专利名称：肠道病毒71型核酸检测用引物、探针及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术，特别涉及肠道病毒71型核酸检测用引物、探针及 试剂盒。
背景技术：
肠道病毒71型CeWeraWrw (y， 7/，简称EV71)为单股正链RNA病毒，属于 小RNA病毒科CP/coram^W&e)。 EV71是嗜神经性病毒，除了引起儿童手足口病夕卜， 容易导致严重的神经系统相关并发症，如无菌性脑膜炎、脑干脑炎、神经源性肺水 肿等，EV71致死率高。EV71感染一年四季均可发生，亚热带地区在夏秋季易于 造成流行。托幼机构是EV71流行、爆发的主要场所。造成EV71感染与流行除了 宿主因素外，还与病毒的种类、侵入易感者的病毒量、病毒毒性强弱以及人群的抗 体水平有关。另外，低劣的卫生条件和过度拥挤的居住环境在病毒的传播中起重要 作用。EV71主要通过粪-口途径在人群中传播，带毒的粪便可通过污染的手、餐具、 食物经口进入人体，咳嗽、打喷口囊形成的飞沫可直接或间接进行传播，另外，接触 病人破溃的疱瘆液等也受到感染。幼儿普遍易感，易感性随年龄增长而降低。10 岁以下儿童比较容易受到感染，幼儿发病最多，3岁以下比较容易出现并发症，成 人患此病者较少，免疫功能不全的成人感染后，也有可能出现并发症。
自1974年从美国加利福尼亚爆发的表现为神经系统症状的患者首次分离到 EV71,许多国家和地区相继报道了 EV71在不同地区的流行情况，1975年保加利 亚和1978年匈牙利发生严重EV71爆发流行，分别导致44例和45例死亡。近年 来，EV71在亚洲太平洋地区特别是东南亚地区的流行呈上升趋势，在过去的七年 间就发生过多次爆发流行，其中最为严重的有四次，分别是1997年，马来西亚， 30例死亡；1998年，台湾，78例死亡；2000年，台湾，25例死亡及2001年，台 湾，26例死亡。EV71已经取代脊髓灰质炎病毒成为肠道病毒中最受瞩目的成员。 2008年安徽、广东、浙江等28个省市受EV71病毒感染严重，超过三万儿童感染该病，将近50人因该病而死亡，手足口病在2008年5月2日已被中华人民共和国 卫生部定为丙类传染病。
本发明选择肠道病毒71型VP1基因设计的用于焚光RT-PCR检测的引物及探 针序列，建立了肠道病毒71型荧光RT-PCR检测技术，反应结束即可根据扩增曲 线判定是否有肠道病毒71型。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用于肠道病毒71型实时荧光RT-PCR检 测的引物、探针序列及试剂盒，使得能够快速简单地判断样品是否有肠道病毒71 型，为手足口病的病原学诊断提供科学依据。
为了解决上述技术问题，本发明在分析已报道肠道病毒71型VP1基因序列的 基础上，分别设计引物及焚光探针。所述的引物由正向引物和反向引物组成，其核 普酸序列如下
正向引物5，-AGTGATGAGAGTATGATTGAGACACG-3，； 反向引物5'-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3'。
本发明设计的探针的核苷酸序列如下 5,-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-3',
该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。其中，报告荧 光染料可采用下列荧光基团中的任意一种Fam 、 Hex 、 Tet 、 Joe 、 Vic 、 FITC 、 Cy3和Cy5 。淬灭荧光染料可釆用下列荧光基团中的任意一种Tamra 、 Rox 、 Dabcyl 、 BHQ1和BHQ2 。
根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了 一条标记有两个荧光染料基团 的核苷酸探针，例如将报告荧光染料标记在探针的5'端，淬灭荧光染料标记在探针 的3，端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料 吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过 程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq酶具有5，端到3，端的外切酶活 性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信 号增强，从而实现对肠道病毒71型的检测。
本发明还进一步给出了应用上述引物和探针检测肠道病毒71型核酸的方法，该方法是以样品RNA为摸板，利用上述的正向引物、反向引物以及探针进行实 时焚光RT-PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。 具体地说本发明以RNA为摸板，进行实时荧光RT-PCR反应，即在25 fil反应 体系加入2.5^1 10xOne Step RNA PCR Buffer, 2(il dNTP (各2.5mM),上述正向引 物和反向引物(10 |LiM)各1.5jil， 0.5^1上述探针(10 |LiM), 0.5filTaq酶，0.5|al RNase Inhibitor (40 U/pl) , 0.5^1 AMV RJase XL (5 U/|il)， 5^1 RNA , 10.5p 1 RNase Free dH20。
其中，上述反应条件可以是42。C反转录25min, 95。C变性3min,以95。C 10 s， 60°C 1 min(收集荧光信号)扩增40个循环。
当然，可以根据本发明给出的引物对或者其扩增产物序列设计其他类型的探 针，以适用不同方法的荧光PCR检测。
进一步，还可以将本发明的引物、探针以及相关试剂组装成试剂盒，以方便使用。
本发明根据肠道病毒71型VP1基因序列设计了引物及荧光探针，该引物特异 性好，用于荧光PCR检测的灵敏度高。本发明检测方法准确性高、灵敏度高，其 能够快速简单地判断样品是否有肠道病毒71型，为手足口病的病原学诊断及中枢 神经系统并发症的鉴别诊断提供了科学依据。
图1是实时荧光RT-PCR技术肠道病毒71型核酸检测的特异性实验的检测结果
图2是本发明检测方法的灵敏度实验的检测结果图。
具体实施例方式
下面实施例用于对本发明进一步说明，但不用来限制本发明的范围。 引物及探针的设计和合成
根据GenBank中EV71 VP1基因序列,利用生物软件Primer Express V2.0分 别在其保守位点设计引物和Taqman探针，并通过NCBI数据库进行了 Blast同源性 比对验证。设计的《1物序列为
EV71 Pf (正向)5'-AGTGATGAGAGTATGATTGAGACACG-3'针的序列为5'-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-3， 该探针的5'端用报告荧光染料FAM标记，3'端用淬灭荧光染料BHQ1标记。 RNA的提取
病毒样品RNA的抽提用Roche High Pure viral RNAkit试剂盒提取，取0.5克左右 粪便标本，力口TE 500|^1制成10-20%的悬液，8000rpm离心5分钟；取200|^1标本上清 加400jil结合液，混合均匀，加入纯化过滤管中，10000rpm, 15s;弃去过滤液，换 一新的收集管，力口入500j^1 inhibitor removal buffer, 1 OOOOrpm离心1分钟；弃去过滤 液，换一新的收集管，加入450fil洗液，10000rpm离心l分钟；重洗一次；最后离 心，13000rpm， 10s,弃去残余的洗液；去掉收集管，换一个干净的无RNA的 1.5m正ppendrof离心管，用50fil洗脱液加入过滤管中，10000rpm离心l分钟，将提取 的RNA移到一个新的离心管中，于-8(TC保存。 Real-timeRT-PCR扩增方法的建立 1 、 实时荧光RT-PCR反应体系
以RNA为摸板，进行实时RT-PCR反应。
荧光定量RT-PCR反应体系如下表
组分25 |il体积终浓度
10xOne Step脂A PCR Buffer2.5lx
dNTP (各2.5mM)20.4 mM
正、反向引物(lOpM)各1.5各0.6pM
探针(10 )iM)0.50.2 (iM
Taq酶0.52.5U
RNase Inhibitor (40 U/|il)0.520 U
AMV RTase XL (5 U/|il)0.52.5U
RNA5
RNase Free dH2010.5
2 、 实时荧光RT-PCR反应条件
将样品管放入ABI公司7300荧光PCR仪后，设置如下条件进行反应42°C 反转录25min, 95。C变性3min,以95。C10s, 60°C 1 min(收集焚光信号FAM)扩增40个循环。每个循环结束采集数据。反应结束后根据扩增曲线判定结果。 肠道病毒71型核酸Real-time RT-PCR方法的特异性确定
利用建立起的荧光RT-PCR反应体系分别对10抹不同的人类病毒进行检测，检 测结果如图l所示，4抹EV71病毒(编号分别为EV71-SZ98, EV71-SZ01, EV71-SZ03 ， EV71-GZ05)出现相应的特异性荧光扩增曲线(参见图中A所指)，呈阳性反应。而 其他6林人类病毒(包括3抹灭活的脊髓灰质炎病毒Polio I 、 PolioII、 Polioin,两 抹轮状病毒、l抹诺如病毒。)则均没有荧光信号产生，为一平直的线(参见图中B 所指)，判为阴性。结果表明，所设计的引物探针只对目的病毒(即，EV71病毒) 特异，与其它检测对象无交叉反应。
试验结果
以肠道病毒71型的RNA为模板，通过实时荧光RT-PCR检测可观察到明显的 荧光强度变化，而其他病毒的焚光强度没有变化。 灵敏度实验
将EV71体外转录RNA用DEPC处理的水分别稀释，进行相对灵敏度4企测，在 25fil反应体系中，RNA分别被稀释成5.0x107、 5.0x106、 5.0x105、 5.0x104、 5.0x103、 5.0x102、 5.0xlQi拷贝数,检测结果如图2所示，最低检测限为50个模板拷贝。核苷酸序列表
<110> 何雅青
肖性龙
<120>肠道病毒71型核酸检测用引物、探针及试剂盒 <160> 3
<170> Patentln version 3.3
<210> 1
<211> 26
<212〉 DNA
<213> 人工序列
<223> 人工序列的描述引物
<400> 1
agtgatgaga gtatgattga gacacg 26
<210> 2
<211〉 20
<212> DNA
<213〉 人工序列
<223> 人工序列的描述
<400> 2
cccgctctgc tgaagaaact
<210〉 3
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列 <223>人工序列的描述探针
<400> 3
tcgcacagca cagctgagac cactc 25
引物
20
权利要求
1、一种肠道病毒71型核酸检测用引物，其特征在于，该引物的核苷酸序列为正向引物5’-AGTGATGAGAGTATGATTGAGACACG-3’；反向引物5’-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3’。
2、 一种与权利要求1所述引物配合使用的探针，其特征在于，该探针的核普 酸序列为5，-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-3，，该4笨针一端标记有报告 荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。
3、 如权利要求2所述的探针，其特征在于报告荧光染料采用FAM荧光基团， 标记在探针的5，端，淬灭荧光染料采用BHQ1荧光基团，标记在纟笨针的3，端。
4、 一种检测肠道病毒71型核酸的方法，该方法以样品RNA为摸板，利用权 利要求1的引物以及权利要求2或3所述的探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个 循环结束釆集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。
5、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，实时荧光RT-PCR扩增反应采用 25 (il反应体系，该反应体系的组分如下2.5^1 10xOne Step RNA PCR Buffer , 终浓度为0.4 mM的dNTP ，终浓度为0.6pM的所述正向引物，终浓度为0.6fiM 的所述反向引物，终浓度为0.2 的所述探针，终浓度为2.5U的Taq酶，终 浓度为20 U的RNase Inhibitor ，终浓度为2.5U的AMV RTase XL , 5|il样品 RNA , 10,5jal RNase Free dH2〇；实时荧光RT-PCR扩增反应的反应条件如下42t:反转录25min; 95。C变性3 min;以95°C 10 s， 60°C 1 min扩增40个循环。
6、 一种肠道病毒71型核酸检测用试剂盒，其特征在于含有权利要求l所述 的正向引物和反向引物。
7、 如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于还包括权利要求2或3所述的 探针。
全文摘要
本发明涉及肠道病毒71型核酸检测用引物、探针及试剂盒，其引物的核苷酸序列为正向引物5’-AGTGATGAGAGTATGATTGAGACACG-3’；反向引物5’-CCCGCTCTGCTGAAGAAACT-3’。其探针的核苷酸序列为5’-TCGCACAGCACAGCTGAGACCACTC-3’。还提供了检测肠道病毒71型核酸的方法，该方法以样品RNA为摸板，利用上述引物和探针进行实时荧光RT-PCR扩增，每个循环结束后根据扩增曲线判定结果。本发明引物特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度高，为手足口病的病原学诊断及中枢神经系统并发症的鉴别诊断提供了科学依据。
文档编号C12N15/11GK101676407SQ20081021616
公开日2010年3月24日 申请日期2008年9月18日 优先权日2008年9月18日
发明者何雅青, 肖性龙 申请人:何雅青;肖性龙