专利名称：大黄鱼ifng基因的扩增引物及其设计方法
技术领域：
本发明涉及一对引物IF和IR，尤其是涉及一对可高效扩增大黄鱼IFNG基因第一 内含子SSR序列的扩增引物及其设计方法。
背景技术：
大黄鱼是我国最重要的海产经济鱼类之一。在浙江和福建，大黄鱼的养殖业规模 庞大，具有很高的经济和社会效益。但是，由于人类的大规模的捕捞和养殖活动，对大黄鱼 的种质资源产生很大的冲击，包括天然种群的规模下降、不同地理种群之间相互混杂、大规 模疾病频繁爆发，影响了大黄鱼的养殖业的健康发展。SSR序列又称微卫星序列，指的是1 6个碱基的DNA串联重复序列，分布于真核 生物的整个基因组中，SSR本身重复数目的变异，构成了其多态性的基础。王得前等([2] 王得前，卢立志.微卫星DNA的研究进展.浙江农业科学，2005，(1) :1_4)根据特异性序列 可以设计引物对基因组DNA进行PCR扩增。从而检测物种在DNA水平上的遗传多样性。在 动物亲缘关系的鉴定、特定基因定位与克隆、群体遗传结构的分析、遗传性疾病与生产性状 位点的连锁分析、遗传基因连锁图谱的构建等方面已得到了广泛的应用([3]刘志毅，相建 海.微卫星DNA分子标记在海洋动物遗传分析中的应用.海洋科学，2001，25 (6) :11_13)。IFNG就是干扰素Y，又叫II型干扰素，可以干扰病毒的复制、激活细胞介导 的免疫反应、激活巨噬细胞的杀菌功能，是脊椎动物免疫系统中的一个重要的细胞因 子。目前，IFNG已经应用于疾病的诊断、治疗、免疫佐剂等方面。同时，IFNG的基因型， 尤其是其第一内含子SSR序列的多态性更是与抗病能力密切相关([4]Kate Schroder, Pa μ 1 J. Hertzog, Timothy Ravasi，David A. H μ Me. Interferon—gamma :an overview of signals， mechanisms and functions[J]Journal of Leukocyte Biology，2004， 75(2) :163_189 ； [5]Vera Pravica，Chris Perrey，Adam Stevens, Jar-How Lee, Ian V.Hutchinson. A single nucleotide polymorphism in the first intron of the h μ Man IFN- γ gene !Absolute correlation with a polymorphic CA microsatellite marker of high IFN-γ production [J]. H μ Man Immunology,2000,61(9) 863-866 ； [6]Mohammed Awad, Vera Pravica, Chris Perrey, Ahmed El Gamel，Nizar Yonan, Pa μ 1 J. Sinnott, Ian V. Hutchinson. CA repeat allele polymorphism in the first intron of the h μ Man interferon-γ gene is associated with lung allograft fibrosis[J]H μ Man Immunology,1999,60(4) :343_346)。因此，大黄鱼IFNG基因第一内含子SSR序列的扩增引物的幵发，不仅可以应用于 大黄鱼的地理种群的鉴别、种质资源的评估，而且可以作为一个与疾病连锁的DNA标记，服 务于大黄鱼抗病育种的生产实践活动([7]王文文，常玉梅，梁利群.微卫星分析四个大黄 鱼群体的遗传多样性.水产学杂志，2009，22 (2) :6-11)。
发明内容
本发明的目的在于提供大黄鱼IFNG基因第一内含子SSR序列的扩增引物及其设 计方法。本发明所述大黄鱼IFNG基因第一内含子SSR序列的扩增引物由两条单链寡聚核 苷酸组成，其中上游引物IF有20个碱基TACAAGCCCTGTTTCCTCCT，下游引物IR有20个碱 基TCTGCTGTAACTGTTGTGAG。本发明所述大黄鱼IFNG基因第一内含子SSR序列的扩增引物的设计方法，包括以 下步骤1)登陆Genebank搜索硬骨鱼类IFNG基因的保守区，经同源比对，获得一 对扩增引物，其中上游引物EF为5’ -ATGAACAAAACCATCCAGAGC-3’ ；下游引物ER为 5，-TTTCTTCAGAATGTAGTTCAG-3，，该引物的扩增范围包括IFNG基因第一外显子、第一内含 子、第二外显子、第二内含子和第三外显子序列；在步骤1)中，所述扩增的片段大小在2700bps左右。2)采用步骤1)中所述扩增引物，通过长PCR方法扩增获得大黄鱼IFNG基因的片 段，包括第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子和第三外显子序列，将所得的扩 增产物连接于PMD19-T载体，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落进行测序；在步骤2)中，所述长PCR方法的具体步骤为(1)配置 PCR 反应液。将 Taq 酶 0. 75 单位、10XPCR buffer 2. 5 μ l、dNTP (dATP， dTTP, dGTP, dCTP 各 2. 5mM) 2 μ 1、大黄鱼 DNA 50ng、弓 |物 EF(10 μ Μ)禾口 ER(IOyM)各 1μ 1 加入200 μ 1离心管，加水至25 μ 1，混勻，滴加矿物油1滴防止蒸发。(2)对上述PCR反应液进行PCR循环。第一步94°C变性5min ；第二步94°C变性 lmin，48 53°C退火 0. 5 1. 5min,72°C 延伸1 3. 5min ；第二步重复30 35次；第三步72°C延伸IOmin ；第四步保持4°C暂停。由于所扩增的产物片段较长，对PCR反应条件进行了调整。包括使用TAKARA公司 生产的长链PCR专用的LA Taq酶代替普通Taq酶；变性温度可从53°C可降到48°C;延伸时 间可从Imin延长至3. 5min。实验证明这些调整都有助于提高PCR的成功率和产率。(3)将所得的扩增产物连接于PMD19-T载体，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落进 行测序，实际测序结果有2720bps，包括第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子、 第三外显子序列。所述长PCR方法是指通过降低变性温度、延长延伸时间及使用TAKARA公司生产的 LATaq酶；所述降低变性温度是从53°C降到48°C，所述延长延伸时间是延长至3. 5min,所述 LATaq酶可采用TAKARA公司生产的LATaq酶。3)使用同源比对软件BLAST对所得的大黄鱼IFNG基因序列和其他硬骨鱼类IFNG 基因序列进行比对，找出大黄鱼IFNG基因中第一内含子的序列，以及第一内含子中的SSR 序列的位置，根据该序列设计出可用于扩增大黄鱼IFNG基因第一内含子SSR序列的扩增 引物 IF TACAAGCCCTGTTTCCTCCT 和 IR TCTGCTGTAACTGTTGTGAG,扩增片段大小在 350 450bps 之间。本发明所述大黄鱼IFNG基因第一内含子SSR序列的扩增引物IF和IR对不同种 群的大黄鱼进行PCR扩增，均能获得片段大小在350 450bps之间的特异性扩增产物。经
4测序及与大黄鱼IFNG基因序列的比较，证实为IFNG基因第一内含子的扩增产物，并且都含 有SSR序列。从而为大黄鱼的地理种群的鉴别、种质资源的评估、分子标记辅助育种提供了 一个有力的工具。
具体实施例方式本发明所述大黄鱼IFNG基因第一内含子SSR序列的扩增引物由两条单链寡聚核 苷酸组成，其中上游引物IF有20个碱基TACAAGCCCTGTTTCCTCCT，下游引物IR有20个碱 基TCTGCTGTAACTGTTGTGAG。上述引物对不同种群的大黄鱼进行PCR扩增，均能获得片段大小在350 450bps 之间的特异性扩增产物。经测序及与大黄鱼IFNG基因序列的比较，证实为IFNG基因第一 内含子的扩增产物，并且都含有SSR序列。从而为大黄鱼的地理种群的鉴别、种质资源的评 估、分子标记辅助育种提供了一个有力的工具。本发明所述的石斑鱼类线粒体基因组高变异区扩增引物采用以下方法设计1)登陆 Genebank,(网址为 http //www, ncbi. nlm. nih. gov,全称是 National Center for Biotechnology Information，该网站收录有当今世界上所有已公开的基因序 列)搜索硬骨鱼类IFNG基因的保守区，经同源比对，获得一对扩增引物，其中上游引物EF 为5，-ATGAACAAAACCATCCAGAGC-3，；下游引物 ER 为5，-TTTCTTCAGAATGTAGTTCAG-3，，该 引物的扩增范围包括IFNG基因第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子、第三外 显子序列，扩增片段大小在2700bps左右。上述扩增引物其主要用处在于扩增包含SSR序列的IFNG基因第一内含子，为扩增 IFNG基因第一内含子的SSR序列引物的设计奠定基础。2)采用步骤1)中所述的扩增引物，通过长PCR方法扩增获得大黄鱼的目的片 段。由于所扩增的产物片段较长，对PCR反应条件进行了调整。将所得的扩增产物连接于 PMD19-T载体，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落进行测序，结果包括第一外显子、第一内含
子、第二外显子、第二内含子、第三外显子序列。所述的调整PCR反应条件是指通过降低变性温度、延长延伸时间(变性温度从 53°C可降到48°C，延伸时间可延长至3. 5min)及使用TAKARA公司生产的LATaq酶。3)使用同源比对软件BLAST对所得的大黄鱼IFNG基因序列和其他硬骨鱼类IFNG 基因序列进行比对，先找出大黄鱼IFNG基因第一外显子、第二外显子、第三外显子的序列， 然后根据三个外显子的序列找出两个内含子的序列，并在第一内含子中找出SSR序列。根 据该SSR序列上下游的基因序列设计出可用于扩增大黄鱼IFNG基因第一内含子SSR序 列的扩增引物 IF TACAAGCCCTGTTTCCTCCT 和 IR :TCTGCTGTAACTGTTGTGAG，扩增片段大小在 350 450bps 之间。同源比对软件 BLAST 可在 http //blast, ncbi. nlm. nih. gov 上在线使用。BLAST 是用来对核酸与蛋白序列进行序列同源比对的软件。不同种类的内含子的相似度很低，无 法进行BLAST比对，而不同种类的外显子的相似度较高，可以进行BLAST比对。通过BLAST 比对可获得第一外显子、第二外显子、第三外显子的序列，处于第一外显子和第二外显子之 间的就是第一内含子，处于第二外显子和第三外显子之间的就是第二内含子。找出第一内 含子序列中存在的SSR序列，并在其上游设计引物IF TACAAGCCCTGTTTCCTCCT，在下游设计
5引物IR :TCTGCTGTAACTGTTGTGAG，用于该SSR序列的扩增。 实施例1 扩增大黄鱼IFNG基因从第一外显子到第三外显子之间的序列。
登陆Genebank，搜索得到硬骨鱼牙鲆和河豚的IFNG基因的保守区，分别位 于第一外显子和第三外显子，经同源比对，设计一对扩增引物，其中上游引物EF为 5，-ATGAACAAAACCATCCAGAGC-3，；下游引物 ER 为5，-TTTCTTCAGAATGTAGTTCAG-3，，该引物 的扩增范围包括IFNG基因第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子、第三外显子 序列，扩增片段大小预计在1300bps 3000bps之间。采用上述的扩增引物EF和ER，通过长PCR方法扩增获得大黄鱼的目的片段。具体 操作为1)配置 PCR 反应液。将 Taq 酶 0.75 单位、10 XPCR buffer 2. 5 μ 1、dNTP (dATP， dTTP, dGTP, dCTP 各 2. 5mM) 2 μ 1、大黄鱼 DNA 50ng、弓 |物 EF(10 μ Μ)禾口 ER(IOyM)各 1μ 1 加入200 μ 1离心管，加水至25 μ 1，混勻，滴加矿物油1滴防止蒸发。2)对上述PCR反应液进行PCR循环。第一步94°C变性5min ；第二步94°C变性 lmin，48 53°C退火 0. 5 1. 5min, 72°C延伸1 3. 5min ；第二步重复30 35次；第三步72°C延伸IOmin ；第四步保持4°C暂停。由于所扩增的产物片段较长，对PCR反应条件进行了调整。包括使用TAKARA公司 生产的长链PCR专用的LA Taq酶代替普通Taq酶；变性温度可从53°C可降到48°C;延伸时 间可从Imin延长至3. 5min。实验证明这些调整都有助于提高PCR的成功率和产率。3)将所得的扩增产物连接于PMD19-T载体，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落进行 测序，实际测序结果有2720bps，包括第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子、第 三外显子序列。实施例2 设计出可用于扩增大黄鱼IFNG基因第一内含子SSR序列的扩增引物。 使用同源比对软件BLAST对所得的大黄鱼IFNG基因序列和其他硬骨鱼牙鲆和河豚的IFNG 基因序列进行比对。得知上述大黄鱼IFNG基因片段的测序结果中，1 36bps为第一外显 子，716 787bps为第二外显子，2544 2720bps为第三外显子的序列。第一外显子和第二 外显子之间的序列，37 715bps就是第一内含子，同样第二外显子和第三外显子之间的序 列，788 2543bps就是第二内含子。同时在第一内含子序列中找出SSR序列，位于195 264bps, CA重复35次。在SSR序列上游设计引物IF TACAAGCCCTGTTTCCTCCT,在SSR序列下 游设计引物IR :TCTGCTGTAACTGTTGTGAG，用于扩增大黄鱼IFNG基因第一内含子SSR序列。实施例3 用于扩增大黄鱼IFNG基因第一内含子SSR序列的扩增引物的验证。具 体操作为1)取浙江、福建沿海大黄鱼各5条，抽提10份DNA。2)配置 PCR 反应液。将 Taq 酶 0.75 单位、10 X PCR buffer 2. 5 μ 1、dNTP (dATP, dTTP,dGTP,dCTP# 2. 5mM) 1· 6μ 1、1 份 DNA 50ng、引物 IF(IOyM)和 IR(IOyM)各 1 μ 1 加 入200 μ 1离心管，加水至25 μ 1，混勻，滴加矿物油1滴防止蒸发。3)对上述PCR反应液进行PCR循环。第一步94°C变性5min ；第二步94°C变性 0. 5 lmin，50 53°C退火 0. 5 lmin，72°C延伸0. 5 Imin ；第二步重复30 35次；第三步72°C延伸IOmin ；第四步保
6持4°C暂停。4)电泳检测，10份PCR产物大小都在350 450bps之间，都有1 2条带。5)回收PCR产物测序，测序结果通过与大黄鱼IFNG基因序列的比较，证实为IFNG 基因第一内含子的扩增产物，并且都含有SSR序列。
权利要求
大黄鱼IFNG基因的扩增引物，其特征在于由两条单链寡聚核苷酸组成，其中上游引物IF有20个碱基TACAAGCCCTGTTTCCTCCT，下游引物IR有20个碱基TCTGCTGTAACTGTTGTGAG。
2.如权利要求1所述的大黄鱼IFNG基因第一内含子SSR序列的扩增引物的设计方法， 其特征在于包括以下步骤1)登陆Genebank搜索硬骨鱼类IFNG基因的保守区，经同源比对，获得一对 扩增引物，其中上游引物EF为5，-ATGAACAAAACCATCCAGAGC-3，；下游引物ER为: 5，-TTTCTTCAGAATGTAGTTCAG-3，，该引物的扩增范围包括IFNG基因第一外显子、第一内含 子、第二外显子、第二内含子和第三外显子序列；2)采用步骤1)中所述扩增引物，通过长PCR方法扩增获得大黄鱼IFNG基因的片段，包 括第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子和第三外显子序列，将所得的扩增产 物连接于PMD19-T载体，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落进行测序；3)使用同源比对软件BLAST对所得的大黄鱼IFNG基因序列和其他硬骨鱼类IFNG基 因序列进行比对，找出大黄鱼IFNG基因中第一内含子的序列，以及第一内含子中的SSR序 列的位置，根据该序列设计出可用于扩增大黄鱼IFNG基因第一内含子SSR序列的扩增引物 IF TACAAGCCCTGTTTCCTCCT 和 IR TCTGCTGTAACTGTTGTGAG，扩增片段大小在 350 450bps 之间。
3.如权利要求1所述的大黄鱼IFNG基因第一内含子SSR序列的扩增引物的设计方法， 其特征在于在步骤2)中，所述长PCR方法的具体步骤为1)配置PCR 反应液。将 Taq 酶 0. 75 单位、10XPCR buffer 2. 5 μ l、dNTP (dATP，dTTP， dGTP, dCTP 各 2. 5mM) 2 μ 1、大黄鱼 DNA 50ng、引物 EF(IOyM)和 ER(IOyM)各 1 μ 1 力口入 200 μ 1离心管，加水至25 μ 1，混勻，滴加矿物油1滴防止蒸发；2)对上述PCR反应液进行PCR循环；第一步94°C变性 5min ；第二步94°C变性 lmin，48 53°C退火 0. 5 1. 5min，72°C延 伸1 3. 5min ；第二步重复30 35次；第三步72°C延伸IOmin ；第四步保持4°C暂停；3)将所得的扩增产物连接于PMD19-T载体，转化大肠杆菌JM109，挑取单菌落进行测 序，实际测序结果有2720bps，包括第一外显子、第一内含子、第二外显子、第二内含子、第三 外显子序列。
全文摘要
大黄鱼IFNG基因的扩增引物及其设计方法，涉及一对引物IF和IR。提供大黄鱼IFNG基因第一内含子SSR序列的扩增引物及其设计方法。扩增引物由两条单链寡聚核苷酸组成。登陆Genebank搜索硬骨鱼类IFNG基因的保守区，经同源比对，获得一对扩增引物，通过PCR方法扩增获得大黄鱼IFNG基因的片段并测序。使用同源比对软件BLAST对所得序列进行比对，找出大黄鱼IFNG基因中第一内含子的序列，以及第一内含子中的SSR序列的位置，设计出可用于扩增大黄鱼IFNG基因第一内含子SSR序列的扩增引物。
文档编号C12N15/10GK101974517SQ20101051770
公开日2011年2月16日 申请日期2010年10月22日 优先权日2010年10月22日
发明者丁少雄, 曾华嵩, 王军, 苏永全, 蒋秋芬 申请人:厦门大学