专利名称：克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽基因及其所编码的抗菌肽与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种阿肽西啶抗菌肽基因及其所编码的抗菌多肽与应用，尤其涉及一种 克氏原鳌虾阿肽西啶(astacidin)抗菌肽基因及其所编码的抗菌多肽与所述基因在制 备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用；属基因工程技术领域。
背景技术：
克氏原鳌虾(/!roca/^arasc7a7^7),俗称淡水小龙虾，是我国重要的水产养殖品 种。小龙虾味道鲜美，磷、钙、铁等元素含量高，蛋白含量高，而脂肪含量低，是一种 营养价值很高的经济型水产养殖品种。而且小龙虾的虾壳的提取物在工业，农业，医药 和化工业中有着广泛的应用价值。因此，小龙虾的疾病预防和治疗方面的研究格外重要。 小龙虾对环境的适应能力较强，对各种流行性的疾病有一定的抵抗能力，鉴于此研究小 龙虫下的抗菌肽对于我们了解虾类的抗病机制有着重要的作用。
虾类等节肢动物的免疫防御主要依赖于血细胞的活动，包括酚氧化酶原系统的激 活，凝集系统的起始，和抗菌肽的合成。
Lee So Young等(JBC, 2003)报道淡水小龙虹(,a"/kst3c"s 7e;7J'iAsci^iAS)血 蓝蛋白在酸性条件下水解C-端产生的抗菌肽astacidinl,具有广谱的抗菌活性，能抑 制革兰氏阳性菌和阴性菌的生长，在小龙虾体内注入脂多糖或者肽聚糖能加速血蓝蛋白 分解为astacidinl; Pikul Jiravanichpaisal等(Developmental and Comparative Immunology, 2007)报道在淡水小龙虫下(v°. 7e/7/wsc"7i;s)的血细胞和造血组织中的抗菌 肽astacidin2和3和不同的甲壳肽(crustins)在小龙虾免疫反应中的作用。
诸多研究表明，在虾类等节肢动物中存在多种可以抵抗外界病原微生物的蛋白或肽 类，如对虾素，甲壳肽(crustins),含单一乳清酸性蛋白结构域的抗菌肽基因(SWD)和 抗脂多糖因子(ALF)等。但是在相关的报导中，未见有克氏原鳌虾的阿肽西啶抗菌肽基 因的报道。尽管国外在小龙虾(尸.7朋j'"sc"7"s)中也发现了类似的基因，但至今国内外 没有克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽基因及其重组表达和功能研究的报道。
发明内容
针对目前研究状况及其不足，本发明要解决的问题是提供一种克氏原鳌虾阿肽西啶 (astacidin)抗菌肽基因及其所编码的抗菌多肽与所述基因在制备具有抗菌活性的重 组蛋白中的应用。
本发明从克氏原鳌虾中克隆得到了阿肽西啶基因，并对其进行可性质、基因表达和 定位以及重组表达等方面的研宄，获得了有广谱抗菌活性的重组阿肽西啶(astacidin)。
本发明所述克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示， 其中所示信息为
(a)序列特征 *长度893碱基对
*类型核酸 *链型双链 *拓扑结构线性(C)假设否
(d) 反义否
(e) 最初来源克氏原鳌虫下(户roca^ ariAs c7arh7)
(f) 序列描述SEQ ID NO. 1
8Cttgtgg3gcgactgactgctgaagcacaattgttacaagcccc犯c犯ctctatacca60
ccaccatgcgtcttctccatctcctgctgagtgttgccctcgttgctcttatggccgccg120
tcccatcccaggcgtcc幼tggttaccgtcccgcctaccgtcctgcctaccgtcctagct180
accgtccaggcaagtaagagcgtg犯gt幼cactcccggacggcttcccttccctcttgg240
ctggtcctct3CC￡ltC￡lCC￡lgcceicacctccgcctccagcC3C3CCtCC3tctacaacag300
gcatgcgataatcggtattc3Ctatct3ca犯tgttgatcgctatcatcc360
gagc幼gtaggccgacgtccgccgatatgtcagccgtccgagaaaccaaggtggtcaggc420
gtatggctgctgacccctgctcacgtctcccgttgatgtcctcctttgactgacttcagt480
taactgatctgaactgacctcgctaattgacttggttactactttgtcttcattccttct540
3tgElg卿ggttCElCCtgCCcatcatcattattttceitgacgttgagaaeiggc鄉tgta600
ctaggcttgtgtaaatctgg3gtCtt犯t3atttgaaacctttgaacctctccgtacaca660
tcaaaactgttcacatcttttgtgttttggtcgtta犯attt犯atttagcttaattttg720
tgtccacatttgaagacctttgctgtt幼gggcaatatttt幼ataattt780
ttccacaattt3tgagt犯atgca犯ggcgtcctctcctgcactgtctta840
agtccttctt gtgtcaataa agagcattat atcatggcaa aaaaaaaaaa aaa 893。
本发明所述克氏原鳌虾阿肽西啶(astacidin)抗菌肽基因编码的抗菌肽，其氨基酸 序列如SEQ ID N0.2所示，其中所示信息为
(a) 序列特征
*长度43氨基酸 *类型氨基酸
*链型单链
*拓扑结构线性
(b) 分子类型蛋白质
(c) 序列描述SEQ ID NO. 2
Met Arg Leu Leu His Leu Leu Leu Ser Val Ala Leu Val Ala Leu 5 10 15
Met Ala Ala Val Pro Ser Gin Ala Ser Asn Gly Tyr Arg Pro Ala 20 25 30
Tyr Arg Pro Ala Tyr Arg Pro Ser Tyr Arg Pro Gly Lys 35 40
本发明所述SEQ IDN0.2所示氨基酸序列的变异体，其特征是它编码具有少于 8个氨基酸改变的同源变异蛋白，而且氨基酸改变是保守性氨基酸改变。 本发明所述克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽基因cDNA的克隆方法是采用一步法或RNA kit从克氏原鳌虾中提取总RNA,或者用mRNA kit分离提取niRNA; 然后利用总RNA或mRNA反转录合成cDNA;
其中根据克氏原鳌虾astacidin抗菌肽基因的保守序列设计的引物为 正向引物Fl 5' CTC GTT GCT CTT ATG GCC GCC G 3, 反向引物Rl 5' CAT TTG TAG ATA GTG AAT ACC G 3，
PCR反应条件为首先94。C变性2分钟，然后进入下列循环94。C30秒，53。C45秒， 72。C45秒，共进行30个循环，最后72。C延伸10分钟。
纯化通过链式聚合酶反应(PCR)扩增获得DNA片段；
取上述纯化产物克隆到pMD 18-T载体(TaKaRa公司产品)，转化DH5cc细胞(常用载体 宿主细胞)，平板培养
提取并纯化质粒，扩增质粒并测序；
再经过3'和5'末端快速扩增，将3'和5'端序列拼接，即得SEQ ID NO. 1所示 克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽基因全长核苷酸序列。
本发明所述克氏原鳌虾阿肽西啶(astacidin)抗菌肽基因在制备具有抗菌活性的重 组蛋白中的应用。
其中，所述应用的方法是通过基因重组技术使所述基因在大肠杆菌、酵母或昆虫核 型多角体病毒中进行表达，获得具有抗菌活性的重组蛋白。
例如将获得的克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽基因抗菌肽基因克隆到PGEX4T-1 (Novagen公司)表达载体，转化大肠杆菌BL21细胞，进行诱导表达，获得具有抗菌 活性的重组蛋白(即克氏原鳌卧阿肽西啶抗菌肽基因编码的抗菌肽)。
所述抗菌活性的重组蛋白纯化后进行抑菌实验的结果表明重组的克氏原鳌虾阿肽 西啶抗菌肽基因表达的多肽具有抗革蓝氏阴性菌和阳性菌的活性(见图2)。
进一步的，利用本发明的方法通过现有基因工程方法修饰克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌
肽基因还可用于其他研究和生产；例如可用于抗菌的饲料添加剂、食品保存、动植物
基因转化和药物开发等。
图1重组克氏原鳌虾阿肽西啶(astacidin)抗菌肽纯化后的电泳图 其中1诱导后细胞破碎后的上清液电泳结果，2诱导后细胞破碎后的沉淀电泳结 果，3纯化的克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽电泳结果，M蛋白标准分子量marker。 图2重组的克氏原鳌虾阿肽西啶(astacidin)抗菌肽的抑菌实验 其中A为不同浓度的抗菌肽对巨大芽孢杆菌的抑菌效果； B为不同浓度的抗菌肽对鳗弧菌的抑菌效果。
具体实施例方式
实施例1:克氏原鳌虾阿肽西啶(astacidin)抗菌肽cDNA的克隆
1) 总RNA的提取采用现有技术一步法提取总RNA。
2) cDNA第一链合成4微升总RNA，加1微升SmartF和1微升OligoanchorR, 72。C 反应5分钟，后加5倍Buffer 4微升，dNTP 1.25微升，RNA酶抑制剂0.625微升，1 微升固LV逆转录酶，无RNase的灭菌水12.875微升42。C反应60分钟，70°C 10分钟 终止反应。3) PCR反应链式聚合酶反应(PCR)试剂与条件: 首先将下列试剂混在一起-
lOxTaq DNA聚合酶缓冲液5微升(pi)
,模板cDNA 1^1
'正向引物(lOmM〉 1^1
>反向引物(lOmM) l^il ，脱氧核苷酸混合物(dNTP) 4^1
'Taq DNA聚合酶 0. 25pl
'灭菌水_ 37. 75ul
'总体积 50nl
根据克氏原鳌虾阿肽西啶(astacidin)抗菌肽的保守序列设计的引物为 正向引物Fl 5' CTC GTT GCT CTT ATG GCC GCC G 3， 反向引物Rl 5' CAT TTG TAG ATA GTG AAT ACC G 3' PCR反应条件为首先94。C变性2分钟，然后进入下列循环94。C30秒，53。C 45 秒，72°C 45秒，共进行35个循环，最后72。C延伸IO分钟。
4) 反应产物纯化利用德国奎因(QIAGEN)公司产品QIAquick Gel Extraction Kit, 操作步骤按产品说明书进行。
5) 克氏原鳌虾阿肽西啶(astacidin)抗菌肽cDNA克隆取纯化产物3微升，连接 于pMD 18-T载体(TaKaRa公司产品)。转化到大肠杆菌DH5a菌株，在含有氨苄青霉素
(100微克/毫升)、5-溴-4-氯-3-吗|哚-p-D-半乳糖苷(X-gal 0.2微克/毫升)和异丙 基硫代半乳糖苷(IPTG 0.1摩尔/毫升)的平板生长过夜，挑取3个白斑，在LB液体 培养基(5毫升，含100微克/毫升安苄青霉素)中培养过夜。
6) 质粒纯化收取过夜培养菌液2毫升，离心(6000转/分，3分钟)收集细胞。 用微量DNA纯化试剂盒(Wizard ; 7"s SV Minipr印s DNA Purification System,美国 普洛麦格Promega公司)纯化质粒，纯化步骤按说明书进行。
7) 序列测定与同源检索取纯化质粒4微升，用载体引物T7进行全自动测序(本 工作在上海生工公司完成)。将所得序列与基因库序列比较。
8) 克氏原鳌虾阿肽西啶(astacidin)抗菌肽cDNA 3'端快速扩增 根据得到的抗菌肽基因片段，正向引物Fl进行cDNA 3'端快速扩增，操作步骤按
宝生物3' RACE试剂盒说明书进行。
取血细胞总RNA约20ng,其他试剂的调制和反应条件按说明书进行。用特异性引 物F3与3，接头进行3'端PCR扩增，采用56'C退火，其余与上述的PCR扩增程序相 同，对所得产物按前述方法进行克隆、验证和测序。
9) 克氏原鳌虾阿肽西啶(astacidin)抗菌肽cDNA 5'端克隆' 利用上述获得的总RNA,按CLONTECH公司(美国)SMART PCR cDNA文库构建试剂
盒说明书进行进行第一链cDNA合成。 '
以上述cDNA为模板，以试剂盒提供的5， PCR引物和反向引物R1为引物进行PCR
扩增，获得克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽cDNA的5'序列。
将3'和5'端序列拼接，即获得SEQ ID NO. 1所示克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽cDNA基因全长核苷酸序列。
实施例2:阿肽西啶(astacidin)重组表达载体构建、表达与抑菌功能测定
(1) 根据克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽的序列和表达载体pGEX4T-1 (Novagen公司) 的克隆位点，设计引物
ExF: TACTCAGAATTCTCCAATGGTTACCGTCCCG (下划线为￡boR I位点) ExR: TACTCACTCGAGTTACTTGCCTGGACGGTA (下划线为J力ol位点) 本发明选择了 PGEX4T-1克隆位点的￡boR I和7力o I酶切位点，因此，设计引物 时在上游引物引入了化oR I酶切位点，下游引物上引入了/力o I酶切位点。
(2) 基因扩增、克隆与重组质粒筛选
以pMD-18T-阿肽西啶为模板，用上述引物进行PCR反应，扩增条件为94'C， 2min 预变性；94°C， 30 s， 55'C， 45 s， 72'C, 45 s, 35个循环；72'C延伸10 min。 2%的琼脂糖凝胶电泳PCR产物检测。 将PCR产物用作制备电泳，以UNIQ-5 Column DNA Gel Extraction Kit(上海生工 产品)回收、纯化PCR产物，经过/5bdU和勅o1内切酶酶切，同样表达载体pGEX4T-l 经过￡coR I和// o I内切酶酶切，暴露出多克隆位点两端的J力o I和fcoR I内切酶位 点。然后，将酶切后的扩增产物与表达载体用T4 DNA连接酶连接，转化DH5ci感受态 细胞，LB+Amp平板PCR筛选阳性克隆。挑取PCR筛到的菌落，37'C振荡扩增培养并抽 提质粒，fcoR I和J力o I双酶切与测序验证后，即为重组表达质粒pGEX4T-l-阿肽西啶。 接转化￡ co7/表达菌株BL21感受态细胞，涂布LB+Amp平板，37'C倒置过夜培养。
(3) 筛选表达菌株
从上述LB+Amp平板上挑取8个单克隆菌落，2 ml LB+Amp液体培养基37'C振荡过 夜培养，次日，取20 ul过夜培养液加入到2 ml LB+Amp液体培养基中转培养，37°C 振荡培养3 h,至ODeo。在0. 5~0. 7之间，然后加入IPTG至终浓度为1 raM,继续37°C 振荡培养诱导表达4 h。诱导前，随机从一个样品中取出0.5 ml菌液，电泳检测时作 未诱导对照。
表达完后，各取0. 5 ml菌液，6000 r/min离心3 min收集细胞，包括未诱导的样 品，重悬于100 ul去离子水中，以此为电泳样品作12.5%的SDS-PGAE。根据电泳结 果，鉴定表达菌株。
(5)重组克氏原鳌虾阿肽西啶(astacidin)抗菌肽表达与纯化
挑取表达菌株单克隆在LB+Amp液体培养基中37。C过夜振荡培养，次日，按照体积 比1 : 100加入到100 ml LB+Arap培养基中转培养，37°C振荡培养3 h后，再加入IPTG 至终浓度为0.5 ramol，再37°C振荡诱导培养4 h。诱导前取出0. 5 ml的菌液，作为诱 导前对照样品。诱导培养完后，菌液在合适的离心管中6000 r/min离心10 min收集 细胞，细胞重悬于5 ml预冷的1XPBS,加入50 ul20W的Triton X-100，充分混匀 后冰浴30 min。超声波破碎细胞，超声循环为超声1 s;间隔1 s;全程40 s。重复 4次，每次间隙时将菌液在冰浴中混匀，避免局部温度太高，使蛋白质变tt。最后，将 破碎后的菌液10 000 r/min离心20 min,收集上清液和沉淀，上清液和沉淀分别留样，备用。
诱导后细胞破碎后的上清液以及沉淀和纯化的克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽的电泳结果见图1。
(6)重组蛋白抑菌活性测定
以管碟法检测抑菌活性，方法如下
固体平板制备固体平板的下层胶为一层0.5 lcm厚度的1.5%的琼脂，上层胶 为0.5~lcm厚度的含有5pL对数生长期细菌的8 mL固体低营养细菌培养基 (l%tryptone， 0.5%NaCl， 1.5%Agar， pH7.5)。水平静置，冷却，备用。
在上述固体平板上设计放置多个经过灭菌的牛津小杯(如图2),在平板的底面做 好标记，分别取50pL待测样品(含克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽)，加入相对应的牛津小 杯中，28°C正面静置培养过夜，观察抑菌效果，测量抑菌圈直径。
实验结果本发明所述的重组的克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽对鳗弧菌或巨大芽孢杆 菌有明显的抑菌效果(见图2)。<110>山东大学
〈120〉克氏原鳌虾阿肽西啶(astacidin)抗菌肽基因及其编码的抗菌肽与应用
〈141〉 2008-10-30
<160> 6
〈210〉 1
〈211> 893
〈212〉 c腿
〈213〉克氏原鳌虫下(iRroca/z^ar〃s c7arh7) <221〉克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽基因 〈222〉 (1)…(893) <400〉 1
acttgtggagCg3Ctg3Ctgctgaagcacaattgttacaagcccc幼c犯ctctatacca60
ccaccatgcgtcttctccatctcctgctgagtgttgccctcgttgctcttatggccgccg120
tcccatcccaggcgtcc犯tggttaccgtcccgcctaccgtcctgcctaccgtcctagct180
accgtccaggcaagtaagagcgtgaagtaacactcccggeicggcttcccttccctcttgg240
ctggtcctcteicceitcaccelgccacacctccgcctccagcC3C3CCtCC3tctacaacag300
gcatgcgataatcggtattcactatctacaaeitgttgatcgctatcatcc360
gagc犯gtaggccgacgtccgccgatatgtcagccgtccgaga幼ccaaggtggtc郷c420
gtatggctgctgacccctgctcacgtctcccgttgatgtcctcctttgactgacttcagt480
taactgatctg幼ctgacctcgctaattgetcttggttactactttgtcttcattccttct540
atg卿gaggttcacctgcccatcatcattattttcatgacgttgagaaaggcaggtgta600
ct鄉cttgtgt3犯tCtggagtcttaat33tttga犯cctttgaacctctccgtacaca660
tcaa幼ctgttcacatcttttgtgttttggtCgtt3犯3tttaaatttagcttaattttg720
tgtccacatttgaagacctttgctgttaagggcaatatttt犯ataattt780
ttccacaatttatgagtaaatgcaaaggcgtcctctcctgcactgtctta840
agtccttcttgtgtcaataaagagcattatatcatggcaaaa3893
〈210〉 2 <211> 43 <212〉 PRT
〈221〉克氏原鳌虫下阿肽西啶抗菌肽基因编码的抗菌肽 <222> (1)…(43) <400> 2
Met Arg Leu Leu His Leu Leu Leu Ser Val Ala Leu Val Ala Leu 5 10 15
Met Ala Ala Val Pro Ser Gin Ala Ser Asn Gly Tyr Arg Pro Ala 20 25 30Tyr Arg Pro Ala Tyr Arg Pro Ser Tyr Arg Pro Gly Lys 35 40
<210>3
<211〉22
<212〉DNA
<213>人工序列
〈221〉 Fl (正向引物)
〈400〉3
ctcgttgctc ttatggccgc eg 22
<210〉4
<211>22
〈212〉DNA
<213>人工序列
<221> Rl (反向引物)
<400〉4
catttgtaga tagtgaatac eg 22
<210〉5
<211〉31
<212〉DNA
<213>人工序列
<221> ExF (上游引物)
<400〉5
tactcagaat tctccaatgg ttaccgtccc g 31
<210〉6
<211〉30
<212>腿
〈213〉人工序列
<221> ExR (下游引物)
<400〉6
tactcactcg agttacttgc ctggacggta 30
权利要求
1. 一种克氏原鳌虾阿肽西啶(astacidin)抗菌肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中所示信息为(a)序列特征*长度893碱基对*类型核酸*链型双链*拓扑结构线性(b)分子类型cDNA(c)假设否(d)反义否(e)最初来源克氏原鳌虾(Procambarus clarkii)(f)序列描述SEQ ID NO.1acttgtggag cgactgactg ctgaagcaca attgttacaa gccccaacaa ctctatacca 60ccaccatgcg tcttctccat ctcctgctga gtgttgccct cgttgctctt atggccgccg 120tcccatccca ggcgtccaat ggttaccgtc ccgcctaccg tcctgcctac cgtcctagct 180accgtccagg caagtaagag cgtgaagtaa cactcccgga cggcttccct tccctcttgg 240ctggtcctct accatcacca gccacacctc cgcctccagc cacacctcca tctacaacag 300gcatgcgata atcggtattc actatctaca aatgttgatc gctatcatcc agaggttcaa 360gagcaagtag gccgacgtcc gccgatatgt cagccgtccg agaaaccaag gtggtcaggc 420gtatggctgc tgacccctgc tcacgtctcc cgttgatgtc ctcctttgac tgacttcagt 480taactgatct gaactgacct cgctaattga cttggttact actttgtctt cattccttct 540atgagagagg ttcacctgcc catcatcatt attttcatga cgttgagaaa ggcaggtgta 600ctaggcttgt gtaaatctgg agtcttaata atttgaaacc tttgaacctc tccgtacaca 660tcaaaactgt tcacatcttt tgtgttttgg tcgttaaaat ttaaatttag cttaattttg 720tgtccacatt tgaagacctt tgctgttaag aaataattta ggcaatattt taaataattt 780ccataataaa ttccacaatt tatgagtaaa tgcaaaggcg tcctctcctg cactgtctta 840agtccttctt gtgtcaataa agagcattat atcatggcaa aaaaaaaaaa aaa893。
2.权利要求l所述克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽基因编码的抗菌肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示，其中所示信息为(a) 序列特征*长度43氨基酸*类型氨基酸*链型单链*拓扑结构线性(b) 分子类型蛋白质 '(c) 序列描述SEQ ID NO. 2Met Arg Leu Leu His Leu Leu Leu Ser Val Ala Leu Val Ala Leu 5 10 15<formula>formula see original document page 3</formula>
3. 权利要求2所述SEQ ID NO. 2所示氨基酸序列的变异体，其特征是它编码具有少于8个氨基酸改变的同源变异蛋白，而且氨基酸改变是保守性氨基酸改变。
4. 权利要求1所述克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用。
5. 如权利要求4所述克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用，其方法是通过基因重组技术使所述基因在大肠杆菌、酵母或昆虫核型多角体病毒中进行表达，获得具有抗菌活性的重组蛋白。
全文摘要
本发明公开了一种克氏原鳌虾阿肽西啶(astacidin)的抗菌肽基因及其编码的抗菌肽，还公开了所述克氏原鳌虾阿肽西啶抗菌肽基因在制备具有抗菌活性的重组蛋白中的应用。本发明所述基因表达获得的重组克氏原鳌虾阿肽西啶的抗菌肽可用于抗菌饲料添加剂、食品保存、动植物基因转化和药物开发等领域。
文档编号C12N15/81GK101503687SQ20081015964
公开日2009年8月12日 申请日期2008年11月11日 优先权日2008年11月11日
发明者王金星, 赵小凡 申请人:山东大学