专利名称：一种选育高产芽孢率芽孢杆菌的方法
技术领域：
本发明涉及一种选育芽孢杆菌的方法，具体是一种选育高产芽孢率芽孢杆菌的方法，属于生物技术与生物工程领域。
背景技术：
芽孢杆菌(Bacillaceae)，细菌的一科，能形成芽孢(内生孢子)的杆菌或球菌。 一般为好氧或兼性厌氧，革兰氏染色呈阳性。包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等。在某种环境下，菌体内的结构发生变化，经过前孢子阶段， 形成一个完整的芽孢。芽孢对热、放射线和化学物质等有很强的抵抗力。在化学组成方面， 在芽孢内含有大量营养细胞中不存在的二吡啶羧酸的钙盐；在结构方面，芽孢的原生质外围有三层膜，从内到外是厚的皮层、孢子壳和孢子外膜。在芽孢杆菌属中，对种的划分是以菌体的大小、孢子的形状及其在菌体内的位置、糖的利用及其产物、能否还原硝酸，以及在高浓度的食盐条件下能否生长等为依据。其广泛分布在水、空气和土壤中以及动物肠道等处。代表种是枯草芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、腊状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌等。芽孢杆菌被广泛应用，其中枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌可用于畜牧水产饲料添加剂和水环境净化；苏云芽孢杆菌可用于植物保护，杀灭害虫；巨大芽孢杆菌具有解磷固钾作用用来生产生物有机肥；多粘芽孢杆菌具有固定分子态氮的能力。在加工生产中芽孢杆菌是否能快速大量形成稳定芽孢状态关系整个生产及其后期保存使用的效果，其中高产芽孢率的芽孢杆菌种显得尤其重要，所以采取措施建立一套快速有效的选育高产芽孢率芽孢杆菌的方法是十分必要的。
发明内容
本发明的目的在于提供一种选育高产芽孢率芽孢杆菌的方法。本发明的技术方案根据芽孢的热稳定性特点，采用逐级加热处理后培养的手段， 选育出高产芽孢率的芽孢杆菌，从而能够在发酵生产过程中缩短发酵时间，降低生产成本， 延长成品保存时间，提高使用效果。实现本技术方案，包括以下步骤①芽孢杆菌激活将待选育的芽孢杆菌无菌划线接种于灭菌的固体培养基上， 30 38°C静止培养3 5天；②一级加热处理将①中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于50 60°C的水浴锅中水浴1 他；③一级培养将②中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30 38°C静止培养3 5天；④二级加热处理将③中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于70 80°C的水浴锅中水浴10 60min ；⑤二级培养将④中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30 38°C静止培养3 5天；
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⑥三级加热处理将⑤中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于90 100°C的水浴锅中水浴1 5min ；⑦三级培养与收集将⑥中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30 38°C静止培养5 7天，收集固体培养基上的菌落，得到高产芽孢率芽孢杆菌种；所述灭菌的固体培养基，为同一配方的培养基，其组分按质量百分比计包括牛肉膏0. 30%、氯化钠0. 50%、蛋白胨1.00%、琼脂2. 00%，pH 7. 2 ；其灭菌条件为121°C、 0. llMpa，灭菌 20 30min ；所述芽孢杆菌为能形成芽孢(内生孢子)的杆菌或球菌，包括芽孢杆菌属、芽孢乳杆菌属、梭菌属、脱硫肠状菌属和芽孢八叠球菌属等，优选枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌或丁酸梭菌。本发明的一种选育高产芽孢率芽孢杆菌的方法，具有以下有益效果使用本发明选育出高产芽孢率的芽孢杆菌，能够在发酵生产过程中快速形成芽孢，从而缩短发酵时间，降低生产成本，延长成品保存时间，提高使用效果。而且工艺简单、 成本低廉，具有可操作性强的优点。
具体实施例方式为了更好理解本发明，以下用实施例对本发明作进一步说明。实施例1 ①芽孢杆菌激活将_70°C保存于甘油中枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C静止培养4天；②一级加热处理将①中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于的水浴锅中水浴池；③一级培养将②中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C 静止培养4天；④二级加热处理将③中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于75°C的水浴锅中水浴30min ；⑤二级培养将④中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C 静止培养4天；⑥三级加热处理将⑤中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于95°C的水浴锅中水浴aiiin ；⑦三级培养与收集将⑥中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C静止培养5天后得到高芽孢率的枯草芽孢杆菌(所述灭菌的固体培养基，其组分按质量百分比计包括牛肉膏0. 30%、氯化钠0. 50%、蛋白胨1. 00%、琼脂2. 00%, pH 7.2; 其灭菌条件为121°C、0. llMpa，灭菌25min)；将得到的高芽孢率枯草芽孢杆菌接种于灭菌的液体培养基上(所述灭菌的液体培养基，其组分按质量百分比计包括牛肉膏0. 30%、蛋白胨1. 00%、氯化钠0. 50%、酵母膏0.04%、氯化铁0.02%、碳酸钙0.02%、硫酸锰0.01%，pH 7. 2 ；其灭菌条件为121°C、 0. llMpa，灭菌25min)，30°C、150rpm培养48h后，结晶紫染色油镜观察，96%形成芽孢。实施例2
①芽孢杆菌激活将-70°C保存于甘油中地衣芽孢杆菌(ATCC 11946)无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，37°C静止培养5天；②一级加热处理将①中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于60°C的水浴锅中水浴证；③一级培养将②中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，37°C 静止培养5天；④二级加热处理将③中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于78°C的水浴锅中水浴35min ；⑤二级培养将④中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，37°C 静止培养5天；⑥三级加热处理将⑤中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于96°C的水浴锅中水浴aiiin ；⑦三级培养与收集将⑥中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，37°C静止培养7天后，得到高芽孢率的地衣芽孢杆菌(所述灭菌的固体培养基的配方， 同实施例1的固体培养基)；将该高芽孢率的地衣芽孢杆菌接种于灭菌的液体培养基上(所述灭菌的液体培养基的配方，同实施例1液体培养基)，37°CU50rpm培养7 后，结晶紫染色油镜观察， 94%形成芽孢。实施例3 ①芽孢杆菌激活将-70°C保存于甘油中巨大芽孢杆菌(ATCC 14581)无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C静止培养5天；②一级加热处理将①中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于58°C的水浴锅中水浴证；③一级培养将②中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C 静止培养5天；④二级加热处理将③中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于74°C的水浴锅中水浴40min ；⑤二级培养将④中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C 静止培养5天；⑥三级加热处理将⑤中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于98°C的水浴锅中水浴:3min ；⑦三级培养与收集将⑥中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C静止培养7天后，得到高芽孢率的巨大芽孢杆菌(所述灭菌的固体培养基的配方， 同实施例1的固体培养基)；将该高芽孢率的巨大芽孢杆菌接种于灭菌的液体培养基上(所述灭菌的液体培养基的配方，同实施例1的液体培养基)，30°C、150rpm培养4 后，结晶紫染色油镜观察， 98%形成芽孢。实施例4 ①芽孢杆菌激活将_70°C保存于甘油中凝结芽孢杆菌(ATCC 7050)无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C静止培养5天；②一级加热处理将①中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于60°C的水浴锅中水浴证；③一级培养将②中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C 静止培养5天；④二级加热处理将③中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于78°C的水浴锅中水浴50min ；⑤二级培养将④中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C 静止培养5天；⑥三级加热处理将⑤中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于98°C的水浴锅中水浴^iin ；⑦三级培养与收集将⑥中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C静止培养7天后得到高芽孢率的凝结芽孢杆菌(所述灭菌的固体培养基的配方，同实施例1固体培养基)；将该高芽孢率的凝结芽孢杆菌接种于灭菌的液体培养基上(所述灭菌的液体培养基的配方，同实施例1液体培养基)，30°CU50rpm培养4 后，结晶紫染色油镜观察， 97%形成芽孢。实施例5 ①芽孢杆菌激活将-70°C保存于甘油中蜡样芽孢杆菌(ATCC 14579)无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C静止培养5天；②一级加热处理将①中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于58°C的水浴锅中水浴他；③一级培养将②中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C 静止培养4天；④二级加热处理将③中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于75°C的水浴锅中水浴50min ；⑤二级培养将④中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C 静止培养4天；⑥三级加热处理将⑤中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于97°C的水浴锅中水浴^iin ；⑦三级培养与收集将⑥中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C静止培养6天后得到高芽孢率的蜡样芽孢杆菌(所述灭菌的固体培养基的配方，同实施例1的固体培养基)；将该高芽孢率的蜡样芽孢杆菌接种于灭菌的液体培养基上(所述灭菌的液体培养基的配方，同实施例1固体培养基)，30°CU50rpm培养4 后，结晶紫染色油镜观察， 96%形成芽孢。实施例6 ①芽孢杆菌激活将-70°C保存于甘油中纳豆芽孢杆菌(AS 1. 1086)无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C静止培养5天；
②一级加热处理将①中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于56°C的水浴锅中水浴他；③一级培养将②中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C 静止培养5天；④二级加热处理将③中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于80°C的水浴锅中水浴50min ；⑤二级培养将④中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C 静止培养5天；⑥三级加热处理将⑤中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于98°C的水浴锅中水浴:3min ；⑦三级培养与收集将⑥中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，30°C静止培养7天后得到高芽孢率的纳豆芽孢杆菌(所述灭菌的固体培养基的配方，同实施例1固体培养基)；将该高芽孢率的纳豆芽孢杆菌接种于灭菌的液体培养基上(所述灭菌的液体培养基的配方，同实施例1液体培养基)，30°CU50rpm培养4 后，结晶紫染色油镜观察， 95%形成芽孢。实施例7 ①芽孢杆菌激活将-70°C保存于甘油中丁酸梭菌(ATCC 8260)无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，37 °C静止厌氧培养5天；②一级加热处理将①中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于的水浴锅中水浴证；③一级培养将②中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，37°C 静止厌氧培养5天；④二级加热处理将③中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于75°C的水浴锅中水浴50min ；⑤二级培养将④中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，37°C 静止厌氧培养5天；⑥三级加热处理将⑤中固体培养基上的菌落用无菌生理盐水洗下后装在带硅胶塞的无菌试管中，置于98°C的水浴锅中水浴^iin ；⑦三级培养与收集将⑥中试管里的菌悬液无菌划线接种于灭菌的固体培养基上，37°C静止厌氧培养7天后得到高芽孢率的丁酸梭菌(所述灭菌的固体培养基的配方，同实施例1固体培养基)；将该高芽孢率的丁酸梭菌接种于灭菌的液体培养基上(所述灭菌的液体培养基的配方，同实施例1液体培养基)，37°C、静止厌氧培养4 后，结晶紫染色油镜观察，98%形成芽孢。
权利要求
1.一种选育高产芽孢率芽孢杆菌的方法，其特征在于采用逐级加热处理后培养的手段，选育出高产芽孢率的芽孢杆菌，其步骤包括芽孢杆菌激活、一级加热处理、一级培养、 二级加热处理、二级培养、三级加热处理、三级培养与收集；所述一级加热处理，其加热条件为50 60°C的水浴加热1 他；所述二级加热处理，其加热条件为70 80°C的水浴加热10 60min ；所述三级加热处理，其加热条件为90 100°C的水浴加热1 5min。
2.根据权利要求1所述的一种选育高产芽孢率芽孢杆菌的方法，其特征在于所述一级培养的培养条件为30 38°C静止培养3 5天；所述二级培养的培养条件为30 38°C静止培养3 5天；所述三级培养的培养条件为30 38°C静止培养5 7天。
3.根据权利要求1所述的一种选育高产芽孢率芽孢杆菌的方法，其特征在于所述芽孢杆菌激活的培养条件为30 38°C静止培养3 5天。
4.根据权利要求1 3中任一权利要求所述的一种选育高产芽孢率芽孢杆菌的方法， 其特征在于一级培养、二级培养和三级培养中所用的固体培养基为同一配方的培养基，该培养基含有以重量百分比计的下述组份牛肉膏0. 30%、氯化钠0. 50%、蛋白胨1.00%、琼月旨 2. 00%, pH 7. 2。
5.根据权利要求4所述的一种选育高产芽孢率芽孢杆菌的方法，其特征在于所述固体培养基的灭菌条件为121°C、0. llMpa，灭菌20 30min。
6.根据权利要求1所述的一种选育高产芽孢率芽孢杆菌的方法，其特征在于所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌或丁酸梭菌。
全文摘要
本发明公开了一种选育高产芽孢率芽孢杆菌的方法，该方法是根据芽孢的热稳定性特点，采用逐级加热处理后培养的手段，选育出高产芽孢率的芽孢杆菌。其步骤包括芽孢杆菌激活、一级加热处理、一级培养、二级加热处理、二级培养、三级加热处理、三级培养与收集。所述一级加热处理，其加热条件为50～60℃的水浴加热1～6h；所述二级加热处理，其加热条件为70～80℃的水浴加热10～60min；所述三级加热处理，其加热条件为90～100℃的水浴加热1～5min。该芽孢杆菌能够在发酵生产过程中快速形成芽孢，从而缩短发酵时间，降低生产成本，延长成品的保存时间，提高使用效果。而且工艺简单、成本低廉，具有可操作性强的优点。
文档编号C12R1/125GK102181389SQ201110066748
公开日2011年9月14日 申请日期2011年3月18日 优先权日2011年3月18日
发明者吴俊罡, 崔京春, 张献, 郭海勇 申请人:大连民族学院