专利名称：一种提取大豆种子dna的方法
技术领域：
本发明涉及一种提取大豆种子DNA的方法。
背景技术：
基因组DNA提取是PCR检测、限制性酶切、分子杂交等一切分子生物学研究的基础技术，大豆高质量基因组DNA提取的成功与否关键在于组织材料的来源以及酚类、多糖类等杂质的去除是否彻底。有些情况下，组织材料的来源、部位、形态等外在性质的不同以及化学成分、组织结构等内在特点的差异，在提取基因组DNA时需要选择不同的方法或做一些特殊的处理。传统CTAB方法目前在植物DNA提取中较为常用，且一般选用尽可能新鲜、 幼嫩的组织材料或幼苗，对于大豆而言，若以幼苗为材料，就必须经过浸种催芽、幼苗培养、 液氮研磨等过程，所以，大部分时间耗费在了实验材料的准备中。而传统的SDS法不能有效去除多糖等物质，提取的DNA不纯，含杂质较多。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种提取大豆种子DNA的方法，本方法操作简单，可快速的提取大豆种子基因组DNA，提取的DNA条带清晰，完整性好，纯度高，杂质含量少，可用于PCR检测，PCR特异性产物明显，而且重复性好，可以满足许多分子生物学实验需要。本发明是通过以下技术方案实现的一种提取大豆种子DNA的方法，步骤如下(1)取适量大豆种子，粉碎，待用；(2)取0. Ig左右上述粉末，置于1.5ml离心管中，加入IOOul 20%的SDS溶液(质量百分数)、500ul CTAB提取缓冲液和4ul蛋白酶K，充分混勻后，放入60 65°C恒温水浴锅中消化约60min，期间每IOmin颠倒混勻一次；(3)加 Λ 36ul 5mol/L 的 KAC,混勻，冰浴约 30min, 10000 12000r/min 离心 IOmin ；(4)取上述离心后的上清液，置于另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇(体积比24 1)，轻柔颠倒混勻约IOmin, 10000 12000r/min离心IOmin ；(5)取上述离心后的上清液，沿管壁缓慢旋转加入等体积-20°C预冷的异丙醇，室温下沉淀，10000 12000r/min离心3min ；(6)弃去上述离心后的上清液，用500ul 70%乙醇(体积百分数)洗涤沉淀3次， 即得大豆种子DNA，自然晾干后，加入70ul TE缓冲液溶解沉淀，_20°C冰箱保存。在大豆干种子的基因组DNA提取中，最重要的就是去除蛋白、多糖等杂质，提取过程中的盐浓度对去除多糖很关键，高盐浓度下多糖在液相中非常稳定，不易沉淀。传统SDS 法不能有效去除多糖等物质，提取的DNA含杂质较多。CTAB是一种阳离子去污剂，在高盐 (> 0. 7mol/L)浓度下与核酸形成可溶复合物，一旦降低盐浓度(0. 1 0. 5mol/L NaCl)CTAB-核酸复合物就因溶解度降低而沉淀，因此，传统CTAB方法去除多糖较为干净，但DNA 产率相对低的多。特别在无法及时冷冻保存新鲜样品或直接从干样、种子中提取DNA时，传统CTAB和传统的SDS方法均对高质量DNA的得率和纯度产生或多或少的影响。本发明将 CTAB方法和SDS方法相结合，经实验研究表明，此方法提取的大豆种子DNA条带清晰，完整性好，纯度最高，杂质含量少，且操作简便。以其作为模板对Lectin基因进行PCR检测，特异性产物明显，而且重复性好，可以满足许多分子生物学实验比如PCR检测、限制性酶切、 分子杂交等的需要。
图1为实施例1中大豆种子基因组总DNA的0. 8%琼脂糖凝胶电泳和EB染色示意图。图2为实施例1中CTAB方法提取大豆种子基因组总DNA的0. 8%琼脂糖凝胶电泳和EB染色示意图。图3为实施例3中大豆内源基因Lectin的PCR产物电泳示意图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明。实施例1提取大豆种子基因组总DNA(1)本发明方法步骤如下a)取适量大豆种子，于小型粉碎机中粉碎，成粉末状保存，待用；b)取0. Ig上述粉末，置于1.5ml离心管中，加入IOOul 20%的SDS溶液(质量百分数)、500ulCTAB提取缓冲液和4ul蛋白酶K，充分混勻后，放入65°C恒温水浴锅中消化 60min，期间每IOmin颠倒混勻一次；c)加入 36ul 5mol/L 的 KAC，混勻，冰浴 30min, 10000r/min 离心 IOmin ；d)取上述离心后的上清液，置于另一离心管中，加等体积的氯仿/异戊醇(体积比 24 1)，混勻 IOmin 后，12000r/min 离心 IOmin ；e)取上述离心后的上清液，沿管壁缓慢旋转加入等体积_20°C预冷的异丙醇，室温下沉淀，10000r/min离心!Bmin ；f)弃去上述离心后的上清液，用500ul 70%乙醇(体积百分数)洗涤沉淀3次， 即得大豆种子DNA。g)将上述制得的大豆种子DNA自然晾干后，加入70ul TE缓冲液溶解沉淀，取!Bul 用于0.8%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，结果如图1所示，表明用本发明方法得到的DNA 亮度最高，比较丰富，比较清晰，且无拖尾现象，样品间的重复性也很好，可以佐证本方法提取的总DNA质量很好。(2)传统的CTAB方法步骤如下a)取适量大豆种子，于小型粉碎机中粉碎，成粉末状保存，待用；b)取0. Ig上述粉末，置于1. 5ml离心管中，加入600ul CTAB提取缓冲液和4ul蛋白酶
K，充分混勻后，放入65°C恒温水浴锅中消化60min，期间每IOmin颠倒混勻一次；c)向离心管中加入等体积的iTris饱和酚，颠倒混勻10min，10000r/min离心 IOmin ；d)取上清液，加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(体积比25 24 1)，混勻 IOmin, 10000r/min 离心 IOmin ；e)取上清液，加等体积的氯仿/异戊醇(体积比M 1)，混勻IOmin后IOOOOr/ min 离心 IOmin ；f)取上述离心后的上清液，沿管壁缓慢旋转加入等体积_20°C预冷的异丙醇，室温下沉淀，10000r/min离心!Bmin ；g)弃去上述离心后的上清液，用500ul 70%乙醇(体积百分数)洗涤沉淀3次， 即得大豆种子DNA。h)将上述制得的大豆种子DNA自然晾干后，加入70ul TE缓冲液溶解沉淀，取!Bul 用于0. 8%琼脂糖凝胶电泳检测，EB染色，结果如图2所示，表明CTAB方法提取DNA时，步骤繁琐，抽提次数多，所用时间长，DNA条带较弱，且拖尾严重。结论与传统的CTAB方法相比较，本发明方法提取的DNA有更好的稳定性，不仅提取的总DNA质量很好，而且操作简便， 用时较短。实施例2测定样品基因组总DNA的浓度利用紫外分光光度计检测DNA的浓度和纯度，取待测样品3 μ 1 (实施例1制备)， 用双蒸水稀释至3000μ 1，装进比色皿，放进紫外分光光度计样品室的S架上，分别测定所提取DNA溶液在260nm、280nm时的吸光值，本发明方法提取DNA的吸光值如表1所示，传统的CTAB方法提取DNA的吸光值如表2所示。对于双链DNA，OD260 = 1. 0时溶液浓度为 50 μ g/ml。待测DNA溶液的浓度计算公式为DNA 样品浓度(μ g/μ 1) = OD26tlX 1000 (样品稀释倍数)X 50/1000。纯的DNA溶液的0D26Q/0D280应为1. 8 ；OD260/OD280大于1. 9时，表明有RNA污染；小于1. 6时表明有蛋白质或酚污染。表1本发明方法提取DNA的浓度和纯度检测
权利要求
1. 一种提取大豆种子DNA的方法，其特征在于，步骤如下(1)取适量大豆种子，粉碎，待用；(2)取0.Ig上述粉末，置于1. 5ml离心管中，加入IOOul 20%的SDS溶液、500ul CTAB 提取缓冲液和4ul蛋白酶K，充分混勻后，放入60 65°C恒温水浴锅中消化60min，期间每 IOmin颠倒混勻一次；(3)加入36ul 5mol/L 的 KAC，混勻，冰浴 30min, 10000 12000r/min 离心 IOmin ；(4)取上述离心后的上清液，置于另一离心管中，加入等体积的氯仿/异戊醇，轻柔颠倒混勻 IOmin, 10000 12000r/min 离心 IOmin ；(5)取上述离心后的上清液，沿管壁缓慢旋转加入等体积_20°C预冷的异丙醇，室温下沉淀，10000 12000r/min 离心 3min ；(6)弃去上述离心后的上清液，用500ul70%乙醇洗涤沉淀3次，即得大豆种子DNA。
全文摘要
本发明公开了一种大豆种子中高质量DNA的提取方法，解决了大豆种子基因组总DNA提取多糖去除不彻底、难提取的问题。步骤为取适量大豆种子，粉碎成粉末状；取0.1g大豆样品粉末，加入20％SDS溶液100μl、500μlCTAB提取缓冲液和4μl蛋白酶K，65℃恒温水浴消化60min，每10min颠倒混匀一次；加入36μl 5mol/L KAC，混匀，冰浴30min，离心；取上清，加等体积氯仿/异戊醇，混匀10min，离心；取上清，沿管壁缓慢旋转加入等体积预冷的异丙醇，室温下沉淀，离心；弃上清，70％乙醇洗涤沉淀3次；自然晾干，70μl TE缓冲液溶解沉淀，-20℃冰箱保存。这种方法操作简单、快速，提取的基因组DNA条带清晰，完整性好，纯度最高，杂质含量少，可用于PCR检测，PCR特异性产物明显，重复性好，可以满足许多分子生物学实验需要。
文档编号C12N15/10GK102344922SQ201110320948
公开日2012年2月8日 申请日期2011年10月20日 优先权日2011年10月20日
发明者刘天明, 王存芳 申请人:山东轻工业学院