是(1)、SSR、STS引物在抗、感亲本以及它们的杂交后代间DNA多态性分析用SSR标记技术筛选，采用根据Temnykh在2000年发表的分布于水稻12条染色体上的SSR引物，引物委托上海申能博彩公司合成，在PTC-225PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为20ng/ul水稻基因组DNAlul,10xPCRBuffer2.0ul,25mMMgCl22.0ul，2mMdNTP2.0ul,10uM引物2.0ul,5U/ulTaqDNA聚合酶0.2ul，ddH20U.8ul，总体系20ul。反应程序95'C变性5分钟；94变性1分钟，55退火1分钟，72延伸1分钟，40个循环；72补齐10分钟；产物检测在含有0.5^ug/ulEB的4.0X的琼脂糖你叫电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。用STS标记技术筛选，首先对基因组已完成测序的日本晴(^://巧？.血&^&"gojp)和93-ll(http:〃www.rise.genomics.org.cn)的序列进行序列比对，根据日本晴和93-11序列比对的结果设计合适的引物用于CJ06和TN1的多态性筛选，引物委托上海申能博彩公司合成，在PTC-225PCR仪上进行PCR扩增，PCR反应体系为20ng/ul水稻基因组DNAlul,lOxPCRBuffer2.0ul，25mMMgCl22.0ul,2mMdNTP2.0ul,10uM引物2.0ul，5U/ulTaqDNA聚合酶0.2ul，ddH2011.8ul，总体系20ul。反应程序95。C变性5分钟；94。C变性1分钟，52'C退火1分钟，72'C延伸1分钟，40个循环；72°C10分钟；产物检测在含有0.5%ug/ulEB的4.0%的琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。(2)、分子标记的连锁分析CJ06和TN1双亲及其后代的白背飞虱抗性鉴定在田间进行，在田间自然诱发条件下，于分蘖早期分别从迁入虫数、蜜虫害发生密度和被害程度等方面对双亲及后代分离群体进行抗虫性鉴定；分别提取抗虫、感虫单株的总DNA，用与前面同样的反应体系、筛选获得的多态性引物及程序进行单株的PCR扩增，统计抗、感单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用MapnakerEXP3.0b计算标记与抗虫基因之间的遗传距离。本发明是用分子生物学方法以高抗白背飞虱水稻品种CJ06为材料，筛选和寻找新的、而且稳定存在与白背飞虱抗性基因紧密连锁的分子标记及其方法，用于水稻白背飞虱抗性辅助选择育种；由于研究所用的材料对白背飞虱表现高抗的特性，其对我国稻区的白背飞虱具有普遍的抗性。另外，根据所得分子标记也有助于水稻抗白背飞虱新基因的克隆。白背飞虱是危害水稻生产的主要虫害。本发明是利用分子标记方法得到两个新的与白背飞虱抗性基因紧密连锁的分子标记。利用这种方法，不仅克服了常规育种方法所需时间周期长等缺点，可以有目标地将抗虫基因在实验室内选择获得并有目的地进行多个抗性基因的聚合，从而培育出具有稳定抗性的水稻新品种。同时，也可利用这两个白背飞虱抗性基因分子标记，深入进行抗白背飞虱基因的克隆并对其进行结构和功能分析，这对于进一步了解水稻抗白背飞虱的分子遗传学机制有积极的意义。因此，本发明结果在水稻育种实践及抗虫理论研究上都有重要意义。其优点具体归纳如下(1)本发明的与白背飞虱抗性基因紧密连锁的分子标记，是在对水稻高抗白背飞虱的CJ06及其抗性稳定的杂交后代单株中获得的新标记，对水稻白背飞虱具有很强的抗性，而且稳定存在，可用于水稻白背飞虱抗性品种的鉴定和水稻抗虫后代的辅助选择育种。(2)本发明所用的材料高抗水稻白背飞虱，还有着较强的抗褐飞虱能力，具有普遍的抗虫特性。因此，根据所得的分子标记有望克隆到新的白背飞虱抗性基因。(3)为克隆水稻白背飞虱抗性基因、基因序列分析以及转抗白背飞虱基因水稻研究奠定了良好基础。下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一歩详细说明。图1是两个水稻品种及其后代基因组DNA的SSR分子标记RM6917筛选电泳谱带图2是两个水稻品种及其后代基因组DNA的STS分子标记AP4741筛选电泳谱带图3是检测分子标记RM6917与抗虫性连锁的分子标记的电泳谱带图4是检测分子标记AP4741与抗虫性连锁的分子标记的电泳谱带图5是SSR分子标记RM6917和STS分子标记AP4741与抗虫基因间的遗传距离示意对上述图1~5中符号分别作如下说明l代表抗虫亲本春江06;2代表感虫亲本TN1;3代表春江06/TNl的F1植株；4,5均代表春江06和TN1杂交后代的抗虫单株，此抗虫单株是通过杂交、回交的自交，从抗白背飞虱稳定的高世代株系中得到；即4和5是将春江06的抗虫基因借助标记辅助选择技术导入TN1而获得的抗虫材料；R代表带抗白背飞虱基因的杂交后代的抗虫单株；S代表不带抗白背飞虱基因的杂交后代的感虫单株。具体实施例方式实施例1、用SSR分子标记获得与水稻抗白背飞虱基因相连锁的分子标记RM6917:具体做法是抗虫基因供体亲本来自中国水稻研究所的粳稻品种春江06(CJ06)，与感虫品种普通籼稻品种台中本地1号(TN1)进行杂交，抗虫单株是通过杂交、回交和自交，获得的抗、感虫近等基因系用于配组和基因定位，从该群体后代中鉴定得到76株隐性个体用于连锁关系分析。以下所有步骤中，没有详细告知的均采用去离子水作为溶液。一、提取DNA1)、配制DNA提取缓冲液按顺序依次加1体积的DNA提取溶液(0.35Msorbitol;0.1MTris，pH8.2;0.005MEDTA;)，1体积的核裂解液(0.2MTris,pH7.5;0.05MEDTA;2MNaCl;0.055MCTAB;)和0.4体积的5%sarkosyl;最后加入亚硫酸氢钠，使之终浓度为0.02M。2)、对上述CJ06、TN1和76株抗虫隐性个体的水稻叶片分别进行如下处理①、称取0.1g的水稻叶片用液氮研磨成粉状，然后加入700nl的上述配制的DNA提取缓冲液，65。C水浴40分钟。再加700|al的氯仿:异戊醇(24:1的体积比)，并混匀。10,000rpm离心5分钟，将上清液转移到新的离心管中。②、在上述步骤①离心后所得的上清液中加2/3-1倍体积预冷的异丙醇，轻轻混匀至DNA沉淀。13,000rpm离心8分钟，倒出上清液。③、再用70。/。的已醇洗涤上述步骤②所得的DNA沉淀物。、将上述洗涤后的DNA凉干并溶于100piTE缓冲液或纯水中。、紫外分光光度法检测上述步骤④所得的DNA样品的浓度，0.7%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。二、SSR分析根据Temnykh在2000年发表的分布于水稻12条染色体上的SSR引物序列，委托上海申能博彩公司合成引物90对，具体如表l所示表1、合成的90对SSR引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>1、PCR扩增(1)、反应体系为水稻基因组DNA20ng/ullul，10xPCRBuffer2.0ul，25mMMgCl22.0ul，2mMdNTP2.0ul，10uM引物2.0ul，5U/ulTaqDNA聚合酶0.2ul，ddH2010.8ul，总体系20ul。(2)、反应程序95'C变性5分钟；94变性1分钟，55退火1分钟，72延伸1分钟，40个循环；72补齐10分钟。2、电泳检测取上述扩增产物20ul，用4.0%的琼脂糖凝胶(含有0.5^ug/ulEB)电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。我们首先利用90对SSR引物对CJ06和TN1进行多态性分析，其中有52对引物在双亲间表现出多态性。进一步用这52对引物对CJ06、TNI和其76株的杂交后代单株进行SSR分析，发现SSR引物RM6917在所有抗虫的杂交后代单株中均出现抗虫亲本CJ06—样的带型。说明SSR引物RM6917与水稻抗白背飞虱特性存在联系。RM6917引物序列为左翼5'-CTGGTTGTTTTCTGAACTCCGT，(SEQIDNO:1)，右翼5，-GCATTAACCATAGCTGTCCACTC-3，(SEQIDNO:2)，定位于水稻第6染色体上。三、SSR分子标记RM6917的连锁性鉴定CJ06和TN1双亲及其后代的白背飞虱抗性鉴定在田间进行，在田间自然诱发条件下，于分蘖早期分别从迁入虫数、蜜露分泌量、虫害发生密度和被害程度等方面对双亲及后代分离群体进行抗虫性鉴定；提取隐性的抗虫单株的总DNA，用与前面同样的反应体系及程序，用引物RM6917进行单株的PCR扩增，统计抗、感单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用MapnakerEXP3.0b计算标记与抗虫基因之间的遗传距离。以RM6917对杂交后代群体76个单株进行PCR扩增，扩增条件同上。结果显示，76个抗虫单株中有72单株的带型与抗虫亲本CJ06—样，有4株的带型同时带有双亲的带型，没发现与感虫亲本TN1带型一样的单株。这一实验结果表明SSR分子标记RM6917与水稻的白背飞虱抗性紧密连锁的，但在抗虫单株中仍有一定的交换，如图3所示，出现双亲带型的单株表明发生了交换。经计算，其重组率为2.6%，SSR分子标记与抗虫基因间的遗传距离为2.6cM。实施例2:用STS分子标记获得与水稻抗白背飞虱基因相连锁的分子标记AP4741植物材料同实施例l，具体做法如下-一、提取DNA1)、首先配制DNA提取缓冲液同实施例1。2)、对每种水稻叶片分别进行如下处理同实施例1。二、STS分析STS引物设计根据日本晴和93-11序列比对的结果设计合适的引物用于CJ06和TN1的多态性筛选，委托上海申能博彩公司合成设计的STS引物3对，具体如表2所示表2、合成的3对STS引物序列<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>1、PCR扩增(1)、反应体系为水稻基因组DNA20ng/ullul，10xPCRBuffer2.0ul，25mMMgCl22.0ul，2mMdNTP2.0ul，10uM引物2.0ul，5U/ulTaqDNA聚合酶0.2ul，ddH2010.8ul，总体系20ul。(2)、反应程序95'C变性5分钟；94变性1分钟，55退火1分钟，72延伸1分钟，40个循环；72补齐10分钟。2、电泳检测取上述扩增产物20ul，用4.0%的琼脂糖凝胶(含有0.5^ug/ulEB)电泳，紫外灯下观察并照相记录结果。我们利用3对STS引物对CJ06和TN1进行多态性分析，其中有1对引物在双亲间表现出多态性。进一步用这对引物对CJ06、TN1和其杂交后代单株进行STS分析，发现STS引物AP4741在所有抗虫的杂交后代单株中均带有抗虫亲本CJ06—样的带型。说明STS引物AP4741与水稻抗白背飞虱特性存在联系。AP4741引物序列为左翼5，-AATCATGCTAGGTTATTACTCG-3，(SEQIDNO:3)，右翼5，-GTGCAGAGATCATGCTTTTG-3，(SEQIDNO:4)，定位于水稻第6染色体上。三、STS分子标记AP4741的连锁性鉴定CJ06和TN1双亲及其后代的白背飞虱抗性鉴定在田间进行，在田间自然诱发条件下，于分蘖早期分别从迁入虫数、蜜露分泌量、虫害发生密度和被害程度等方面对双亲及后代分离群体进行抗虫性鉴定；提取隐性的抗虫单株的总DNA，用与前面同样的反应体系及程序，用引物AP4741进行单株的PCR扩增，统计抗、感单株标记带的出现频率和交换类型并计算交换值，用MapnakerEXP3.0b计算标记与抗虫基因之间的遗传距离。以AP4741对杂交后代群体76个单株进行PCR扩增，扩增条件同上。结果显示，76个抗虫单株中有71个单株的带型与抗虫亲本CJ06—样，有5个单株的带型同时带有双亲的带型，没发现与感虫亲本TN1带型一样的单株。这一实验结果表明STS分子标记AP4741与水稻的白背飞虱抗性紧密连锁的，但在抗虫单株中仍有一定的交换，如图3示，出现双亲带型的单株表明发生了交换。经计算，其重组率为3.3%,STS分子标记与抗虫基因间的遗传距离为3.3cM。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表SEQIDNO:1ctggttgttttctgaactccgt22SEQIDNO:2gcattaaccatagctgtccaetc23SEQIDNO:3aatcatgctaggttattacteg22SEQIDNO:4gtgcagagatcatgcttttg20权利要求1.一种与水稻抗白背飞虱基因相连锁的分子标记，以水稻作为物种，其特征是所述分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′，RM6917正向CTGGTTGTTTTCTGAACTCCGT反向GCATTAACCATAGCTGTCCACTC；AP4741正向AATCATGCTAGGTTATTACTCG反向GTGCAGAGATCATGCTTTTG。2、根据权利要求l所述的与水稻抗白背飞虱基因相连锁的分子标记，其特征是所述RM6917定位于水稻第6染色体上；所述AP4741也定位于水稻第6染色体上。3、如权利要求1或2所述的分子标记的开发方法，其特征是包括以下步骤1)、以粳稻品种春江06作为抗虫基因供体亲本与作为感虫品种的台中本地1号进行杂交，从而获得作为杂交后代的抗虫单株；2)、用CTAB法提取水稻亲本幼苗及杂交后代幼苗基因组DNA;3)、采用SSR和/或STS分子标记方法进行水稻白背飞虱抗性分子标记的筛选；4)、筛选出一个SSR分子标记RM6917和一个STS分子标记AP4741。全文摘要本发明公开了一种与水稻抗白背飞虱基因相连锁的分子标记，以水稻作为物种，分子标记引物选自下列引物对，其中的核苷酸序列为5′→3′；RM6917正向CTGGTTGTTTTCTGAACTCCGT反向GCATTAACCATAGCTGTCCACTC；AP4741正向AATCATGCTAGGTTATTACTCG反向GTGCAGAGATCATGCTTTTG。本发明还同时提供了上述分子标记的开发方法。本发明的分子标记与白背飞虱抗性基因紧密连锁，能用于水稻白背飞虱抗性辅助选择育种。文档编号C12N15/29GK101294161SQ200810061330公开日2008年10月29日申请日期2008年4月22日优先权日2008年4月22日发明者坚刘,张光恒,曾大力,李家洋,江胡,董国军,郭龙彪,前钱申请人:中国水稻研究所