专利名称：抑制植物病毒的人工miRNA及其构建和用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术和植物学领域；更具体地，本发明涉及抑制植物病毒的人工 miRNA及其构建和用途。
背景技术：
白菜类蔬菜主要包括结球类大白菜(Brassica campestris L. ssp. pekinensis) 禾口不结球类小白菜(Brassica campestris L. ssp. chinensis)。小白菜简称青菜，北方称油菜，其适应性强，生长快，产量高，营养好，消费量居各类蔬菜之首，是我国长江流域各省普遍栽培的一种大众化蔬菜。小白菜种类和品种繁多，生长期短，适应性广，高产，省工，易种，可周年生产供应。产品鲜嫩、营养丰富，为广大消费者所喜爱。其年产量占蔬菜总产量的30%-40%，对补充蔬菜淡季、实现周年均衡供应贡献很大。大白菜和小白菜特性都为喜凉性，一年四季均可生产，生长最适温度为15 20°C。近年来，为了适应市场的需要，集约栽培是白菜类蔬菜生产的主要特点。为了保证白菜类蔬菜一年四季的均衡生产和供应，小白菜常需一年四季采用不同的方式进行生产。十字花科蔬菜中，大白菜、小白菜、油菜、萝卜、甘蓝等都可受病毒侵染，造成病毒病，其中大白菜病毒病是白菜类蔬菜危害最严重的三大病害之一。能够侵染大白菜并导致严重病毒病害发生的主要病原病毒有三种，即芜菁花叶病毒(TuMV，Turnip mosaic virus.)、黄瓜花叶病毒(CMV，Cucumber mosaic virus.)和烟草花叶病毒(TMV，Tobacco mosaic virus.)。TuMV是一种曲线条状病毒，长680_750nm，在十字花科蔬菜以及菠菜、芥菜等蔬菜和杂草上都可存在，它的体外存活期只有2-4天，稀释终点为1000-10000倍，致死温度55-60°C。在幼苗中的潜育期受温度影响，偏低时潜育期长，偏高时潜育期短，在9-14 天之间，靠蚜虫作介体进行汁液传播。在华北和东北地区，当露地没有白菜和其他寄主生长时，窖藏的白菜及其他十字花科蔬菜以及它们的种株上可以有病毒继续存在，成为第二年春暖花开季节菜田的初侵染来源。有温室及塑料大棚的地区，则成为病毒随越冬寄主循环传播的初侵染来源。四季常青的南方地区，病毒不存在越冬问题，一年四季循环侵染。以往主要在春冬季生产小白菜，开始在较炎热的夏秋季采取各种栽培方式种植小白菜，无疑在其生育期内，尤其是春末、夏季和早秋往往会受到病毒病的侵害。高温季节栽培小白菜在 20天以后即可分批上市，但高温障碍往往使小白菜植株产生病毒病，常常导致产量低、品质差，市场价格上扬，供不应求，不能满足居民的消费需求。大白菜和小白菜原产我国，国外对白菜类蔬菜的育种研究较少，从日本、韩国及我国台湾地区引进的品种抗病性差，不适宜在我国夏季生长和推广。国内所选育的品种主要为秋季栽培品种，白菜类蔬菜抗病毒病基因库窄，抗病白菜品种选育仅局限于白菜材料之间的筛选，选出的品种抗病性不够理想。鉴于上述情况，我国育种家采用传统的育种方法广泛开展抗病白菜类蔬菜品种的选育工作，引进抗病基因，扩大资源来源途径，一定程度提高了白菜类蔬菜抗病能力，在生产上已经发挥了作用。然而，病毒本身变异性强，地域性不同会产生许多新的生理小种，以前推出的抗病品种在一定程度上丧失抗病性。且有地域性限制，不能将耐病品种广泛推广到其他地区。因此对白菜类蔬菜病毒病症状的发生发展变化规律进行深入的研究，建立易于操作，结果稳定，效率较高的具有广泛推广性的抗病毒病筛选方法和技术是白菜类蔬菜抗病育种工作亟需解决任务。与白菜抗病密切相关的性状属于数量性状，对其数量性状的基因型进行选择是非常困难的。针对分子育种，这种难度不仅表现在可利用与辅助选择的DNA标记不多，且QTL(Quantitative Traits Loci，数量性状位点)在数目和作用上变化较大。因此，在白菜基因组测序工作尚未完成，功能基因组研究方兴未艾的情况下，遗传育种学家需要寻找一种快速、敏感、高效的，在植株水平上各性状和 DNA定性分析技术，以及植株水平上表型和基因表达变化的定量分析技术，用以白菜类蔬菜抗病育种研究。近年来分子生物学研究发展迅速，基因工程技术是20世纪90年代中期以来影响最为深远的重大科技进展之一，是融微电子学、生物学、物理学、化学、计算机科学为一体的高度交叉的新技术。目前，基因技术已广泛应用于药物筛选、农业、疾病诊断和治疗、中药物种鉴定、司法鉴定、食品卫生监督、环境检测、国防等许多领域。关于基因技术在植物中应用的报道并不少，主要集中在拟南芥、草莓、牵牛花等方面。植物病毒病的种类很多，分布很广，对农作物的危害严重。通常，植物病毒病的症状是植株形态异常，植物生长和发育呈现系统性受阻。以大白菜为例，幼苗期受害时，心叶初期产生明脉，病叶皱缩变脆、扭曲畸形，重病株明显矮缩，不包心，叶片硬脆、皱缩成团，根系不发达。长期以来，病毒是如何造成植物的系统性侵染一直是困扰植物保护学家的科学难题。有趣的是，这些病毒病症状与模式植物拟南芥dicer-likel (dell)、hyponastic leaves (hyll)、serrate (se)和agonautel (agol)等突变体的表型非常相似。在高等植物中，DCL1、HYL1和SE蛋白参与miRNA的生物加工，AGOl蛋白是基因沉默(gene silencing) 的关键蛋白。这些蛋白的功能是保持植物体内的基因沉默反应，保证植物正常的生长发育。基因缺失或突变都会影响下游靶基因的沉默反应，引起类似于植物病毒病症状的形态反应。一般情况下，正常的植物基因沉默具有抗病毒和减轻病毒危害的作用。近年来的研究发现，病毒病症状与miRNA合成途径突变体的相似性在分子水平上是有联系的。在病毒基因组中存在着RNA沉默的抑制子(suppressor)，该抑制子会干扰植物DCLl、HYLl、SE或 AGOl蛋白或有关miRNA的功能，使植物基因沉默途径受损，并引起一系列形态反应。miRNA (21是基因组和蛋白质组之间的信使分子，在生物体内行使多种调控功能。在植物中，miRNA主要参与基因组稳定化、基因沉默和生物防卫等过程。在DCL1、 HYLl和HEm的共同作用下，前体miRNA(pre-miRNA)经剪切加工产生成熟的miRNA，而成熟的 miRNA 在 RISC(miRNP/RNA-induced silencing complex, miRNP/RISC)作用下可以与靶基因mRNA上的互补序列相结合，使靶基因mRNA降解而抑制其表达。AGOl蛋白参与RISC 沉默复合体的作用过程。最新的统计数据表明，拟南芥有46个miRNA家族和117个miRNA。随着miRNA诊断技术的提高，还将有新的miRNA被不断发现。在植物体内，pre-miRNA经剪切加工产生成熟的miRNA，而后者以序列互补的方式降解靶基因的mRNA。利用植物miRNA加工的特性，有些实验室构建了抗病毒病的人工miRNA 载体。其原理是，将植物pre-miRNA序列中内源的成熟miRNA用病毒的沉默抑制子(如Pl/HC-Pro)片段取而代之，构建pre-miRNA的基因表达载体，在农杆菌的介导下转入植物，在植物体内产生人工miRNA，降解病毒基因沉默抑制子的mRNA，解除病毒基因沉默抑制子对植物基因沉默的阻断作用，以达到病毒病症状无法出现的目的。这种抗病毒病的新策略在植物抗病育种中有广阔的应用前景。2006年，Niu等利用Pl/HC-Pro的pre-miR165载体创建了拟南芥的转基因植物，使Pl/HC-Pro人工miRNA成功表达[Niu，Q. W. ,Lin, S. S.，Reyes， J. L. , Chen, K. C. , Wu, H. W. , Yeh, S. D. and Chua, N. H. (2006) Expression of artificial microRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus resistance. Nat Biotechnol，24，1420-1428]。该 miRNA 引起 Pl/HC-Pro 的 mRNA 降解，所筛选的植株对某些TuMV和TYMV病毒的株系表现出较强的抗性。目前，人工miRNA抗病毒病的研究还停留在模式植物拟南芥上，而且抗病毒的对象限制在一些病毒的美洲株系。另一方面，影响人工 miRNA生物加工、成熟和靶基因沉默的因素很多，需要对整个人工miRNA体系进行改进和优化，以提高转基因植物抗病毒病的效率。更重要的是，如何将人工miRNA体系应用于农作物和经济作物，使之成为植物抗病育种的有效途径。长期以来，育种学家通过有性杂交的方法培育抗病毒性状的优良品种，而栽培学家为了生产优质蔬菜产品设法减轻病毒病的危害。然而，由于学科发展水平和研究手段的制约，也由于病毒病症状复杂的遗传现象，人们很难依据传统的遗传学理论来判断这些症状的遗传规律。反映在育种实践上，育种学家常常被复杂的抗病毒机制所困扰。要提高大白菜抗病毒育种的进度，培育新一代抗病品种，就必须发展新的抗病毒育种新技术。
发明内容
本发明的目的在于提供抑制植物病毒的人工miRNA及其构建和用途。在本发明的第一方面，提供一种分离的或人工构建的寡核苷酸，所述的寡核苷酸选自(i)SEQ ID NO =I-SEQ ID NO 4任一所示序列的寡核苷酸；或(ii)与(i)限定的任一序列互补的寡核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种构建物，所述的构建物含有所述的寡核苷酸，且其在导入植物细胞、组织或器官后，能够表达所述的寡核苷酸所对应的miRNA。在另一优选例中，所述构建物中含有选自SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3的序列(对应于黄瓜花叶病毒(CMV))；和选自SEQ ID NO 2或SEQ ID NO 4的序列(对应于芜菁花叶病毒(TuMV))。在另一优选例中，所述的构建物是表达载体。在另一优选例中，所述的表达载体是pBSK载体。在另一优选例中，所述的构建物含有至少一组式I所示的结构Seq 正向-X-Seq 反向式I;式I 中，Seq正自为所述的寡核苷酸序列；Seqfi^1为与Seq正自基本上互补的寡核苷酸序列；X为位于Seqg之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seqtt* Seq反向不互补。
在另一优选例中，式I所示的结构在转入植物细胞后，形成式II所示的二级结构
权利要求
1.一种分离的或人工构建的寡核苷酸，所述的寡核苷酸选自 (i)SEQ ID NO =I-SEQ ID NO :4任一所示序列的寡核苷酸；或 ( )与(i)限定的任一序列互补的寡核苷酸。
2.—种构建物，所述的构建物含有权利要求1所述的寡核苷酸，且其在导入植物细胞、 组织或器官后，能够表达权利要求1所述的寡核苷酸所对应的miRNA。
3.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述构建物中含有 选自SEQ ID NO :1或SEQ ID NO 3的序列；禾口选自 SEQ ID NO 2 或 SEQ ID NO 4 的序列。
4.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述的构建物是表达载体。
5.如权利要求2所述的构建物，其特征在于，所述的构建物含有至少一组式I所示的结构Seq正向 _X_Seq反向 ζ I ;式I中，为权利要求1所述的寡核苷酸序列； Seqfi^1为与Mq1^1基本上互补的寡核苷酸序列；X为位于Seqg之间的间隔序列，并且所述间隔序列与不互补。
6.如权利要求5所述的构建物，其特征在于，式I所示的结构在转入植物细胞后，形成式II所示的二级结构Seq正向一^^ι!X式 II，Seq反向式II中，SeqM、Seq反向和X的定义如上述， I表示在^(^自和间的基本上互补的关系。
7.权利要求1所述的寡核苷酸或权利要求2-6任一项所述的构建物的用途，用于制备抗病毒的试剂；或用于制备提高植物抗病毒能力的试剂。
8.一种提高植物抗病毒能力的方法，其特征在于，所述的方法包括步骤(a)提供权利要求2-6所述的任一构建物；(b)将(a)中所述的构建物导入到植物中。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的将构建物导入到植物的方法包括(1)提供携带权利要求2-6所述的任一构建物的农杆菌；(2)将植物细胞或组织或器官与步骤(1)中的农杆菌接触，从而使所述的构建物转入植物。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述的病毒是芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus. )或黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus.)。
11.一种 miRNA，其是 SEQ ID NO :37_SEQ ID NO :40 任一所示核苷酸序列的 miRNA。
12.—种植物细胞或组织，其特征在于，它是选自下组(a)用权利要求2-6任一所述的构建物转化或转染的细胞；或(b)含有权利要求13所述的miRNA的细胞。
全文摘要
本发明涉及抑制植物病毒的人工miRNA及其构建和用途。本发明首次根据侵染植物的病毒中基因沉默抑制子的核酸序列，设计出了沉默效果优异的寡核苷酸。这些寡核苷酸导入到植物体内后，在病毒侵染植物时，能够在植物体内形成miRNA，从而特异性结合到病毒基因沉默抑制子的mRNA的相应部位，影响mRNA的转录作用，从而达到抑制病毒的效果。并且，本发明的寡核苷酸是基于比对不同病毒亚型来源的病毒基因沉默抑制子而定位到的最为保守的位置来优化和设计的，基于这些位置设计的寡核苷酸，在导入植物体内后具有较广谱的抗相关病毒的效果。
文档编号C12N5/10GK102559666SQ201010595919
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月18日 优先权日2010年12月18日
发明者何玉科, 孙传宝 申请人:中国科学院上海生命科学研究院