专利名称：一种磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1, 3-甘油二酯的方法
技术领域：
本发明涉及结构特异性化合物的制备方法，尤其涉及一种磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1，3-甘油二酯的方法。
背景技术：
1，3-甘油二酯是天然食用油脂(甘油三酯)的结构类似物，其口感、外观均与前者一致，但在人体内的代谢吸收方式不同甘油三酯经消化酶消化后生成单甘酯和游离脂肪酸，二者吸收进入血液后，很大部分重新合成甘油三酯而增加血脂或造成脂肪积累。而1， 3-甘油二酯经消化酶作用后生成甘油和游离脂肪酸，甘油经丙酮酸进入TCA循环，游离脂肪酸被运往肝脏进行氧化。因此，食用含有1，3-甘油二酯的油脂具有降低脂肪积累、 防止体重增加的效果。天然存在的1，3-甘油二酯很少，因而其人工合成尤显重要。鉴于1，3-甘油二酯主要用作健康食用油脂，其合成过程中必须尽量避免酸、碱、有机溶剂等有害成分的参与以及高温、高压等苛刻条件对产品口感、外观的不良影响，因而适宜利用脂肪酶的区域选择性在无溶剂条件下由甘油和高级脂肪酸直接酯化是来合成高纯度的1，3-甘油二酯。已有利用游离脂肪酶催化合成1，3-甘油二酯的报道[孟祥河，邹冬芽，段作营等.无锡轻工大学学报，2005, 23(2) 31-35 ]。但是无溶剂合成1，3-甘油二酯的反应为高黏度非均相体系，这造成了脂肪酶在应用中活力低、稳定性差、回收重复利用困难的问题。本实验室曾采用表面修饰的疏水硅藻土为载体采用多种方法对Arthrobacter sp.脂肪酶进行固定化，发现通过疏水修饰脂肪酶的活力有显著提高[Yang G, Wu J-P, Xu G, et al. Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2008，2009，57(1-4): 96-103 ]。此外，磁性材料为酶在高黏度体系中的回收重复利用提供了方便，刘薇等以磁性基质固定化的脂肪酶，具有出很好的分离效果[刘薇，白姝，孙彦.过程工程学报，2004，4(4): 362-366.]。为了同时解决脂肪酶在高粘度非均相体系中的若干问题，我们尝试将疏水性修饰聚合物及磁性基质结合起来，对脂肪酶进行固定化。目前，尚无将疏水性磁性多孔聚合物固定化脂肪酶应用于无溶剂体系中1，3-甘油二酯合成的尝试的报道。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1，3-甘油二酯的方法。磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1，3-甘油二酯的方法包括如下步骤
1)向200 mL无氧水中加入0. 20 0. 30 mo 1三价铁盐和0. 10 0· 15 mol 二价铁盐，超声处理20 30 min;升温至65 90 °C，在800 1 200 rpm搅拌下,N2鼓泡20 30 min，加入7. 5 10 mL质量分数25 28%的氨水或10 15mL 10 mol/L NaOH，15 30 min后，磁分离，无氧水洗涤至PH = 7 ；
2)加入4.5 9 mL表面活性剂混合，65 90 °C、80(Tl 200 rpm搅拌广2 h，用甲苯洗涤;Γ5次，加入2 15 mL甲苯混合形成磁流体；
3)取70mL的质量比为4飞:3飞:200的NaCl、聚乙烯醇和水，及10 mL的质量比为6 7:1:0. 17 0. 20的疏水性单体、交联剂和环己烷，加入2 15 mL磁流体混合，超声处理 5 15 min, N2鼓泡、800 1 200 rpm搅拌10 15 min，升温至72 77 V并加入引发剂引发聚合，回流3.5 7 h，磁分离，用甲醇洗涤;Γ5次，真空干燥，得到磁性多孔聚合物微球载体；
4)将含有1(T50mg脂肪酶的水溶液与1(T50 mg磁性多孔聚合物微球载体混合， (Γ4 °C、18(T220 rpm搅拌5 12 h，磁分离，冻干8 12 h，得到磁性多孔聚合物固定化脂肪酶；
5)将40 100mg甘油和200 500 mg脂肪酸与10 35 mg 4 A分子筛、10 50 mg脂肪酶混合，在30 40 °C、18(T220 rpm搅拌下反应7 24 h，得到1，3-甘油二酯。所述的二价铁盐为!^eSO4 · 7H20或FeCl2 · 4H20。所述的三价铁盐为FeCl3 · 6H20 或i^2(S04)3*7H20。所述的表面活性剂为油酸或油酸的甲苯溶液。所述的单体为甲基丙烯酸甲酯。所述的所述的交联剂为二乙烯基苯。所述的所述的引发剂为过氧化苯甲酰。所述白勺月旨ISBI为javanicus^ Rhizomucor miehei WL Arthrobacter sp.月旨US|。 的脂肪酸为油酸或油酸与月桂酸、棕榈酸、硬脂酸中一种或几种的混合物。本发明将磁性固定化脂肪酶应用于在无溶剂体系中合成1，3-甘油二酯的反应中，活力及操作稳定性均有显著提高，并且大大方便酶的回收和重复利用，产品纯度高、不含有毒溶剂，具有极大的应用价值。
图1固定化脂肪酶与游离酶反应过程曲线； 图2固定化脂肪酶与游离酶重复利用情况比较；
图3磁性多孔聚合物微球载体固定化酶扫描电子显微镜照片； 图4磁性多孔聚合物微球载体固定化酶X射线晶体衍射图谱。
具体实施例方式磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1，3-甘油二酯的方法包括如下步骤
1)向200mL无氧水中加入0. 20 0. 30 mo 1三价铁盐和0. 10 0· 15 mol 二价铁盐，超声处理20 30 min;升温至65 90 °C，在800 1 200 rpm搅拌下,N2鼓泡20 30 min，加入7. 5 10 mL质量分数25 28%的氨水或10 15mL 10 mol/L NaOH，15 30 min后，磁分离，无氧水洗涤至PH = 7 ；
2)加入4.5 9 mL表面活性剂混合，65 90 °C、80(Tl 200 rpm搅拌广2 h，用甲苯洗涤;Γ5次，加入2 15 mL甲苯混合形成磁流体；
3)取70mL的质量比为4飞:3飞:200的NaCl、聚乙烯醇和水，及10 mL的质量比为6 7:1:0. 17 0. 20的疏水性单体、交联剂和环己烷，加入2 15 mL磁流体混合，超声处理 5 15 min, N2鼓泡、800 1 200 rpm搅拌10 15 min，升温至72 77 V并加入引发剂引发聚合，回流3.5 7 h，磁分离，用甲醇洗涤;Γ5次，真空干燥，得到磁性多孔聚合物微球载体；
4)将含有1(T50mg脂肪酶的水溶液与1(T50 mg磁性多孔聚合物微球载体混合， (Γ4 °C、18(T220 rpm搅拌5 12 h，磁分离，冻干8 12 h，得到磁性多孔聚合物固定化脂肪酶；
5)将40 100mg甘油和200 500 mg脂肪酸与10 35 mg 4 A分子筛、10 50 mg脂肪酶混合，在30 40 °C、18(T220 rpm搅拌下反应7 24 h，得到1，3-甘油二酯。所述的二价铁盐为!^eSO4 · 7H20或FeCl2 · 4H20。所述的三价铁盐为FeCl3 · 6H20 或i^2(S04)3*7H20。所述的表面活性剂为油酸或油酸的甲苯溶液。所述的单体为甲基丙烯酸甲酯。所述的所述的交联剂为二乙烯基苯。所述的所述的引发剂为过氧化苯甲酰。所述白勺月旨ISBI为javanicus^ Rhizomucor miehei WL Arthrobacter sp.月旨US|。 的脂肪酸为油酸或油酸与月桂酸、棕榈酸、硬脂酸中一种或几种的混合物。实施例1
将 3.0 g FeSO4 · 7H20、5.8 g FeCl3 · 6H20 溶于 200 mL 无氧水中超声处理 30 min 使溶液混合均勻，升温至85 °C，在1 000 rpm搅拌下N2鼓泡30 min，快速加入7.5 mL 浓氨水，保持温度、搅拌及N2反应30 min，结束后磁分离所得沉淀并以无氧水洗涤至pH =7 ；
将9 mL油酸的甲苯溶液(体积比1:1)与制得的Fii3O4混合，85 °C、1 000 rpm搅拌 1.5 h，结束后用甲苯洗涤数次除去多余油酸，所得产物即油酸包覆的！^e3O4，与2 mL甲苯混合得磁流体；
将 1.67 g NaClU. 33 g PVA 溶于 67 mL 去离子水中，将 6.7 mL MMAU. 0 mL DVB 溶于1.3 mL环己烷中，将上述两溶液与磁流体混合，超声处理15 min，再在室温下N2鼓泡、1 000 rpm搅拌混合15 min，而后升温至75 V并加入0.17 g BPO引发聚合，回流 5 h后磁分离所得产物，以甲醇洗涤数次后真空干燥，得磁性多孔聚合物微球载体；
4 0C下，将1. 5 mg Mucor javanicus脂肪酶粗酶粉溶于200 μ L pH = 8磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入10 mg载体，在冰浴中200 rpm搅拌一定8 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥过夜即为固定化酶；
400 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应12 h，转化率达到89%，目标产物含量 80% (质量分数)；
采用气象色谱内标法计算产物生成量及底物消耗量，三月桂酸甘油酯为底物，以每分钟催化消耗1 ymol油酸所需的酶量(或固定化酶量)为一个酯化活力单位(UE， μπιο ^min1),每克蛋白所具有的酯化活力即为酯化比活。游离酶比活为0.108 U· (g蛋白)S固定化酶酯化比活为游离酶的45倍，固定化酶经磁性分离回收可重复使用30次。实施例2
将 3. 0 g FeSO4 · 7H20、5. 6 g Fe2 (SO4) 3 · 6H20 溶于 200 mL 无氧水中超声处理 30 min使溶液混合均勻，升温至85 °C，在1 000 rpm搅拌下队鼓泡30 min，快速加入10 mL 10 M NaOH，保持温度、搅拌及N2反应30 min，结束后磁分离所得沉淀并以无氧水洗涤至 PH = 7 ；
将4.5 mL油酸与制得的！^e3O4混合，85 °C、1 000 rpm搅拌1.5 h，结束后用甲苯洗涤数次除去多余油酸，所得产物即油酸包覆的！^e3O4，与2 mL甲苯混合得磁流体；
将 1.67 g NaClU. 33 g PVA 溶于 67 mL 去离子水中，将 6.7 mL MMAU. 0 mL DVB 溶于1.3 mL环己烷中，将上述两溶液与磁流体混合，超声处理15 min，再在室温下N2鼓泡、1 000 rpm搅拌混合15 min，而后升温至75 V并加入0.17 g BPO引发聚合，回流 5 h后磁分离所得产物，以甲醇洗涤数次后真空干燥，得磁性多孔聚合物微球载体；
4 0C下，将1. 5 mg Mucor javanicus脂肪酶粗酶粉溶于200 μ L pH = 8磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入10 mg载体，在冰浴中200 rpm搅拌一定8 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥过夜即为固定化酶；
400 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应12 h，转化率达到87%，目标产物含量 80% (质量分数)。实施例3
将 2. 2 g FeCl3 · 4H20、5. 8 g FeCl3 · 6H20 溶于 200 mL 无氧水中超声处理 30 min 使溶液混合均勻，升温至85 °C，在1 000 rpm搅拌下N2鼓泡30 min，快速加入7.5 mL 浓氨水，保持温度、搅拌及N2反应30 min，结束后磁分离所得沉淀并以无氧水洗涤至pH =7 ；
将4.5 mL油酸与制得的！^e3O4混合，85 °C、1 000 rpm搅拌1.5 h，结束后用甲苯洗涤数次除去多余油酸，所得产物即油酸包覆的！^e3O4，与2 mL甲苯混合得磁流体；
将 1.67 g NaClU. 33 g PVA 溶于 67 mL 去离子水中，将 6.7 mL MMAU. 0 mL DVB 溶于1.3 mL环己烷中，将上述两溶液与磁流体混合，超声处理15 min，再在室温下N2鼓泡、1 000 rpm搅拌混合15 min，而后升温至75 V并加入0.17 g BPO引发聚合，回流 5 h后磁分离所得产物，以甲醇洗涤数次后真空干燥，得磁性多孔聚合物微球载体；
4 0C下，将1. 5 mg Mucor javanicus脂肪酶粗酶粉溶于200 μ L pH = 8磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入10 mg载体，在冰浴中200 rpm搅拌一定8 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥过夜即为固定化酶；
400 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应12 h，转化率达到87%，目标产物含量 80% (质量分数)。实施例4
将 3.0 g FeSO4 · 7H20、5.8 g FeCl3 · 6H20 溶于 200 mL 无氧水中超声处理 30 min 使溶液混合均勻，升温至85 °C，在1 000 rpm搅拌下N2鼓泡30 min，快速加入7.5 mL 浓氨水，保持温度、搅拌及N2反应30 min，结束后磁分离所得沉淀并以无氧水洗涤至pH =7 ；
将9 mL油酸的甲苯溶液(体积比1:1)与制得的Fii3O4混合，85 °C、1 000 rpm搅拌 1.5 h，结束后用甲苯洗涤数次除去多余油酸，所得产物即油酸包覆的！^e3O4，与2 mL甲苯混合得磁流体；
将 1.67 g NaClU. 33 g PVA 溶于 67 mL 去离子水中，将 4 mL MMA,4 mL DVB 溶于 1.3 mL环己烷中，将上述两溶液与磁流体混合，超声处理15 min，再在室温下N2鼓泡、1 000 rpm搅拌混合15 min，而后升温至75 V并加入0.17 g BPO引发聚合，回流5 h 后磁分离所得产物，以甲醇洗涤数次后真空干燥，得磁性多孔聚合物微球载体；
4 0C下，将1. 5 mg Mucor javanicus脂肪酶粗酶粉溶于200 μ L pH = 8磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入10 mg载体，在冰浴中200 rpm搅拌一定8 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥过夜即为固定化酶；
400 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应12 h，转化率达到87%，目标产物含量 80% (质量分数)。实施例5
将 3.0 g FeSO4 · 7H20、5.8 g FeCl3 · 6H20 溶于 200 mL 无氧水中超声处理 30 min 使溶液混合均勻，升温至85 °C，在1 000 rpm搅拌下N2鼓泡30 min，快速加入7.5 mL 浓氨水，保持温度、搅拌及N2反应30 min，结束后磁分离所得沉淀并以无氧水洗涤至pH =7 ；
将9 mL油酸的甲苯溶液(体积比1:1)与制得的Fii3O4混合，85 °C、1 000 rpm搅拌 1.5 h，结束后用甲苯洗涤数次除去多余油酸，所得产物即油酸包覆的！^e3O4，与2 mL甲苯混合得磁流体；
将 1.67 g NaClU. 33 g PVA 溶于 67 mL 去离子水中，将 6 mL MMA,3 mL DVB 溶于 1.3 mL环己烷中，将上述两溶液与磁流体混合，超声处理15 min，再在室温下N2鼓泡、1 000 rpm搅拌混合15 min，而后升温至75 V并加入0.17 g BPO引发聚合，回流5 h 后磁分离所得产物，以甲醇洗涤数次后真空干燥，得磁性多孔聚合物微球载体；
4 0C下，将1. 5 mg Mucor javanicus脂肪酶粗酶粉溶于200 μ L pH = 8磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入10 mg载体，在冰浴中200 rpm搅拌一定8 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥过夜即为固定化酶；
400 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应12 h，转化率达到87%，目标产物含量 80% (质量分数)。实施例6
油酸0.400，甘油0.080，分子筛2 3粒，酶0.010，反应12 h ；
将 3.0 g FeSO4 · 7H20、5.8 g FeCl3 · 6H20 溶于 200 mL 无氧水中超声处理 30 min 使溶液混合均勻，升温至85 °C，在1 000 rpm搅拌下队鼓泡30 min，保持温度、搅拌及 N2条件下在30 min内逐滴加入10 mL 10 M NaOH，结束后磁分离所得沉淀并以无氧水洗涤至pH = 7 ；
将9 mL油酸的甲苯溶液(体积比1:1)与制得的Fii3O4混合，85 °C、1 000 rpm搅拌 1.5 h，结束后用甲苯洗涤数次除去多余油酸，所得产物即油酸包覆的！^e3O4，与2 mL甲苯混合得磁流体；
将 1.67 g NaClU. 33 g PVA 溶于 67 mL 去离子水中，将 4 mL MMA,4 mL DVB 溶于 1.3 mL环己烷中，将上述两溶液与磁流体混合，超声处理15 min，再在室温下N2鼓泡、1 000 rpm搅拌混合15 min，而后升温至75 V并加入0.17 g BPO引发聚合，回流5 h 后磁分离所得产物，以甲醇洗涤数次后真空干燥，得磁性多孔聚合物微球载体；
4 0C下，将1. 5 mg Mucor javanicus脂肪酶粗酶粉溶于200 μ L pH = 8磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入10 mg载体，在冰浴中200 rpm搅拌一定8 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥过夜即为固定化酶；
400 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应12 h，转化率达到87%，目标产物含量 80% (质量分数)。实施例7
将 3.0 g FeSO4 · 7H20、5.8 g FeCl3 · 6H20 溶于 200 mL 无氧水中超声处理 30 min 使溶液混合均勻，升温至85 °C，在1 000 rpm搅拌下N2鼓泡30 min，快速加入7.5 mL 浓氨水，保持温度、搅拌及N2反应30 min，结束后磁分离所得沉淀并以无氧水洗涤至pH =7 ；
将9 mL油酸的甲苯溶液(体积比1:1)与制得的Fii3O4混合，85 °C、1 000 rpm搅拌 1.5 h，结束后用甲苯洗涤数次除去多余油酸，所得产物即油酸包覆的！^e3O4，与2 mL甲苯混合得磁流体；
将 1.67 g NaClU. 33 g PVA 溶于 67 mL 去离子水中，将 6.7 mL MMAU. 0 mL DVB 溶于1.3 mL环己烷中，将上述两溶液与磁流体混合，超声处理15 min，再在室温下N2鼓泡、1 000 rpm搅拌混合15 min，而后升温至75 V并加入0.17 g BPO引发聚合，回流 5 h后磁分离所得产物，以甲醇洗涤数次后真空干燥，得磁性多孔聚合物微球载体；
4 0C下，将1. 5 mg Mucor javanicus脂肪酶粗酶粉溶于200 μ L pH = 8磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入10 mg载体，在冰浴中200 rpm搅拌一定8 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥过夜即为固定化酶；
1.00 g油酸、0.20 g甘油、0. 10 g固定化酶与0.64 g 4 A分子筛加入20 mL反应瓶中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应7 h，转化率达到85%，目标产物含量75%以上(质量分数)。实施例8
将 3.0 g FeSO4 · 7H20、5.8 g FeCl3 · 6H20 溶于 200 mL 无氧水中超声处理 30 min 使溶液混合均勻，升温至85 °C，在1 000 rpm搅拌下N2鼓泡30 min，快速加入7.5 mL 浓氨水，保持温度、搅拌及N2反应30 min，结束后磁分离所得沉淀并以无氧水洗涤至pH =7 ；
将9 mL油酸的甲苯溶液(体积比1:1)与制得的Fii3O4混合，85 °C、1 000 rpm搅拌 1.5 h，结束后用甲苯洗涤数次除去多余油酸，所得产物即油酸包覆的！^e3O4，与2 mL甲苯混合得磁流体；将 1.67 g NaClU. 33 g PVA 溶于 67 mL 去离子水中，将 6.7 mL MMAU. 0 mL DVB 溶于1.3 mL环己烷中，将上述两溶液与磁流体混合，超声处理15 min，再在室温下N2鼓泡、1 000 rpm搅拌混合15 min，而后升温至75 V并加入0.17 g BPO引发聚合，回流 5 h后磁分离所得产物，以甲醇洗涤数次后真空干燥，得磁性多孔聚合物微球载体；
4 0C下，将1. 5 mg Mucor javanicus脂肪酶粗酶粉溶于200 μ L pH = 8磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入10 mg载体，在冰浴中200 rpm搅拌一定8 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥过夜即为固定化酶；
1.00 g油酸、0. 13 g甘油、0. 10 g固定化酶与0.64 g 4 A分子筛加入20 mL反应瓶中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应7 h，转化率达到87%，目标产物含量75% (质量分数)。实施例9
将 3.0 g FeSO4 · 7H20、5.8 g FeCl3 · 6H20 溶于 200 mL 无氧水中超声处理 30 min 使溶液混合均勻，升温至85 °C，在1 000 rpm搅拌下N2鼓泡30 min，快速加入7.5 mL 浓氨水，保持温度、搅拌及N2反应30 min，结束后磁分离所得沉淀并以无氧水洗涤至pH =7 ；
将9 mL油酸的甲苯溶液(体积比1:1)与制得的Fii3O4混合，85 °C、1 000 rpm搅拌 1.5 h，结束后用甲苯洗涤数次除去多余油酸，所得产物即油酸包覆的！^e3O4，与2 mL甲苯混合得磁流体；
将 1.67 g NaClU. 33 g PVA 溶于 67 mL 去离子水中，将 6.7 mL MMAU. 0 mL DVB 溶于1.3 mL环己烷中，将上述两溶液与磁流体混合，超声处理15 min，再在室温下N2鼓泡、1 000 rpm搅拌混合15 min，而后升温至75 V并加入0.17 g BPO引发聚合，回流 5 h后磁分离所得产物，以甲醇洗涤数次后真空干燥，得磁性多孔聚合物微球载体；
4 "C下，将1.5 mg Rhizomucor miehei脂肪酶粗酶粉溶于200 μ L pH = 8磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入10 mg载体，在冰浴中200 rpm搅拌一定8 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥过夜即为固定化酶；
200 mg油酸、40 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应M h，转化率达到80%，目标产物含量 70% (质量分数)。实施例10
将 3.0 g FeSO4 · 7H20、5.8 g FeCl3 · 6H20 溶于 200 mL 无氧水中超声处理 30 min 使溶液混合均勻，升温至85 °C，在1 000 rpm搅拌下N2鼓泡30 min，快速加入7.5 mL 浓氨水，保持温度、搅拌及N2反应30 min，结束后磁分离所得沉淀并以无氧水洗涤至pH =7 ；
将9 mL油酸的甲苯溶液(体积比1:1)与制得的Fii3O4混合，85 °C、1 000 rpm搅拌 1.5 h，结束后用甲苯洗涤数次除去多余油酸，所得产物即油酸包覆的！^e3O4，与2 mL甲苯混合得磁流体；
将 1.67 g NaClU. 33 g PVA 溶于 67 mL 去离子水中，将 6.7 mL MMAU. 0 mL DVB溶于1.3 mL环己烷中，将上述两溶液与磁流体混合，超声处理15 min，再在室温下N2鼓泡、1 000 rpm搅拌混合15 min，而后升温至75 V并加入0.17 g BPO引发聚合，回流 5 h后磁分离所得产物，以甲醇洗涤数次后真空干燥，得磁性多孔聚合物微球载体；
4 0C下，将1.5 mg Arthrobacter sp.脂肪酶粗酶粉溶于200 μ L pH = 8磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入10 mg载体，在冰浴中200 rpm搅拌一定8 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥过夜即为固定化酶；
200 mg油酸、40 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应M h，转化率达到70%，目标产物含量 50%以上(质量分数)。
实施例11
将 3.0 g FeSO4 · 7H20、5.8 g FeCl3 · 6H20 溶于 200 mL 无氧水中超声处理 30 min 使溶液混合均勻，升温至85 °C，在1 000 rpm搅拌下N2鼓泡30 min，快速加入7.5 mL 浓氨水，保持温度、搅拌及N2反应30 min，结束后磁分离所得沉淀并以无氧水洗涤至pH =7 ；
将9 mL油酸的甲苯溶液(体积比1:1)与制得的Fii3O4混合，85 °C、1 000 rpm搅拌 1.5 h，结束后用甲苯洗涤数次除去多余油酸，所得产物即油酸包覆的！^e3O4，与2 mL甲苯混合得磁流体；
将 1.67 g NaClU. 33 g PVA 溶于 67 mL 去离子水中，将 6.7 mL MMAU. 0 mL DVB 溶于1.3 mL环己烷中，将上述两溶液与磁流体混合，超声处理15 min，再在室温下N2鼓泡、1 000 rpm搅拌混合15 min，而后升温至75 V并加入0.17 g BPO引发聚合，回流 5 h后磁分离所得产物，以甲醇洗涤数次后真空干燥，得磁性多孔聚合物微球载体；
4 0C下，将0. 5 mg Mucor javanicus脂肪酶粗酶粉溶于200 μ L pH = 7磷酸缓冲液，漩涡振荡混合90 s,4 0C >12 000 rpm离心5 min，弃去沉淀，加入10 mg载体，在冰浴中200 rpm搅拌一定8 h。结束后在冰浴中进行磁分离并以磷酸缓冲液洗涤数次以除去残余蛋白，所得固体冷冻干燥过夜即为固定化酶；
400 mg油酸、80 mg甘油、10 mg固定化酶与10 mg 4 A分子筛加入2 mL离心管中漩涡震荡充分混合，在37 200 rpm搅拌下反应12 h，转化率达到85%，目标产物含量 76% (质量分数)。
权利要求
1.一种磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1，3-甘油二酯的方法，其特征在于包括如下步骤1)向200mL无氧水中加入0. 20 0. 30 mo 1三价铁盐和0. 10 0· 15 mol 二价铁盐，超声处理20 30 min;升温至65 90 °C，在800 1 200 rpm搅拌下,N2鼓泡20 30 min，加入7. 5 10 mL质量分数25 28%的氨水或10 15mL 10 mol/L NaOH，15 30 min后，磁分离，无氧水洗涤至PH = 7 ；2)加入4.5 9 mL表面活性剂混合，65 90 °C、80(Tl 200 rpm搅拌广2 h，用甲苯洗涤;Γ5次，加入2 15 mL甲苯混合形成磁流体；3)取70mL的质量比为4飞:3飞:200的NaCl、聚乙烯醇和水，及10 mL的质量比为6 7:1:0. 17 0. 20的疏水性单体、交联剂和环己烷，加入2 15 mL磁流体混合，超声处理 5 15 min, N2鼓泡、800 1 200 rpm搅拌10 15 min，升温至72 77 V并加入引发剂引发聚合，回流3.5 7 h，磁分离，用甲醇洗涤;Γ5次，真空干燥，得到磁性多孔聚合物微球载体；4)将含有1(T50mg脂肪酶的水溶液与1(T50 mg磁性多孔聚合物微球载体混合， (Γ4 °C、18(T220 rpm搅拌5 12 h，磁分离，冻干8 12 h，得到磁性多孔聚合物固定化脂肪酶；5)将40 100mg甘油和200 500 mg脂肪酸与10 35 mg 4 A分子筛、10 50 mg脂肪酶混合，在30 40 °C、18(T220 rpm搅拌下反应7 24 h，得到1，3-甘油
2.根据权利要求1所述的一种磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1， 方法，其特征在于所述的二价铁盐为!^eSO4 · 7H20或FeCl2 · 4H20。
3.根据权利要求1所述的一种磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1， 方法，其特征在于所述的三价铁盐为FeCl3 · 6H20 ^Fe2(SO4)3 · 7H20。
4.根据权利要求1所述的一种磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1， 方法，其特征在于所述的表面活性剂为油酸或油酸的甲苯溶液。
5.根据权利要求1所述的一种磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1， 方法，其特征在于所述的单体为甲基丙烯酸甲酯。
6.根据权利要求1所述的一种磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1， 方法，其特征在于所述的所述的交联剂为二乙烯基苯。
7.根据权利要求1所述的一种磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1， 方法，其特征在于所述的所述的引发剂为过氧化苯甲酰。
8.根据权利要求1所述的一种磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1，3-甘油二酯的方法，其特征在于所述的脂肪酶为Mucor ja vanicus、Rhizo腿cor miehei或 Arthrobacter sp.月旨肪酶。
9.根据权利要求1所述的一种磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1，3-甘油二酯的方法，其特征在于所述的脂肪酸为油酸或油酸与月桂酸、棕榈酸、硬脂酸中一种或几种的混合物。
全文摘要
本发明公开了一种磁性多孔聚合物固定化脂肪酶制备1,3-甘油二酯的方法，包括如下步骤1)以二价和三价铁盐的混合物共沉淀制备超顺磁性Fe3O4内核，以表面活性剂包覆，并在微粒外表进行悬浮聚合制备多孔聚合物壳层，从而得到磁性多孔聚合物微球载体；2)加入脂肪酶酶溶液，搅拌、洗涤、干燥得到固定化酶；3)采用该固定化酶催化甘油与脂肪酸的酯化反应，得到1,3-甘油二酯。本发明所涉及的固定化脂肪酶在1,3-甘油二酯的合成反应中，活力、操作稳定、区域选择性均显著提高，酶的回收利用操作极大简化，产品纯度高且不含有害溶剂。
文档编号C12N11/08GK102304552SQ20111027957
公开日2012年1月4日 申请日期2011年9月20日 优先权日2011年9月20日
发明者吴坚平, 孟枭, 徐刚, 杨立荣 申请人:浙江大学