人samd9l基因及其编码蛋白产物的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种人SAMD9L基因及其编码蛋白产物的应用，该SAMD9L基因序列，尤其是其编码蛋白的开放读码框序列在肿瘤中发生错义突变、无义突变、移码突变等不同形式的基因结构变异，可作为诊断肝癌的特异性标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速。本发明的人SAMD9L蛋白可以施用于肿瘤病人，以治疗或减轻病人因SAMD9L蛋白缺失、无功能或异常而导致的有关病症，且可通过转基因技术使本发明的人SAMD9L基因在癌细胞中过量表达，或通过体外补给SAMD9L蛋白，以控制癌细胞增殖、转移而达到治疗肿瘤的目的。
【专利说明】人SAMD9L基因及其编码蛋白产物的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种基因及其编码蛋白产物的应用，特别是涉及一种人SAMD9L基因及其编码蛋白产物在肝癌诊断、治疗中的应用。
【背景技术】
[0002]肝癌每年导致60万人死亡，是严重威胁我国人民健康的恶性肿瘤之一。肝癌发病涉及多种因素，包括乙肝病毒、丙肝病毒、酒精、黄曲霉素污染等。在我国肝癌病人中，乙肝病毒感染是主要因素。癌基因的激活、抑癌基因的失活是肝癌发病的分子机制。尽管之前的研究已发现了肝癌中抑癌基因，例如TP53的失活，癌基因的激活，例如β-catenin、gpl30都是体细胞突变所导致的，但肝癌发生发展中的遗传学事件还不是很清楚。遗传异常是肿瘤发生、转移所必须的，但是目前在临床肝癌样本中仅发现少数基因具有相对低频率的体细胞突变提示还可能存在其它重要基因的体细胞突变能够导致肝癌发生及转移。
[0003]人SAMD9L基因定位于人7q21.2染色体上，其横向同源基因SAMD9基因与其头尾相接。该基因普遍表达于人各组织中，发挥调控细胞增殖、抑制瘤性。
[0004]外显子组测序是针对基因组中的蛋白质编码区，靶向富集外显子区域测序，以发现疾病相关遗传变异的技术。该技术近年越来越多地应用于发现人类基因组低频变异、鉴定单基因遗传病致病基因和肿瘤等复杂疾病易感基因研究，成为人类疾病相关变异研究的重要工具。
[0005]目前，还没有出现涉及人SAMD9L蛋白抑制肿瘤用途的公开报道。
【发明内容】
[0006]本发明要解决的技术 问题之一是提供一种SAMD9L基因及其表达产物在制备诊断肝癌的产品中的应用。
[0007]本发明要解决的技术问题之二是提供一种SAMD9L基因及其表达产物在制备治疗肝癌的药物中的应用。
[0008]本发明要解决的技术问题之三是提供一种抑制肿瘤细胞生长的药物组合物。
[0009]本发明要解决的技术问题之四是提供本发明的人SAMD9L蛋白在制备抑制肿瘤生长的药物中的应用。
[0010]为了解决上述技术问题，本发明通过如下技术方案实现:
[0011]在本发明的一个方面，提供了 SAMD9L基因及其表达蛋白在制备诊断肝癌的产品中的应用。
[0012]所述诊断肝癌的产品包括:用DNA序列分析法诊断肝癌的产品或用定量PCR诊断肝癌的产品。
[0013]其中，所述用DNA序列分析法诊断肿瘤的产品包括:特异性扩增SAMD9L基因的引物与测序引物；用定量PCR诊断肝癌的产品，包括:特异性扩增SAMD9L基因的引物。
[0014]用于制备用DNA序列分析法诊断肝癌的产品中的人SAMD9L基因的引物，具有如SEQ ID NO: 1-2，3-4，5-6，7-8，9-10，1卜12，13-14，15-16，17-18，19-20,2卜22,23-24 或25-26所示的序列或其互补序列。
[0015]用于制备用定量PCR诊断肝癌的产品的一对特异扩增人SAMD9L基因的引物中，上游引物序列具有如SEQ ID NO: 27所示的序列或其互补序列，所述引物对的下游引物序列具有如SEQ ID N0:28所示的序列或其互补序列。
[0016]在本发明的另一方面，还提供了一种载体，它包含人SAMD9L基因。所述SAMD9L基因包括与目前国际公共核酸序列数据库GeneBank中SAMD9L基因(NM_152703)DNA序列具有70%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的DNA序列；
[0017]在本发明的另一方面，还提供了一种含有上述载体的遗传工程化的宿主细胞。
[0018]本发明的人SAMD9L基因及其表达产物，还可在制备治疗肝癌的药物中的应用。其中，所述治疗肝癌的药物包括:含有人SAMD9L基因的药物，携带SAMD9L基因的载体或宿主细胞所形成的药物，或人SAMD9L蛋白质药物。
[0019]在本发明的另一方面，还提供了一种抑制肿瘤细胞生长的药物组合物，该组合物含有安全有效量的所述的人SAMD9L蛋白质(人SAMD9L基因编码的蛋白质)及药学上可接受的载体。
[0020]本发明还提供了一种人SAMD9L蛋白质在制备抑制肿瘤生长、转移的药物中的应用。所述SAMD9L蛋白包括SAMD9L蛋白其保守性变异蛋白质、或其活性片段，或其活性衍生物，具有与SAMD9L蛋白质相同功能的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。
[0021]本发明的人SAMD9L蛋白质的变异形式包括:同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧条件下能与SAMD9L的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗SAMD9L蛋白质的抗血清获得的多肽或蛋白。本发明还提供了其他蛋白质，如包含SAMD9L蛋白质或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的蛋白质外，本发明还包括SAMD9L蛋白质的可溶性片段。通常，该片段具有SAMD9L多肽序列的至少约10个连续氨基酸，通常至少约30个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。
[0022]本发明中，“SAMD9L保守性变异蛋白质”指与SAMD9L蛋白氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成蛋白质。本发明还包括SAMD9L蛋白或多肽的类似物。这些类似物与天然SAMD9L蛋白质的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列饿修饰上的差异，或者兼而有之。这些蛋白质包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白质并不限于上述列举的代表性的蛋白质。[0023]修饰(通常不改变一级结构)形式包括:体内或体外的蛋白质的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化，如那些在蛋白质的合成和加工中或进一步加工步骤中进行糖基化修饰而产生的蛋白质。这种修饰可以通过将多肽暴露于进行糖基化的酶(如哺乳动物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白质。
[0024]在本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒，噬菌体，病毒等。在生产本发明的SAMD9L蛋白质时，可以将SAMD9L编码序列可操作地连于表达调控序列，从而形成SAMD9L蛋白表达载体。
[0025]在本发明中，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与蛋白质的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于蛋白质DNA ;如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。
[0026]在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，如CHO细胞、COS细胞等。
[0027]在本发明中，所述药物组合物含有安全有效量的人SAMD9L蛋白质及药学上可接受的载体，这类载体包括(但并不限于):稀释剂、赋形剂如水等、填充剂如淀粉、蔗糖等；粘合剂如纤维素衍生物、藻酸盐、明胶和聚乙烯吡咯烷酮；湿润剂如甘油；崩解剂如琼脂、碳酸钙和碳酸氢钠；吸收促进剂季铵化合物；表面活性剂如十六烷醇；吸附载体如高岭土和皂粘土 ；润滑剂如滑石粉、硬脂酸钙和镁、聚乙二醇等。本发明的药物组合物的施用方式可以是口服、全身施用(例如，透过皮肤、鼻吸入或者栓剂)或肠胃外施用(例如，肌肉内、静脉内或皮下)。优选的施用方式是口服，它可根据疾病程度调节。
[0028]药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形成，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。诸如片剂和胶囊之类的药物组合物，可通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液、片剂和胶囊宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约0.01微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外，本发明的人SAMD9L蛋白质还可与其他治疗剂一起使用。
[0029]使用药物组合物时，是将安全有效量的SAMD9L蛋白质或其激动剂施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约0.01微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约0.01微克/千克体重-约100微克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因数，这些都是熟练医师技能范围之内的。
[0030]本发明的人SAMD9L基因也可用于多种治疗目的。基因治疗技术可用于治疗由于SAMD9L蛋白的无表达、异常或无活性的SAMD9L蛋白的表达所致的细胞的无限生长。重组的基因治疗载体(如病毒载体)可设计成过量表达本发明的人SAMD9L蛋白，以补充内源性的人SAMD9L蛋白的缺失或不足。另外重组人SAMD9L基因可包装到脂质体中，然后在转染至细胞内。本发明的人SAMD9L基因导入组织或细胞内的方法包括:将人SAMD9L基因序列直接注入到体内组织中，或在体外通过载体(如病毒、噬菌体或质粒等)先将基因序列导入细胞中，再将细胞移植到体内等。也可通过体外补充本发明的人SAMD9L蛋白因子，以减轻因人SAMD9L蛋白的异常引起的病症，所述的人SAMD9L蛋白因子可由基因工程技术产生，并通过进一步分离、提纯而获得。
[0031]本发明的人SAMD9L蛋白可以施用于病人，以治疗或减轻因人SAMD9L缺失、无功能或异常而导致的有关病症，也可通过转基因技术把本发明的正常人SAMD9L基因注入癌细胞，以控制癌细胞增殖和杀死癌细胞。
[0032]另外，本发明还公开了一种针对用于制备治疗肝癌药物的一对人SAMD9L基因的siRNA，其正义链具有如SEQ ID NO:31所示序列，反义链具有如SEQ ID N0:32所示序列。
[0033]在本发明的研究中，为了鉴定肝癌发病过程中所发生体细胞突变的基因，采用了外显子组测序技术分析了 10例伴有肝内门静脉癌栓的肝癌病人原位癌组织、门静脉癌栓组织及对应的癌旁组织。通过对高通量数据进行严谨的分析，过滤筛选出475个可靠的点突变。其中，发现了两例肝癌病人的原位癌及门静脉癌栓组织中SAMD9L基因发生错义突变，随后在另外的80例肝癌组织中也发现了三例癌组织中SAMD9L基因发生了错义突变。
[0034]本发明的人SAMD9L基因序列，尤其是其编码蛋白的开放读码框序列在肿瘤中发生错义突变、无义突变、移码突变等不同形式的基因结构变异，可作为诊断肝癌的特异性标志基因，使肝癌诊断更加准确、快速；本发明的人SAMD9L蛋白可以施用于肿瘤病人，以治疗或减轻病人因SAMD9L蛋白缺失、无功能或异常而导致的有关病症，且可通过转基因技术使本发明的人SAMD9L基因在癌细胞中过量表达，或通过体外补给SAMD9L蛋白，以控制癌细胞增殖、转移而达到治疗肿瘤的目的。
[0035]因此，本发明的人SAMD9L基因及其编码蛋白产物可应用于制备肝癌诊断产品、抑制肿瘤生长的药物中。
【专利附图】
【附图说明】
`[0036]下面结合附图与【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明:
[0037]图1是本发明实施例2的测序结果。其中，图1中的N表示癌旁组织，C表示癌旁组织，S表示门静脉癌栓组织；在编号为56 (图1中的P55)与929 (图1中的P929)的肝癌病例中，SAMD9L基因开放读码框第1485位及4661位核酸序列发生了突变。
[0038]图2是本发明实施例3的Sanger法测序结果。在80例肝癌病例中有3例(编号为51、30、4)癌组织中的SAMD9L基因发生了错义突变。其中，N表示癌旁组织，C表示癌组织。
[0039]图3是本发明实施例4用Sanger法测定肝癌细胞Focus的SAMD9L基因编码序列的结果。
[0040]图4是实施例5中Realtime PCR检测SAMD9L基因在12例肝癌病人中的表达情况，结果显示9例癌组织中SAMD9L基因表达量低于对应的癌旁组织2倍以下。其中，N表示癌旁组织，C表示癌组织。
[0041]图5是实施例6中SK-h印-1的细胞生长曲线图，显示了 SK-h印-1细胞的SAMD9L基因表达受到SAMD9L-sil干扰后，细胞生长变快。其中，s1-NC表示细胞未进行RNA干扰，s1-1表示细胞受到SAMD9L-sil干扰后。【具体实施方式】
[0042]以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中为注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(NewYork:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。
[0043]实施例1 10例肝癌病人的外显子组捕获测序
[0044]UlO例我国广西桂林地区的肝癌病人共29个组织样本(癌旁组织10个、癌组织10个、门静脉癌栓组织9个，其中一例病人的肝门静脉癌栓组织DNA严重降解)进行组织DNA抽提。
[0045]采用德国QIAGEN公司的组织DNA抽提试剂盒，实验步骤按照产品说明书进行。抽提所得DNA经ND-1000分光光度计及0.8%的琼脂糖凝胶电泳质检合格后备用。其中一例病人门静脉癌栓组织DNA降解，其余29个组织样本DNA质量符合要求。
[0046]2,Nimblegen外显子捕获，基因组DNA首先被随机打断成500bp左右的片段，随后在每个样本的DNA片段两端分别连接上接头。经过PCR库检合格后的DNA片段与NimbleGen
2.1M Human Exome Array芯片(罗氏公司)进行杂交。去除未与芯片结合的背景DNA后,将经过富集的外显子区域的DNA片段洗脱下来。这些DNA片段又随机连接成长DNA片段后，再次被随机打断并在其两端加上测序接头，经过LM-PCR的线性扩增，在经qPCR质量检测合格后即可上机测序。
[0047]3、采用Illumina Genome Analyzer II测序系统进行测序。这种测序技术通过将基因组DNA的随机片断附着到·光学透明的表面，这些DNA片断通过延长和桥梁扩增，形成了具有数以亿计cluster的Flowcell,每个cluster具有约1000拷贝的相同DNA模板,然后用4种末端被封闭的不同荧光标记的碱基进行边合成边测序。这种新方法确保了高精确度和真实的一个碱基接一个碱基的测序，排除了序列方面的特殊错误，能够测序同聚物和重复序列。
[0048]4、ABI SOLiD 测序。
[0049]测序所用试剂米用SOLiD Fragment Library Core Kit (AppliedBiosystems, 4464412)。按照 G3360-90001 SureSelect SOLiD对基因组DNA进行片段化、末端修复、100-250bp片段选择、3’末端加腺苷酸、连接接头、前扩增、杂交、杂交后洗脱、后扩增等步骤，完成测序样本文库构建。所建文库使用Qubit? 2.0 Fluorometer仪器检测浓度，FlashGel Dock系统Lonza胶电泳或Agilent 2100 Bioanalyzer检测文库的大小和纯度。质控标准:构建文库浓度不低于Ing/ μ L ;电泳观察构建的文库大小~260bp。按照SOLiD?EZ Bead? Emulsifier (4441486B,AB), SOLiD? EZ Bead? Amplifier(4443494B,AB), SOLiD?EZ Bead? Enricher (4443496B, AB)相应程序，在自动化 EZ 系统上完成 Emulsion PCR0 按照 Applied Biosystems 5500 Series Genetic Analyzers User Guide(4456991E)准备测序试剂，将铺好beads的Flowchip上机,选用Fragment程序,进行单向lX75bp测序。测序过程由ABI提供的Instrument Control Software进行控制,并可实时观测每个连接反应。
[0050]5、基本数据分析，包括:数据产出统计:对测序结果进行图像识别(Basecalling),去除污染及接头序列；统计结果包括:测定的序列(Reads)长度、Reads数量、数
据产量。
[0051]6、高级数据分析，包括:(l)Clean reads序列与参考基因组序列比对；(2)目标外显子区域测序深度分析；(3)目标外显子区域一致序列组装；(4)目标外显子区域SNP检测及在CXDS数据库中的注释；(5)可变剪切、基因融合、外显子融合分析。
[0052]结果显示:采用了外显子组测序技术分析了 10例伴有肝内门静脉癌栓的肝癌病人原位癌组织、门静脉癌栓组织及对应的癌旁组织，通过对高通量数据进行严谨的分析，过滤筛选出475个可靠的点突变。
[0053]实施例2 PCR产物的Sanger法测序
[0054]1、PCR扩增SAMD9L基因编码区的特定的DNA片段，引物序列如下(“F”代表正向引物，“R”代表反向引物):
[0055]P55-F:GATCTGCCGTTGCAGAAAAT(SEQ ID NO:1),
[0056]P55-R:TGGTTTGCTGTGTTGGAGTT(SEQ ID NO:2)；
[0057]P929-F:GGCCTTCAATGGAAAATCCT(SEQ ID NO:3),
[0058]P929-R:AGACCTCCTGCGTCGTCTAA(SEQ ID NO:4)；
[0059]采用高保真性的热启动DNA聚合酶Hotstar Taq, PCR反应体系如下:正向引物、反向引物、10XPCR 缓冲液、MgCl2' dNTP、Hotstar Taq DNA 聚合酶(QIAGEN 公司)、DNA 模板(实施例1中的样本)，各组分体积分别为0.5、0.5、5、1、0.5、0.1、1 μ I，最后补充灭菌去离子水使反应体系为50 μ I。
[0060]PCR的反应条件是95°C变形5分钟，然后每个循环95°C变性30秒、55 °C退火30秒、72°C延伸30秒，共35个循环；电泳检测PCR扩增产物并割胶纯化PCR产物。
[0061 ] 2、利用正向引物或反向弓丨物作为测序引物，对割胶回收的PCR产物进行DNA测序。采用ABI 3730x1测序平台。测序结果由人工判读碱基峰图的改变。
[0062]3、实验结果显示，在两例肝癌病人(编号55，929)的肝癌病例中SAMD9L基因开放读码框第1485位及4661位核酸序列发生杂合性突变，具体如图1所示，1485位核酸序列G突变为T，4661位核酸序列G突变为C，均为错义突变。
[0063]实施例3 Sanger法测序分析80例肝癌病人组织中SAMD9L基因编码序列
[0064]1、80例肝癌病人组织样本来源于我国广西桂林、江苏无锡、江苏苏州等地医院肝癌病人手术切取的癌组织及癌旁组织标本，所有组织标本均冻存于_80°C条件中。所涉及的人类组织操作经国家人类基因组南方研究中心伦理委员会批准。
[0065]2、采用德国QIAGEN公司的组织DNA抽提试剂盒，实验步骤按照产品说明书进行。
[0066]3、SAMD9L基因编码序列位于基因第5个外显子上，编码的核酸序列(CCDS34681.1)来源于 NCBI 核酸序列数据库(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/),根据SAMD9L基因编码序列设计引物，分段扩增出SAMD9L基因编码序列全长，平均每段PCR产物长度约为500bp左右。
[0067]扩增SAMD9L基因编码核酸序列的引物(“F”代表正向引物，“R”代表反向引物)如下:
[0068]扩增外显子第一段编码序列的引物为:
[0069]SAMD9L(E5-1)-F:TTTTAAGAGTCAGCCTTTAGCAA (SEQ ID NO:5)，[0070]SAMD9L(E5-1) -R:TGATCTCTCTGGGATCATAATCAA(SEQ ID NO:6)；
[0071]扩增外显子的第二段编码序列的引物为:
[0072]SAMD9L(E5-2)-F:ACCGTCCAAAACAGAACACC(SEQ ID NO:7)，
[0073]SAMD9L(E5-2) -R:TTGGCTCCCGAATACACTTC(SEQ ID NO:8)；
[0074]扩增外显子第三段编码序列的引物为:
[0075]SAMD9L(E5-3)-F:TGCCTTCATTGACCACTTCA(SEQ ID NO:9)，
[0076]SAMD9L(E5-3)-R:AACTCCAACACAGCAAACCA(SEQ ID NO:10)；
[0077]扩增外显子第四段编码序列的引物为:
[0078]SAMD9L(E5-4)-F:TATGACTGGTACATTCTTGTAACAAAT (SEQ ID NO:11)，
[0079]SAMD9L(E5-4)-R:TATTTAAAGTGGAAATACTGTGGTTTG (SEQ ID NO:12)；
[0080]扩增外显子第五段编码序列的引物为:
[0081]SAMD9L(E5-5)-F:CAAAGGAATGGAAAATATGTTGTG(SEQ ID NO:13)，
[0082]SAMD9L(E5-5)-R:AACATGCATAGCCAGTGTGG(SEQ ID NO:14)；
[0083]扩增外显子第六段编码序列的引物为:
[0084]SAMD9L(E5-6)-F:GGGACAGTTATGAAAAGCTTAAAGA (SEQ ID NO: 15)，
[0085]SAMD9L(E5-6)-R:CAACATCCTGTCCTTTTAGGAT (SEQ ID NO:16)；
[0086]扩增外显子第七段编码序列的引物为:
[0087]SAMD9L(E5-7)-F:GGTGCCAAACTGAAGGAAAT(SEQ ID NO:17)，
[0088]SAMD9L(E5-7)-R:CACCTTGCGCTGTCTTGTAA(SEQ ID NO:18)；
[0089]扩增外显子第八段编码序列的引物:
[0090]SAMD9L(E5-8)-F:TGCGTATCATTCACCCTCTG(SEQ ID NO:19)，
[0091]SAMD9L(E5-8) -R:TTTGCCTTTGGGATTCTTTG(SEQ ID NO:20)；
[0092]扩增外显子第九段编码序列的引物:
[0093]SAMD9L(E5-9)-F:ATCAAATGGTGGTTGGATGG(SEQ ID NO:21)，
[0094]SAMD9L(E5-9) -R:CATGGATCCAAATGACAGAAAA (SEQ ID NO:22)；
[0095]扩增外显子第十段编码序列的引物为:
[0096]SAMD9L(E5-10)-F:CCCAAAAAGAAATTGCAGAAA (SEQ ID NO:23)，
[0097]SAMD9L(E5-10)-R:CGCTTGTACTGTCCCCTGA(SEQ ID NO:24)；
[0098]扩增外显子第十一段编码序列的引物为:
[0099]SAMD9L(E5-1I)-F:CTGGCCAGAAAATCAAGAGC(SEQ ID NO:25)，
[0100]SAMD9L(E5-1I)-R:GAGGCAAAAGCAAAATCTGT(SEQ ID NO:26)；
[0101]采用高保真性的热启动DNA聚合酶Hotstar Taq。
[0102]PCR反应体系为:正向引物、反向引物、10XPCR缓冲液、MgCl2、dNTP、Hotstar TaqDNA聚合酶(QIAGEN公司)、DNA模板，各组分体积分别为0.5,0.5、5、1、0.5,0.1、I μ 1，最后补充灭菌去离子水使反应体系为50 μ I。
[0103]PCR的反应条件为:95°C变性5分钟，然后每个循环95°C变性30秒、55°C退火30秒、72°C延伸30秒，共35个循环；电泳检测PCR扩增产物并割胶纯化PCR产物。
[0104]4、利用正向引物F或反向引物R作为测序引物，对割胶回收的PCR产物进行DNA测序。采用ABI 3730x1测序平台。测序结果由人工判读碱基峰图的改变。[0105]5、实验结果如图2所示，Sanger测序分析80例肝癌病人癌旁组织及癌组织样本中SAMD9L基因编码序列，发现在3例，约4%的肝癌病人的癌组织中SAMD9L基因发生了突变。这些突变将导致SAMD9L蛋白结构发生不同形式的变异。图2显示了 SAMD9L基因开放读码框1485位置、4661位置处分别在两例肝癌病人(P55，P929)中发生了错义突变，这些结果说明了 SAMD9L基因编码序列分析可用来诊断肝癌。
[0106]实施例4 Sanger法测序分析体外培养的肝癌细胞株的SAMD9L基因编码序列
[0107]1、肝癌细胞株
[0108]13 株细胞株 PLC/PRF/5、Sk_h印-1、MHCC-97H、MHCC-97L、YY-8103、SMMC-7721、WRL68、Focus、H印G2、H印3B、Huh_7、HCC-LM6 及 HCC-LM3，在体外 37°C、5% 二氧化碳条件下
培养，这些细胞株均为人肝细胞来源(源自中国科学院细胞库)。
[0109]2、采用Sanger法分析上述13株细胞株SAMD9L基因编码序列，结果如图3所示，Focus细胞中发现SAMD9L基因编码序列的发生变异(图3)。
[0110]实施例5 Realtime-PCR实验检测SAMD9L基因在肝癌组织中的表达情况
[0111]样本:采用德国QIAGEN公司的组织DNA抽提试剂盒，对12例肝癌病人无锡市第一人民医院进行DNA抽提，其中，实验步骤按照产品说明书进行。
[0112]采用相对定量法检测SAMD9L基因在肝癌样本中的表达差异(Thermal CyclerDiceTM Real Time System TP800, Takara; SYBRr Premix Ex TaqTM, Takara)。突光定量PCR(real-time PCR)反应体系如下:总体积20 μ L, SYBR Premix Ex Taq IOyL,上下游引物(10 μ mol/L)各0.4 μ L，cDNA I μ L，ddH20 8.2 μ L,混匀试剂，离心后放入PCR仪中进行扩增反应。反应条件为95°C变性5秒，68°C退火延伸30秒，40循环。仪器使用按厂家的说明操作。管家基因β-actin作为内参。
[0113]其中，SAMD9L基因和β-actin的引物如下:
[0114]SAMD9L-F: 5，-GCCATCAGAAGAGGAATGAGACAGC-3，(SEQ ID NO: 27)，
[0115]SAMD9L-R: 5，-GCTGCTCTTCTGGCAAGGGGC-3 ’ (SEQ ID NO: 28)。
[0116]β -actin(F):5’ -AATCGTGCGTGACATTAAGGAG-3’ (SEQ ID NO:29)，
[0117]β -actin(R):5，-ACTGTGTTGGCGTACAGGTCTT-3’ (SEQ ID NO:30)?
[0118]实时定量PCR检测SAMD9L基因在12例肝癌病人中的表达情况，结果显示9例癌组织中SAMD9L基因表达量低于对应的癌旁组织2倍以下(见图4)。该实验结果表明，可通过实时定量PCR诊断肝癌:设计SAMD9L基因的PCR引物，检测肿瘤组织中SAMD9L基因RNA的含量，RNA含量低则说明患肝癌的可能性高，反之则低。
[0119]实施例6 RNA干扰肝癌细胞SAMD9L基因的表达
[0120]1、针对SAMD9L基因设计了 siRNAs (SAMD9L_sil)，特异性干扰SAMD9L基因在肝癌细胞株SK-h印-1中的表达。其中，
[0121]SAMD9L-sil 的正义序列:GACGAUAUGACAUGUAUAAdCdA(SEQ ID N0:31)，其中，藍是脱氧胞苷，蓝是脱氧腺苷；
[0122]SAMD9L-sil 的反向序列:UUAUACAUGUCAUAUCGUCdTdC(SEQ ID NO:32);其中，是脱氧胸苷，是脱氧胞苷。
[0123]2、siRNA的细胞转染。
[0124]采用脂质体Lipofectamine? 2000 (Invitrogen)转染 siRNA,具体步骤如下:[0125]I)转染前一天接种适量细胞，使转染时细胞密度控制在30%~50%之间；
[0126]2)配制siRNA与Lipofectamine? 2000的混合液(1:1体积混合)，室温放置约20分钟，形成 siRNA-Lipofectamine? 2000 复合物；
[0127]3)将 10 μ LsiRNA-Lipofectamine? 2000 复合物加入 I X IO5 细胞中，混匀；
[0128]4)4~6小时后换正常培养液；
[0129]3、细胞生长曲线测定。
[0130]细胞活性测定采用Cell Counting Kit_8(D0JIND0 LABORATORIES)0 具体步骤如下:
[0131]I)转染siRNA后24小时的SK_h印-1细胞株，胰酶(1%，Gibco BRL)消化，稀释细胞使其浓度为I~5X IO4细胞/ml培养液，分别取IOOul至96孔培养板，每种细胞每块板接种3复孔，I~5X IO3细胞/孔，可根据不同的细胞株生长速度快慢的不一，接种的数目不同；以IOOul培养液做空白对照，37°C培养过夜。
[0132]2)按1:10体积比混合CCK-8和无血清DMEM，每孔IOOul加入待测孔中，37°C，5%CO2放置I小时。
[0133]3)在酶标仪上测定450nm处的吸光度值。连续测定5~7天，绘制出细胞生长曲线，所有实验均独立重复3次 。
[0134]结果如图5所示，SAMD9L基因表达受到干扰后，细胞生长变快。
【权利要求】
1.一种人SAMD9L基因及其表达产物的应用，其特征在于:所述人SAMD9L基因及其表达产物在制备诊断肝癌的产品中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于:所述诊断肝癌的产品包括:用DNA序列分析法诊断肝癌的产品或用定量PCR诊断肝癌的产品。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于:所述用DNA序列分析法诊断肿瘤的产品包括:特异性扩增SAMD9L基因的引物与测序引物； 用定量PCR诊断肝癌的产品，包括:特异性扩增SAMD9L基因的引物。
4.一种人SAMD9L基因及其表达产物的应用，其特征在于:所述人SAMD9L基因及其表达产物在制备治疗肝癌的药物中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于:所述治疗肝癌的药物包括:含有人SAMD9L基因的药物，携带SAMD9L基因的载体或宿主细胞所形成的药物，或人SAMD9L蛋白质药物。
6.一种人SAMD9L蛋白质的应用，其特征在于:所述人SAMD9L蛋白质在制备抑制肿瘤生长、转移的药物中的应用。
7.一种用于人SAMD9L蛋白质的应用中的药物组合物，其特征在于:所述药物组合物含有安全有效量的人SAMD9L蛋白质及药学上可接受的载体。
8.用于制备用DNA序列分析法诊断肝癌的产品中的人SAMD9L基因的引物，其特征在于:所述引物序列具有如 SEQ ID NO: 1-2，3-4，5-6，7-8，9-10，11-12，13-14，15-16，17-18，19-20，21-22，23-24或25-26所示的序列或其互补序列。
9.用于制备用定量PCR诊断肝癌的产品的一对特异扩增人SAMD9L基因的引物，其特征在于:所述引物的上游引物序列具有如SEQ ID NO:27所示的序列或其互补序列，所述引物对的下游引物序列具有如SEQ ID NO:28所示的序列或其互补序列。
10.针对用于制备治疗肝癌药物的一对人SAMD9L基因的siRNA，其特征在于:所述siRNA的正义链具有如SEQ ID NO:31所示序列，所述siRNA的反义链具有如SEQ ID NO:32所示序列。
【文档编号】C12Q1/68GK103571927SQ201210251883
【公开日】2014年2月12日 申请日期:2012年7月20日 优先权日:2012年7月20日
【发明者】王群, 韩泽广, 邓庆 申请人:上海人类基因组研究中心