专利名称：柯萨奇病毒实时荧光rt-pcr检测方法和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和核酸检测技术领域。具体地，本发明涉及针对柯萨奇病毒检测的实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒。
背景技术：
柯萨奇病毒(Coxsackievirus)属于微小核糖核酸病毒科(Picornaviridae)肠道病毒属，据其生物学特点分为两类，即A组和B组。人类感染柯萨奇病毒后分别引起疱疹性咽峡炎(A组)和非麻痹性类脊髓灰质炎(B组)。据调查伴有口咽部疱疹和皮疹的急性热病中，79%为柯萨克病毒A组所致，其中较常见的柯萨奇病毒A16型是引起手足口病的主要病原体之一。柯萨奇病毒B组是引发人类病毒性心肌炎的主要病原微生物[1]。近年来，在北京、河南、沈阳等地先后发生多起柯萨奇病毒感染事件[2_4]。2005年 5月河南发生一起柯萨奇病毒B5型疫情，历时34天发病49例，14岁以下儿童罹患率达 13. 57% [2]。2006年我国卫生部门统计，全国各地共报告手足口病达13637例[4]，有相当一部分病例是感染A16型柯萨奇病毒所致。目前尚未研制出有效预防柯萨奇病毒的疫苗，因此加强柯萨奇病毒防控工作尤为重要。为了及时有效地发现病毒感染源，建立高效的柯萨奇病毒检测方法是预防病毒感染和流行的关键技术手段之一。然而，目前在柯萨奇病毒检测中存在诸多难点。环境样品中病毒含量非常低，一般在100个病毒颗粒以下，且干扰和抑制后续检测的因子更加复杂，给检测方法带来了巨大挑战，因此需要针对性更强和灵敏度更高的检测方法。国内外研究者近几年相继报道了柯萨奇病毒的ELISA方法、普通PCR和实时荧光PCR等方法[5_8]。虽然ELISA方法能检测早期病人血清中柯萨奇病毒的IgM和IgG抗体，但该法因抗体制备困难、检测灵敏度不高使应用受到限制。基于核酸的PCR检测技术成本低且快速，已广泛应用于病毒检测。前人的研究多基于Taqman-FAM-TAMRA探针，例如Tana(2008)等建立柯萨奇病毒A16型与肠道病毒71型的多重实时荧光PCR方法[5]，然而，该方法检测A16型病毒时采用的是荧光杂交探针，其对实时荧光PCR系统有了更高的要求，不是所有实时荧光PCR仪均可实施反应。荧光杂交探针需要2条相邻的探针，这样增加了成本，并且其中一条探针标记了 LC Red 750荧光基团， 该基团分辨率有限，灵敏度差。因此，该方法不利于推广应用。本领域尚缺乏针对单一血清型柯萨奇病毒的高灵敏度、高特异性、灵活简便、应用性强的检测方法，更缺乏快速检测和鉴定各种血清型柯萨奇病毒的检测技术。综上所述，鉴于目前尚没有特异性好、灵敏度高的柯萨奇病毒实时荧光RT-PCR检测方法。因此，本领域迫切需要开发特异性好、灵敏度高的柯萨奇病毒实时荧光RT-PCR检测方法
发明内容
本发明的目的在于提供一种特异性好、灵敏度高、准确、简便的柯萨奇病毒实时荧光RT-PCR检测方法。 本发明的另一目的在于提供柯萨奇病毒实时荧光RT-PCR检测试剂盒。本发明的再一目的在于提供柯萨奇病毒检测相关引物和探针。在本发明的第一方面，提供了一种聚合酶链式反应方法，它包括步骤在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增柯萨奇病毒的特异性引物对和柯萨奇病毒特异性探针，并且所述引物扩增出的扩增产物具有柯萨奇病毒基因组VPl区的核苷酸序列。在另一优选例中，所述的扩增柯萨奇病毒的特异性引物对包括选自下组的1-5种引物对A9 型柯萨奇病毒:SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 ；A16 型柯萨奇病毒SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 ；B2 型柯萨奇病毒:SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 ；B3 型柯萨奇病毒:SEQ ID NO 10 和 SEQ ID NO 11 ；B5 型柯萨奇病毒SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO :14。在另一优选例中，所述的柯萨奇病毒特异性探针是Taqman-MGB探针或Taqman探针。在另一优选例中，所述的聚合酶反应体系中柯萨奇病毒基因组或cDNA的拷贝数小于10个，较佳地小于或等于5个，更佳地小于或等于2个。在另一优选例中，所述的柯萨奇病毒特异性探针具有选自下组的核苷酸序列A9 型柯萨奇病毒SEQ ID NO 3 ；A16 型柯萨奇病毒SEQ ID NO 6 ；B2 型柯萨奇病毒SEQ ID NO 9 ；B3 型柯萨奇病毒SEQ ID NO 12 ；B5 型柯萨奇病毒SEQ ID NO :15。在另一优选例中，所述方法还包括步骤在聚合酶链式反应过程中或之后，检测柯萨奇病毒特异性探针发出的荧光信号。在另一优选例中，所述的反应体系中含有来自待检测环境样品或人类排泄物样品的核酸。在本发明的第二方面，提供了一种检测试剂盒，它含有以下试剂(a)扩增柯萨奇病毒的特异性引物对，并且所述引物扩增出的扩增产物具有柯萨奇病毒基因组VPl区的核苷酸序列；和(b)检测柯萨奇病毒的检测特异性探针。在另一优选例中，所述的扩增柯萨奇病毒的特异性引物对包括选自下组的1-5种引物对A9 型柯萨奇病毒:SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 ；A16 型柯萨奇病毒SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 ；B2 型柯萨奇病毒:SEQ ID NO 7 和 SEQID NO 8 ；B3 型柯萨奇病毒SEQ ID NO 10 和 SEQ ID NO 11 ；
B5 型柯萨奇病毒SEQ ID NO 13 和 SEQ ID NO :14。
在另一优选例中，所述的柯萨奇病毒特异性探针是Taqman-MGB探针或Taqman探针。在另一优选例中，所述的柯萨奇病毒特异性探针具有选自下组的核苷酸序列A9 型柯萨奇病毒SEQ ID NO 3 ；A16 型柯萨奇病毒SEQ ID NO 6 ；B2 型柯萨奇病毒SEQ ID NO 9 ；B3 型柯萨奇病毒:SEQ ID NO 12 ；B5 型柯萨奇病毒SEQ ID NO :15。在另一优选例中，提供了一种用于检测柯萨奇病毒的检测试剂盒，其含有(a)针对柯萨奇病毒5种血清型(A9型、A16型、B2型、B3型、B5型)设计的5对特异性引物，所述的特异性引物对分别特异性地扩增柯萨奇病毒五种血清型基因组VPl区的一段序列；(b) Taqman-MGB探针，所述的Taqman-MGB探针与对应的特异性引物扩增区域DNA 特异性结合；(c)任选的标准参照物；在另一优选例中，所述的标准参照物是柯萨奇病毒cDNA或含柯萨奇病毒扩增目的片段的质粒DNA ；在另一优选例中，所述的特异性引物和/或探针选自下组
权利要求
1.一种聚合酶链式反应方法，其特征在于，它包括步骤在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增柯萨奇病毒的特异性引物对和柯萨奇病毒特异性探针，并且所述引物扩增出的扩增产物具有柯萨奇病毒基因组VPl区的核苷酸序列。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的扩增柯萨奇病毒的特异性引物对包括选自下组的1-5种引物对A9 型柯萨奇病毒:SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 ； A16 型柯萨奇病毒:SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 ； B2 型柯萨奇病毒:SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 ； B3 型柯萨奇病毒:SEQ ID NO :10 和 SEQ ID NO 11 ； B5 型柯萨奇病毒SEQ ID NO :13 和 SEQ ID NO :14。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的柯萨奇病毒特异性探针是 Taqman-MGBTaqman
4.如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述的柯萨奇病毒特异性探针具有选自下组的核苷酸序列A9型柯萨奇病毒SEQ ID NO 3 ； A16型柯萨奇病毒SEQ ID NO 6 ； B2型柯萨奇病毒SEQ ID NO 9 ； B3型柯萨奇病毒SEQ ID NO 12 ； B5型柯萨奇病毒:SEQ ID NO :15。
5.如权利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤在聚合酶链式反应过程中或之后，检测柯萨奇病毒特异性探针发出的荧光信号。
6.一种检测试剂盒，其特征在于，它含有以下试剂(a)扩增柯萨奇病毒的特异性引物对，并且所述引物扩增出的扩增产物具有柯萨奇病毒基因组VPl区的核苷酸序列；和(b)检测柯萨奇病毒的特异性探针。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的扩增柯萨奇病毒的特异性引物对包括选自下组的1-5种引物对A9 型柯萨奇病毒:SEQ ID NO 1 和 SEQ ID NO 2 ； A16 型柯萨奇病毒:SEQ ID NO 4 和 SEQ ID NO 5 ； B2 型柯萨奇病毒:SEQ ID NO 7 和 SEQ ID NO 8 ； B3 型柯萨奇病毒:SEQ ID NO :10 和 SEQ ID NO 11 ； B5 型柯萨奇病毒:SEQ ID NO :13 和 SEQ ID NO :14。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的柯萨奇病毒特异性探针是 Taqman-MGBTaqman
9.如权利要求6-8中任一所述的试剂盒，其特征在于，所述的柯萨奇病毒特异性探针具有选自下组的核苷酸序列A9型柯萨奇病毒SEQ ID NO 3 ； A16型柯萨奇病毒SEQ ID NO 6 ； B2型柯萨奇病毒SEQ ID NO 9 ；B3型柯萨奇病毒SEQ ID NO :12 ； B5型柯萨奇病毒:SEQ ID NO :15。
10.如权利要求6所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于检测在环境样品或人类排泄物样品中是否存在柯萨奇病毒。
全文摘要
本发明涉及柯萨奇病毒实时荧光RT-PCR检测方法和试剂盒。具体地，本发明公开了一种检测柯萨奇病毒的方法，在聚合酶反应体系中进行聚合酶链式反应，所述的反应体系中含有扩增柯萨奇病毒的特异性引物对和柯萨奇病毒特异性探针。本发明还提供了相应的试剂盒。本发明可灵敏、简便地检测和鉴定柯萨奇病毒。
文档编号C12N15/11GK102312017SQ20101022209
公开日2012年1月11日 申请日期2010年7月7日 优先权日2010年7月7日
发明者卢钟山, 吕蓉, 张舒亚, 李俊毅, 李想, 潘良文, 黄一 申请人:上海出入境检验检疫局动植物与食品检验检疫技术中心