专利名称：一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法
技术领域：
本发明涉及免疫学及分子生物学领域，具体涉及一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法。
背景技术：
20世纪80年代初，随着分子生物学的发展，人们开始利用基因工程技术生产重组抗体，开辟了抗体在广泛领域里应用的新纪元，其中单链抗体(Single- chainantibody, scFv)的研究令人瞩目。单链抗体是由一条连接肽(linker)将抗体重链可变区％和轻链可变区' 连在一起所形成的单一肽链，通过正确折叠，两个可变区由非共价键可形成具有抗原结合功能的Fv段。由于其制备周期短、可添加各种标签以便纯化、易于基因工程操作等优点，已成为抗体工程研究领域中的热点。目前，针对单链抗体的制备主要通过构建天然库或免疫抗体库，借助噬菌体展示或核糖体展示等技术进行生物淘筛，获得对靶标有亲和力的抗体克隆。但抗体库和表面展示技术是一个复杂的系统，其展示效率难于确定，增加淘筛过程中的盲目性，使得源于杂交瘤细胞的单链抗体制备过程更加复杂低效。另外，在杂交瘤细胞中，常存在源于融合伴侣瘤细胞的假抗体基因或者错误重排的无义基因，如何排除错误基因的干扰，获取正确抗体基因是单链抗体制备过程中的首要关键。
发明内容
本发明的目的在于根据现有技术中筛选抗体基因过程存在盲目性、杂交瘤细胞中的假抗体基因或无义基因难以排除等缺陷，提供一种基于杂交瘤细胞的简易、快速的单链抗体制备方法。本发明通过以下技术方 案实现上述目的:
一种基于杂交瘤细胞的单链抗体(简称scFv)的制备方法，主要流程为:抗体重、轻链可变区基因的克隆，抗体基因序列分析，抗体蛋白三维结构同源模建，抗体与抗原分子对接，融合碱性磷酸酶的可溶性表达以及抗体活性鉴定。具体步骤如下:
(I)以杂交瘤细胞总HiRNA为模板，01 igo dT为引物，反转录合成CDNA第一链，再以cDNA第一链为模板，在通用引物中筛选适当引物组，扩增全套抗体重链可变区和轻链可变区基因；所述杂交瘤为能够分泌抗目标抗原的单克隆抗体的杂交瘤细胞；所述适当引物组是指能够扩增出单链抗体的重链和轻链基因的上下游引物。(2)步骤(I)得到的序列选择大小在30(T500bp范围内，条带清晰单一的轻链和重链可变区基因进行测序，序列输入IMGT数据库进行分析，排除来源于构成杂交瘤的融合伴侣瘤自身的抗体基因和无义基因，得到候选重链和轻链可变区基因；所述融合伴侣瘤是指与产生抗体的B细胞融合的骨髓瘤细胞，(B细胞与骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤)。(3)将候选重链和轻链可变区基因翻译成氨基酸序列后进行三维结构同源模建，获得单链抗体的三维模拟结构，将该三维模拟结构与相应目标抗原分子进行分子对接分析，选出分析结果正确的候选重链和轻链可变区基因；所述分析结果正确的标准是重、轻链存在二硫键，而且空间上比较接近，轻、重链能形成完整的疏水口袋，重链3个⑶R区和轻链3个CDR去紧密围绕疏水口袋，分子相互作用的拟合度数值在10以上。(4)将分子对接分析结果正确的候选重链和轻链可变区基因通过重叠延伸PCR法拼接成单链抗体基因，进行表达及抗体活性鉴定，最终得到目的单链抗体。上述步骤(I)中所述通用引物见表I (参见Krebber, A., et al., Reliablecloning of functional antibody variable domains from hybridomas and spleencell repertoires employing a reengineered phage display system.Journal ofimmunological methods, 1997.201(1): p.35-55.现代免疫学实验技术，沈关心，湖北科学技术出版社，1998年第I版:p.54)。
表I扩增单链抗体的重链和轻链可变区基因的通用引物
权利要求
1.一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法，其特征在于步骤如下: (1)以杂交瘤细胞总HiRNA为模板，Oligo dT为引物，反转录合成CDNA第一链，再以cDNA第一链为模板，在通用引物中筛选适当引物组，扩增全套抗体重链可变区和轻链可变区基因；所述杂交瘤为能够分泌抗目标抗原的单克隆抗体的杂交瘤； (2)步骤(I)得到的序列选择大小在30(T500bp范围内，条带清晰单一的进行测序，序列输入IMGT数据库进行分析，排除来源于构成杂交瘤的融合伴侣瘤自身的抗体基因和无义基因，得到候选重链和轻链可变区基因； (3)将候选重链和轻链可变区基因翻译成氨基酸序列后进行三维结构同源模建，获得单链抗体的三维模拟结构，将该三维模拟结构与相应目标抗原分子进行分子对接分析，选出分析结果正确的候选重链和轻链可变区基因； (4)将分子对接分析结果正确的候选重链和轻链可变区基因通过重叠延伸PCR法拼接成单链抗体基因，进行表达及抗体活性鉴定，最终得到目的单链抗体。
2.根据权利要求1所述基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法，其特征在于步骤(I)所述在通用引物中筛选适当引物的方法为:先确定上游引物序列:将通用引物的上、下游引物分成两组，将下游引物组的所有引物等比例混合，混合物分别与上游引物组的每一条引物混合，扩增目标单链抗体的可变区基因，筛选出能够扩增出基因的引物组，确定出该组的上游引物序列；将确定出具体序列的上游引物再分别与下游引物组中的每一条引物组合，扩增目标单链抗体的可变区基因，筛选出能够扩增出基因的引物组，确定出该组的下游引物序列；依次类推，继续确定出其他引物组序列，完成筛选。
3.根据权利要求1所述基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法，其特征在于步骤(3)所述三维结构同源模建是在RosettaAntibody: Fv Homology Modeling Server平台进行的。
4.根据权利要求1所述单链抗体的制备方法，其特征在于步骤(4)所述表达为酶融合可溶性表达，即将单链抗体基因插入到融合碱性磷酸酶蛋白基因的可溶性表达载体，进行表达。
5.权利要求Γ4任意一项所述基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法在制备抗莱克多巴胺单链抗体、抗呋喃它酮代谢物单链抗体、抗有机磷单链抗体和/或抗克伦特罗单链抗体中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于制备抗莱克多巴胺单链抗体的杂交瘤细胞为AC2，步骤(4)中重叠延伸法中，重链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO:1 2所示，轻链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO: 3 4所示；单链抗体基因扩增引物为SEQ ID NO:1和4。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于制备抗呋喃它酮代谢物单链抗体的杂交瘤细胞为2BE，步骤(4)中重叠延伸法中，重链Linker片段的扩增引物如SEQ ID N0:5飞所示，轻链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO: 7 8所示；单链抗体基因扩增引物为SEQ IDNO:5 和 8。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于制备抗有机磷单链抗体的杂交瘤细胞为12C2，步骤(4)中重叠延伸法中，重链Linker片段的扩增引物如SEQ ID N0:9 10所示，轻链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO: 11 12所示；单链抗体基因扩增引物为SEQ ID N0:9和12。
9.根据权利要求5所述 的应用，其特征在于制备抗克伦特罗单链抗体的杂交瘤细胞为OT1，步骤(4)中重叠延伸法中，重链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO: 13 14所示，轻链Linker片段的扩增引物如SEQ ID NO: 15 16所示；单链抗体基因扩增引物为SEQ ID NO: 13和16。
全文摘要
本发明公开了一种基于杂交瘤细胞的单链抗体的制备方法。本发明的制备方法，步骤为以杂交瘤细胞总mRNA为模板反转录得cDNA，选用简并性低的通用引物扩增全套抗体重链可变区和轻链可变区基因；将扩增出的重、轻链可变区基因序列输入IMGT数据库进行分析，排除来源瘤细胞的抗体基因和无义基因，得到候选重链和轻链可变区基因；将该基因翻译成氨基酸序列后进行三维结构同源模建，获得单链抗体的三维模拟结构，与相应抗原靶标分子进行分子对接分析；分析结果正确的候选重链和轻链通过重叠延伸PCR法拼接成单链抗体基因，进行表达及抗体活性鉴定。本发明的制备方法适合所有源于单克隆杂交瘤细胞的单链抗体制备，过程简易、快速，产品质量高。
文档编号C12N15/63GK103160515SQ20111042033
公开日2013年6月19日 申请日期2011年12月15日 优先权日2011年12月15日
发明者孙远明, 董洁娴, 王弘, 雷红涛, 李振峰, 徐振林, 杨金易, 沈玉栋 申请人:华南农业大学