专利名称：一种发酵生产柔红霉素的培养基及方法
技术领域：
本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种发酵法生产柔红霉素的培养基及方法。
背景技术：
蒽环类抗生素(Anthracyclines)是一类重要的抗肿瘤药物，它们均由一个基于 7，8，9，10-四氢-5，12-萘醌框架结构的葱环酮的发色团(糖普配基，aglycon)通过糖苷键 和一种或几种不同的糖连接而成，蒽环类抗生素的结构变化主要有(l)蒽环上的配基(如 轻基的数量和位置、甲氧基和羰基的立体化学结构等)不同；(2)糖的数量、种类和排列顺 序差异；(3)糖苷键的位置和立体化学结构不同等。绝大多数蒽环类抗生素具有很强的骨 髓抑制和心脏毒性不能应用于临床。柔红霉素、阿霉素型蒽环类抗生素最具临床应用价值， 包括柔红霉素、阿霉素、表阿霉素(Iurbicin)、去甲基柔红霉素(Idarubicin)、阿克拉霉素 (Aclacinomycin)以及洋红霉素(Carminomycin)等。其中最有代表性的柔红霉素和阿霉素 的化学结构之间的主要区别在于阿霉素C-14位上有一个羟基。 柔红霉素(Da皿orubicin， dau謹ycin， DNR)禾口阿霉素(Doxorubicin, adriamycin，DXR)是重要的蒽环类抗生素，主要用于多种实体瘤和急性白血病的治疗，是临 床上抗肿瘤的一线药物。柔红霉素又名正定霉素、红比霉素(Rubidomycin)、柔毛霉素、红卫 霉素和变红霉素(Rubomycin)等，自从1963年Di Marco发现柔红霉素以来，人们对以柔红 霉素为代表的蒽环类抗生素及其产生菌进行了广泛深入的研究。 柔红霉素是一些链霉菌的次级代谢产物，例如波赛链霉菌(S. peucetius)，天蓝 淡红链霉菌(S. coeruleorubidus) ， S. insignis ATCC 31913，灰色链霉菌(S. griseus) IMETJA3933、 JA 5142和JA 5570，链霉菌(S. sp.)C5等。 柔红霉素作为老牌的抗生素类药物，目前国内外研究者更多地将注意力集中到 了如何筛选出优良的菌种，或不断改进发酵和提取工艺，反而依然使用传统培养基配方，
传统培养基组成配比为玉米淀粉麸皮麸质粉碳酸钙磷酸二氢钾硫酸铵= 7 : i : o. 5 : o. 8 : o. oi : o. i (w/w/w/w/w/w)，(上海医药工业研究院优秀博士论文，
柔红霉素C-14羟化酶基因的克隆、表达和应用研究，吴大治，2003年7月)，由于这种传统
的培养基有麸质粉的存在，发酵过程中泡沫严重，即使选用最好的消泡剂也见效甚微，极易 造成逃液，进而造成染菌，给生产带来严重损失。
发明内容
为了解决柔红霉素生产中传统培养基的不足，本发明的发明人提供了一种新的发 酵生产柔红霉素的培养基配方及发酵生产方法。 为了实现本发明的目的，发明人创造性地提出，用血浆蛋白粉代替麸质粉，结果发 酵过程中几乎没有泡沫产生，后处理萃取过程乳化现象消失，产品中难以精制去除的杂质 13- 二氢柔红霉酮也容易去除，精制步骤由4步减少为3步，精制收率提高8%，产量提高1倍。 上述血浆蛋白粉包括猪血浆蛋白粉、低灰份猪血浆蛋白粉、羊血桨蛋白粉、牛血浆 蛋白粉和血红蛋白粉等。 发明人在研究培养基配方过程中意外地发现，添加硅酸锂也能提高发酵效价。
上述经过改进后的培养基中还可以加入消泡剂，优选消泡剂DF104。
经过大量实验研究，本发明最终制备出如下培养基，其配方为 麸皮玉米淀粉血浆蛋白粉磷酸二氢钾硫酸铵碳酸钙硅酸锂消泡 剤dfio4二i : 7 : (io 0.05) : o. oi : o. i : o. 8 : (i o.oo5) : o. 08 (w/w/w/w/ w/w/w/w)。 更优选地，麸皮玉米淀粉血浆蛋白粉磷酸二氢钾硫酸铵碳酸钙硅酸 锂消泡剂DFi04二i : 7 : (i o.i) : o. oi : o. i : o. 8 : (i o.oi) : o.08(w/
w/w/w/w/w/w/w)按上述配料比用常规方法即可制备所需的发酵培养基。 本发明还提供了一种发酵生产柔红霉素的方法，该方法采用了上述改进后的培养
基，发酵选用的菌种为波赛链霉菌、天蓝淡红链霉菌或灰色链霉菌，发酵工艺采用常规的工
艺。通过实施例1 14可以看出，通过本发明提供的方法，柔红霉素的最终发酵效价最高 可达2. 47g/L，相比于现有技术的发酵效价，具有显著的进步。
具体实施例方式
本发明的技术内容不限于以下实施例，与以下具体实施方式
等同的技术手段同样
包括在本发明的范围之内。 实施例1 菌种波赛链霉菌 向1500L发酵罐中加入9. 10kg麸皮、63. 20kg玉米淀粉、90kg猪血浆蛋白粉、 0. 091kg磷酸二氢钾、0. 91kg硫酸铵、7. 21kg碳酸f丐和400L纯化水搅拌溶解，待固体完 全溶解混匀后，加入0. 72kg消泡剂DF104，加入纯水定至总体积800L，密封好发酵罐口 。 121°C -123t:灭菌30min。移种后，调节发酵罐压縮空气流量60. 0m3/h，转速80-200rpm，罐 压0. 04-0. 06MPa，温度31°C ，标定溶氧100 % ，发酵过程控制溶氧不低于15 % ，培养120h，培 养过程中，根据溶解氧的降低，适当提高转速和通气量，保持溶解氧在15%以上水平。
最终发酵效价2. 01g/L。
实施例2
菌种波赛链霉菌 向1500L发酵罐中加入9. 10kg麸皮、63. 20kg玉米淀粉、90kg猪血浆蛋白粉、 0. 091kg磷酸二氢钾、0. 91kg硫酸铵、7. 21kg碳酸钙和400L纯化水搅拌溶解，待固体完全 溶解混匀后，加入0. 90kg硅酸锂，加入0. 73kg消泡剂DF104，加入纯水定至总体积800L， 密封好发酵罐口。 121°C-123°0灭菌3()111111。移种后，调节发酵罐压縮空气流量61m3/h，转 速80-200rpm，罐压0. 04-0. 06MPa，温度31°C ，标定溶氧100 % ，发酵过程控制溶氧不低于 15 % ，培养120h，培养过程中，根据溶解氧的降低，适当提高转速和通气量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最终发酵效价2. 21g/L。
4
实施例3 菌种天蓝淡红链霉菌 向1500L发酵罐中加入9. 02kg麸皮、63. 11kg玉米淀粉、9. 02kg猪血浆蛋白粉、 0. 09kg磷酸二氢钾、0. 91kg硫酸铵、7. 11kg碳酸钙和400L纯化水搅拌溶解，待固体完全 溶解混匀后，加入0. 90kg硅酸锂，加入0. 73kg消泡剂DF104,加入纯水定至总体积800L， 密封好发酵罐口。 121°C-123°0灭菌30!11111。移种后，调节发酵罐压縮空气流量61mVh，转 速80-200rpm，罐压0. 04-0. 06MPa，温度31°C ，标定溶氧100 % ，发酵过程控制溶氧不低于 15 % ，培养120h，培养过程中，根据溶解氧的降低，适当提高转速和通气量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最终发酵效价2. 35g/L。 实施例4 菌种波赛链霉菌 向1500L发酵罐中加入9. 05kg麸皮、63. 01kg玉米淀粉、0. 91kg猪血浆蛋白粉、 0. 091kg磷酸二氢钾、0. 9kg硫酸铵、7. 01kg碳酸钙和400L纯化水搅拌溶解，待固体完全 溶解混匀后，加入0. 90kg硅酸锂，加入0. 73kg消泡剂DF104,加入纯水定至总体积800L， 密封好发酵罐口。 121°C-123°0灭菌30!11111。移种后，调节发酵罐压縮空气流量61mVh，转 速80-200rpm，罐压0. 04-0. 06MPa，温度31°C ，标定溶氧100 % ，发酵过程控制溶氧不低于 15 % ，培养120h，培养过程中，根据溶解氧的降低，适当提高转速和通气量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最终发酵效价2. 37g/L。 实施例5 菌种波赛链霉菌 向1500L发酵罐中加入9. 02kg麸皮、63. 00kg玉米淀粉、0. 45kg猪血浆蛋白粉、 0. 093kg磷酸二氢钾、0. 9kg硫酸铵、7. 01kg碳酸钙和400L纯化水搅拌溶解，待固体完全 溶解混匀后，加入0. 90kg硅酸锂，加入0. 73kg消泡剂DF104,加入纯水定至总体积800L， 密封好发酵罐口。 121°C-123°0灭菌30!11111。移种后，调节发酵罐压縮空气流量61mVh，转 速80-200rpm，罐压0. 04-0. 06MPa，温度31°C ，标定溶氧100 % ，发酵过程控制溶氧不低于 15 % ，培养120h，培养过程中，根据溶解氧的降低，适当提高转速和通气量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最终发酵效价2. 26g/L。 实施例6 菌种天蓝淡红链霉菌 向1500L发酵罐中加入9. 02kg麸皮、63. 00kg玉米淀粉、8. 12kg猪血浆蛋白粉、 0. 09kg磷酸二氢钾、0. 91kg硫酸铵、7. 01kg碳酸钙和400L纯化水搅拌溶解，待固体完全 溶解混匀后，加入9. 02kg硅酸锂，加入0. 73kg消泡剂DF104,加入纯水定至总体积800L， 密封好发酵罐口。 12rC-123t:灭菌30min。移种后，调节发酵罐压縮空气流量61m3/h，转 速80-200rpm，罐压0. 04-0. 06MPa，温度31°C ，标定溶氧100 % ，发酵过程控制溶氧不低于 15 % ，培养120h，培养过程中，根据溶解氧的降低，适当提高转速和通气量，保持溶解氧在 15%以上水平。
5
最终发酵效价2. 25g/L。 实施例7 菌种天蓝淡红链霉菌 向1500L发酵罐中加入9. 10kg麸皮、63. 20kg玉米淀粉、45. lkg母猪血浆蛋白粉、 0. 091kg磷酸二氢钾、0. 91kg硫酸铵、7. 21kg碳酸钙和400L纯化水搅拌溶解，待固体完全 溶解混匀后，加入9. lkg硅酸锂，加入0. 73kg消泡剂DF104，加入纯水定至总体积800L，密 封好发酵罐口。 121°C-123°0灭菌3()111111。移种后，调节发酵罐压縮空气流量61m3/h，转 速80-200rpm，罐压0. 04-0. 06MPa，温度31°C ，标定溶氧100 % ，发酵过程控制溶氧不低于 15 % ，培养120h，培养过程中，根据溶解氧的降低，适当提高转速和通气量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最终发酵效价2. 31g/L。 实施例8 菌种波赛链霉菌 向1500L发酵罐中加入9. 02kg麸皮、63. llkg玉米淀粉、4. 5kg母猪血浆蛋白粉、 0. 09kg磷酸二氢钾、0. 9kg硫酸铵、7. llkg碳酸f丐和400L纯化水搅拌溶解，待固体完全溶 解混匀后，加入0. 09kg硅酸锂，加入0. 73kg消泡剂DF104，加入纯水定至总体积800L，密 封好发酵罐口。 121°C-123°0灭菌3()111111。移种后，调节发酵罐压縮空气流量61mVh，转 速80-200rpm，罐压0. 04-0. 06MPa，温度31°C ，标定溶氧100 % ，发酵过程控制溶氧不低于 15 % ，培养120h，培养过程中，根据溶解氧的降低，适当提高转速和通气量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最终发酵效价2. 45g/L。 实施例9 菌种灰色链霉菌 向1500L发酵罐中加入9.05kg麸皮、63.01kg玉米淀粉、90kg母猪血浆蛋白粉、 0. 091kg磷酸二氢钾、0. 91kg硫酸铵、7. Olkg碳酸钙和400L纯化水搅拌溶解，待固体完全 溶解混匀后，加入0. 091kg硅酸锂，加入0. 73kg消泡剂DF104，加入纯水定至总体积800L， 密封好发酵罐口。 121°C-123°0灭菌30!11111。移种后，调节发酵罐压縮空气流量61mVh，转 速80-200rpm，罐压0. 04-0. 06MPa，温度31°C ，标定溶氧100 % ，发酵过程控制溶氧不低于 15 % ，培养120h，培养过程中，根据溶解氧的降低，适当提高转速和通气量，保持溶解氧在 15%以上水平。最终发酵效价2. 34g/L。 实施例10 菌种灰色链霉菌 向1500L发酵罐中加入9.02kg麸皮、63.00kg玉米淀粉、90kg母猪血浆蛋白粉、 0. 093kg磷酸二氢钾、0. 9kg硫酸铵、7. Olkg碳酸钙和400L纯化水搅拌溶解，待固体完全 溶解混匀后，加入0. 09kg硅酸锂，加入0. 73kg消泡剂DF104，加入纯水定至总体积800L， 密封好发酵罐口。 121°C-123°0灭菌30!11111。移种后，调节发酵罐压縮空气流量61mVh，转 速80-200rpm，罐压0. 04-0. 06MPa，温度31°C ，标定溶氧100 % ，发酵过程控制溶氧不低于 15 % ，培养120h，培养过程中，根据溶解氧的降低，适当提高转速和通气量，保持溶解氧在
615%以上水平。 最终发酵效价2. 21g/L。 实施例11 菌种灰色链霉菌 向1500L发酵罐中加入9. 02kg麸皮、63. 00kg玉米淀粉、0. 99kg母猪血浆蛋白 粉、0. 093kg磷酸二氢钾、0. 9kg硫酸铵、7. Olkg碳酸f丐和400L纯化水搅拌溶解，待固体完 全溶解混匀后，加入44g硅酸锂，加入0. 73kg消泡剂DF104，加入纯水定至总体积800L，密 封好发酵罐口。 121°C-123°0灭菌3()111111。移种后，调节发酵罐压縮空气流量61mVh，转 速80-200rpm，罐压0. 04-0. 06MPa，温度31°C ，标定溶氧100 % ，发酵过程控制溶氧不低于 15 % ，培养120h，培养过程中，根据溶解氧的降低，适当提高转速和通气量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最终发酵效价2. 20g/L。 实施例12 菌种灰色链霉菌 向1500L发酵罐中加入9. 10kg麸皮、63. 20kg玉米淀粉、80. 2kg低灰份血浆蛋白 粉、0. 09kg磷酸二氢钾、0. 91kg硫酸铵、7. 21kg碳酸f丐和400L纯化水搅拌溶解，待固体完 全溶解混匀后，加入0. 76kg硅酸锂，加入0. 73kg消泡剂DF104，加入纯水定至总体积800L， 密封好发酵罐口。 121°C-123°0灭菌3()111111。移种后，调节发酵罐压縮空气流量61m3/h，转 速80-200rpm，罐压0. 04-0. 06MPa，温度31°C，标定溶氧100 % ，发酵过程控制溶氧不低于 15X，培养120h，培养过程中，根据溶解氧的降低，适当提高转速和通气量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最终发酵效价2. 13g/L。 实施例13 菌种波赛链霉菌 向1500L发酵罐中加入9.02kg麸皮、63. llkg玉米淀粉、8. 74kg低灰份血浆蛋白 粉、0. 09kg磷酸二氢钾、0. 91kg硫酸铵、7. llkg碳酸f丐和400L纯化水搅拌溶解，待固体完 全溶解混匀后，加入7. 6kg硅酸锂，加入0. 73kg消泡剂DF104，加入纯水定至总体积800L， 密封好发酵罐口。 12rC-123t:灭菌30min。移种后，调节发酵罐压縮空气流量61m3/h，转 速80-200rpm，罐压0. 04-0. 06MPa，温度31°C ，标定溶氧100 % ，发酵过程控制溶氧不低于 15 % ，培养120h，培养过程中，根据溶解氧的降低，适当提高转速和通气量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最终发酵效价2. 36g/L。 实施例14 菌种波赛链霉菌 向1500L发酵罐中加入9. 05kg麸皮、63. Olkg玉米淀粉、2. 13kg低灰份血浆蛋白 粉、0. 091kg磷酸二氢钾、0. 91kg硫酸铵、7. Olkg碳酸f丐和400L纯化水搅拌溶解，待固体完 全溶解混匀后，加入0. 45kg硅酸锂，加入0. 73kg消泡剂DF104，加入纯水定至总体积800L， 密封好发酵罐口。 12rC-123t:灭菌30min。移种后，调节发酵罐压縮空气流量61m3/h，转 速80-200rpm，罐压0. 04-0. 06MPa，温度31°C ，标定溶氧100 % ，发酵过程控制溶氧不低于15%，培养120h，培养过程中，根据溶解氧的降低，适当提高转速和通气量，保持溶解氧在 15%以上水平。 最终发酵效价2. 47g/L。
权利要求
一种发酵生产柔红霉素的培养基，其特征在于，它含有血浆蛋白粉。
2. 如权利要求1所述的培养基，其特征在于，它含有如下成分麸皮、玉米淀粉、磷酸二 氢钾、硫酸铵和碳酸钙。
3. 如权利要求2所述的培养基，其特征在于，它含有硅酸锂。
4. 如权利要求3所述的培养基，其特征在于，它含有消泡剂。
5. 如权利要求4所述的培养基，其特征在于，按重量计，麸皮玉米淀粉血浆蛋白粉磷酸二氢钾硫酸铵碳酸钙硅酸锂消泡剂DFi04为i : 7 : (io 0.05) : o. oi : o. i : o. 8 : (i o.oo5) : o.os。
6. 如权利要求5所述的培养基，其特征在于，按重量计，麸皮玉米淀粉血浆 蛋白粉磷酸二氢钾硫酸铵碳酸钙硅酸锂消泡剂DFi04为i : 7 : (i o. i) : o. oi : o. i : o. 8 : (i o.oi) : o.os。
7. —种发酵生产柔红霉素的方法，其特征在于，发酵所用的培养基为权利要求l-6任 一所述的培养基。
8. 如权利要求7所述的方法，其特征在于，发酵生产柔红霉素所用的菌种为波赛链霉 菌、天蓝淡红链霉菌或灰色链霉菌。
全文摘要
本发明属于微生物工程领域，具体涉及一种发酵法生产柔红霉素的培养基及方法。本发明的培养基配方中用血浆蛋白粉代替了麸质粉，并添加了硅酸锂，同时优化了培养基各组分的比例。采用本发明所述的培养基并结合本发明所述的发酵工艺，大大提高了生产柔红霉素的发酵效价，降低了生产柔红霉素的生产成本。
文档编号C12R1/545GK101760491SQ200810188538
公开日2010年6月30日 申请日期2008年12月19日 优先权日2008年12月19日
发明者赵志全 申请人:鲁南制药集团股份有限公司