专利名称：：抑制hiv的短小多肽及药物用途的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物医药领域，涉及用于抑制HIV的多肽、其药物组合物及其用途。
背景技术：
：艾滋病(AIDS)主要由人类免疫缺陷病毒I型(HIV-I)引起。自1981年发现艾滋病以来，全球已有超过6000万人感染艾滋病病毒，其中约2500万已经死亡。据WHO统计，现在每年新增HIV感染者约200万，严重威胁人类健康。疫苗是预防艾滋病的最好的手段，但有效的艾滋病疫苗近期恐难有重大突破。因此，研发阻断病毒不同复制阶段的药物是目前防控艾滋病的重点策略。HIV-I的包膜糖蛋白(ENV)介导病毒进入靶细胞的过程。该蛋白由表面亚基gpl20和跨膜亚基gp41通过非共价键连接而成。在天然状态下，ENV为三聚体，其中gpl20形成一个球状复合物，而gp41则插入病毒包膜内(I)。gpl20的主要功能是与受体CD4和辅助受体(趋化因子受体CCR5或CXCR4等)结合，而gp41主要介导病毒和细胞的膜融合。研究发现，gp41膜外区包含几个重要的功能区，包括疏水性融合肽(FP)、N-末端螺旋重复序列(NHR或HRl),C-末端螺旋重复序列(CHR或HR2)。早在1997年，通过解析来源于NHR和CHR的多肽复合物的晶体结构，发现gp41的核心结构为六股α-螺旋束(sixhelixbundle,6_HB),其中三个NHR组成的N-螺旋通过在a和d位置的氨基酸残基相互作用形成位于中心的螺旋三聚体，其e和g位置的氨基酸残基则暴露于中心螺旋体的外围，并与三个CHR组成的C-螺旋的a和d位置相互作用(2-4)。C-螺旋以反向平行的方式分别结合在三个N-螺旋形成的沟槽中。基于gp41的三维结构信息提出了HIV-I膜融合机制当gpl20与靶细胞上的受体结合后发生显著的构象变化，gp41的融合肽(FP)被暴露出来并插入靶细胞膜内，CHR与NHR发生反向结合，形成稳定的6-HB结构，将病毒膜与靶细胞膜拉近而发生融合，从而介导HIV进入靶细胞内(5)。晶体结构揭示NHR含有明显的疏水口袋状结构(hydrophobicpocket),被认为是抗HIV药物的新靶点。十余年来，针对NHR口袋筛选或设计HIV药物的研究一直是热点之一。研究表明，CHR包含三个功能区，即位于N端的NHR疏水袋结合区(PBDpocket-bindingdomain,aa628_635)、NHR结合区(NBD:aa628_666)和脂膜结合区(LBDlipid-bindingdomain,aa666_673)。NHR和CHR螺旋间的相互作用对gp41核心结构的稳定性以及病毒的感染活性起着决定性的作用。在6-HB核心结构形成过程中，CHR上PBD的三个氨基酸(Trp628、Trp631和Ile635)以高亲和力插入NHR疏水口袋，对稳定六螺旋束结构至关重要(6-7)。然而，以前报道的6-HB结构CHR都起始于Trp628，对其上游序列的结构没有得到解析(2，4，8)，导致大多研究基于SIVgp41的结构而推测CHR疏水袋结合区上游序列621QIWNNMt627也可能呈现α-螺旋结构(9)。然而，He,Y.等发现含有621QIWNNMt627的多肽CP621-652可以和NHR多肽形成极其稳定的6_HB(Tm=82°C)，远远高于被认为gp41核心结构的N36和C34复合体的稳定性(Tm=64°C)。同时，CP621-652具有显著的抗病毒活性(10)。这些结果提示，CHR上游的621QIWNNMt627位点在gp41介导的膜融合过程有重要影响。为此，He,Y.等对gp41功能性核心结构的概念提出了修正。最近，Chong,H.等对基于CP621-652的6-HB进行了结构解析，发现621QIWNNMt627序列并非螺旋结构(11)。令人兴奋的重要发现是，紧邻CHR的氨基酸残基Met626和Thr627形成一个独特的“钩子”样结构(命名为M-T钩子)，通过紧紧“钩住”NHR上的疏水口袋而稳定6-HB核心结构。实验结果揭示M-T钩子对HIV的感染性起着至关重要的作用。该发现为深入研发基于M-T钩子的HIV融合抑制剂奠定了理论基础。于2003年获得美国FDA“快通道”批准的艾滋病治疗药物T20(Enfuvirtide,Fuzeon)即是来源于gp41CHR的含有36个氨基酸残基的多肽，它主要通过阻断6-HB的形成过程而发挥作用(12)J20是第一个也是目前唯一的用于临床治疗的HIV膜融合抑制剂，但由于耐药问题而限制了它的广泛应用。过去十余年来，靶向gp41的抗病毒多肽一直是HIV药物研究的热点(13)。研究发现，衍生于gp41CHR的多肽C34比T20具有更高的抗病毒活性。结构上T20和C34都包含NHR结合区，可以和NHR序列相互作用，但C34包含疏水袋结合区(PBD)而T20缺乏这个基序。C34水溶性较差，很难被发展成为药物，但由于其代表着CHR的核心序列，所以被广泛作为新型抗病毒多肽的设计模板(13)。T1249是T20的第二代产品，具有较高的抑制HIV能力，对T20耐药株也非常有效，但由于剂型问题而停止了临床试验(14)。研发第三代或称下一代高效的融合抑制多肽具有重要的理论意义和应用价值。基于C34的序列，国内设计了抗HIV多肽西夫韦肽(Sifuvirtide),已进行II期临床试验(15)。然而令人担忧的是，基于C34设计的抑制剂容易诱导病毒耐药的产生(16-17)。同时令人关注的是，以前报道的HIV融合抑制多肽大都具有较长的氨基酸序列，如T20和西夫韦肽含有36个氨基酸残基，C34含有34个氨基酸残基，而T1249和T2635均具有39个氨基酸残基。无疑，多肽的长度与其制备的难度和成本密切相关。最近，日本学者报道了一个具有29个氨基酸的多肽(SC29EK)，具有类似于C34的抗HIV活性，但进一步的截短(如22个氨基酸的SC22EK)则极大地降低多肽的抗病毒活性及与靶点结合的稳定性(18-19)。最近，何玉先等根据对gp41结构与功能的深入研究，设计了一个含有32个氨基酸的多肽P32(中国发明专利申请号201110112709.7)，其抗病毒活性显著提高，尤其对T20耐药病毒显示极强的优势。参考文献:I.ZhujP.，LiujJ.，Bess,J.，Jr.，ChertovajE.，LifsonjJ.D.，GrisejH.，OfekjG.A.,TaylorjK.A.,andRouxjK.H.(2006)Distributionandthree-dimensionalstructureofAIDSvirusenvelopespikes.Nature441，847-8522.Chan,D.C.，FassjD.，Berger,J.M.，andKimjP.S.(1997)Corestructureofgp41fromtheHIVenvelopeglycoprotein.Cell89，263-2733.Lu，M.，Blacklow，S.C.，andKimjP.S.(1995)AtrimericstructuraldomainoftheHIV-Itransmembraneglycoprotein.NatStructBiol2，1075—10824.WeissenhornjW.，DessenjA.，Harrison,S.C.，SkeheljJ.J.，andWiley,D.C.(1997)AtomicstructureoftheectodomainfromHIV-Igp41.Nature387，426-4305.Eckert,D.M.,andKimjP.S.(2001)Mechanismsofviralmembranefusionanditsinhibition.AnnuRevBiochem70，777-8106.Chan,D.C.，ChutkowskijC.Τ·，andKimjP.S.(1998)EvidencethataprominentcavityinthecoiledcoilofHIVtypeIgp41isanattractivedrugtarget.ProcNatlAcadSciUSA95，15613-156177.Chan，D.C.，andKimjP.S.(1998)HIVentryanditsinhibition.Cell93,681-6848.Tan,K.,LiujJ.,Wang,J.,ShenjS.,andLu，M.(1997)AtomicstructureofathermostablesubdomainofHIV-Igp41.ProcNatlAcadSciUSA94，12303-123089.Caffrey,M.，CaijM.，Kaufman,J.，Stahl,S.J.，Wingfield,P.T.，CovelljD.G.,GronenbornjA.M.,andClorejG.M.(1998)Three-dimensionalsolutionstructureofthe44kDaectodomainofSIVgp41.EMBOJ17，4572-458410.He，Y.，Cheng,J.，Li,J.，QijZ.，Lu,H.，Dong,M.，Jiang,S.，andDaijQ.(2008)IdentificationofacriticalmotifforthehumanimmunodeficiencyvirustypeI(HIV-1)gp41corestructure:implicationsfordesigningnovelanti-HIVfusioninhibitors.JVirol82,6349-635811.Chong,H.，YaojX.，QiujZ.，QinjB.，HanjR.，WalterspergerjS.，Wang,M.，CuijS.,andHe,Y.(2012)DiscoveryofCriticalResiduesforViralEntryandInhibitionthroughStructuralInsightofHIV-IFusionInhibitorCP621-652.JBiolChem287，20281-2028912.LalezarijJ.P.，Henry,K.，01Hearn,M.，MontanerjJ.S.，PilierojP.J.，TrottierjB.，Walmsley，S.，Cohen,C.，KuritzkesjD.R.，EronjJ.J.，Jr.，Chung,J.，DeMasijR.，DonataccijL，DrobnesjC.，Delehanty,J.，andSalgojM.(2003)EnfuvirtidejanHIV-Ifusioninhibitor,fordrug-resistantHIVinfectioninNorthandSouthAmerica.NEnglJMed348,2175-218513.Steffen，I.，andPohlmannjS.(2010)Peptide-basedinhibitorsoftheHIVenvelopeproteinandotherclassIviralfusionproteins.CurrPharmDes16，1143-115814.EgginkjD.，Baldwin,C.E.，Deng,Y.，Langedijk，J.P.，Lu,M.，Sanders,R.W.,andBerkhoutjB.(2008)SelectionofT1249_resistanthumanimmunodeficiencyvirustypeIvariants.JVirol82，6678-668815.He，Y.，Xiao,Y.，Song,H.，Liang,Q.，JujD.，Chen,X.，Lu,H.，JingjW.，Jiang,S.,andZhang,L.(2008)Designandevaluationofsifuvirtide,anovelHIV-Ifusioninhibitor.JBiolChem283，11126-1113416.ShimurajK.，NamekijD.，KajiwarajK.，WatanabejK.，SakagamijY.，OishijS.，FujiijN.,MatsuokajM.,SarafianosjS.G.,andKodamajE.N.(2010)ResistanceprofilesofnovelelectrostaticallyconstrainedHIV-Ifusioninhibitors.JBiolChem285，39471-3948017.LiujZ.，Shan,M.，Li，L.，Lu，L.，MengjS.，Chen,C.，He，Y.，Jiang,S.，andZhang,L.(2011)InvitroselectionandcharacterizationofHIV-Ivariantswithincreasedresistancetosifuvirtide,anovelHIV-Ifusioninhibitor.JBiolChem286，3277-328718.NaitojT.，IzumijK.，KodamajΕ.，SakagamijY.，KajiwarajK.，NishikawajH.，WatanabejK.，SarafianosjS.G.，OishijS.，FujiijN.，andMatsuokajΜ.(2009)SC29EK，apeptidefusioninhibitorwithenhancedalpha—helicity，inhibitsreplicationofhumanimmunodeficiencyvirustypeImutantsresistanttoenfuvirtide.AntimicrobAgentsChemother53，1013-101819.NishikawajH.，OishijS.，FujitajM.，WatanabejK.，TokiwajR.，OhnojH.，Kodama，E.，IzumijK.，KajiwarajK.，NaitohjT.，MatsuokajM.，OtakajA.，andFujiijN.(2008)IdentificationofminimalsequenceforHIV-Ifusioninhibitors.BioorgMedChem16,9184-9187。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供具有抗HIV活性的长度在21-30个氨基酸残基的多肽、其药用盐、或其衍生物。本发明所提供的多肽、其药用盐、或其衍生物，其中，所述多肽为下述a)或b)或c)a)序列表中序列14所示的多肽HP25-N2；b)在序列表中序列19所示多肽的氨基末端和/或羧基末端添加一个以上氨基酸残基得到的具有抗HIV活性的衍生多肽，所述衍生多肽由21-30个氨基酸残基组成；c)在序列表中序列19所示多肽除氨基末端和羧基末端在内的任何位点添加或替代I个以上氨基酸得到的由21-30个氨基酸残基组成的衍生多肽，所述衍生多肽具有抗HIV活性。其中，序列表中的序列14由23个氨基酸残基组成；序列表中的序列19由18个氨基酸残基组成，其氨基酸序列是序列表中序列14的第3-20位所示的氨基酸序列。在本发明的实施方式中，b)所示的衍生多肽具体为下述bl)_bl7)中的任一种多肽bl)氨基酸序列是序列表中序列18的多肽ELT23；b2)氨基酸序列是序列表中序列9的多肽HP25；b3)氨基酸序列是序列表中序列6的多肽HP28；b4)氨基酸序列是序列表中序列10的多肽HP24；b5)氨基酸序列是序列表中序列5的多肽HP30；b6)氨基酸序列是序列表中序列8的多肽HP26；b7)氨基酸序列是序列表中序列7的多肽HP27；b8)氨基酸序列是序列表中序列15的多肽HP25-N3；b9)氨基酸序列是序列表中序列12的多肽HP24-N2；blO)氨基酸序列是序列表中序列17的多肽HP27-N3；blI)氨基酸序列是序列表中序列16的多肽HP26-N3；bl2)氨基酸序列是序列表中序列13的多肽HP24-N3；bl3)氨基酸序列是序列表中序列11的多肽HP24-N1；bl4)氨基酸序列是序列表中序列I的多肽MT-SC22EK；bl5)氨基酸序列是序列表中序列2的多肽MT-SC21EK；bl6)氨基酸序列是序列表中序列3的多肽MT-SC20EK；bl7)氨基酸序列是序列表中序列4的多肽MT-SC19EK。本发明具体实施方式中所列出的18种多肽的序列如表I所示。表I.多肽序列权利要求1.多肽、其药用盐、或其衍生物，其特征在于所述多肽为下述a)或b)或c):a)序列表中序列14所示的多肽HP25-N2；b)在序列表中序列19所示多肽的氨基末端和/或羧基末端添加一个以上氨基酸残基得到的具有抗HIV活性的衍生多肽，所述衍生多肽由21-30个氨基酸残基组成；c)在序列表中序列19所示多肽除氨基末端和羧基末端在内的任何位点添加或替代I个以上氨基酸得到的由21-30个氨基酸残基组成的衍生多肽，所述衍生多肽具有抗HIV活性。2.根据权利要求I所述的多肽、其药用盐或其衍生物，其特征在于b)所示的衍生多肽为下述bl)-bl7)中的任一种多肽bl)氨基酸序列是序列表中序列18的多肽ELT23；b2)氨基酸序列是序列表中序列9的多肽HP25；b3)氨基酸序列是序列表中序列6的多肽HP28；b4)氨基酸序列是序列表中序列10的多肽HP24；b5)氨基酸序列是序列表中序列5的多肽HP30；b6)氨基酸序列是序列表中序列8的多肽HP26；b7)氨基酸序列是序列表中序列7的多肽HP27；b8)氨基酸序列是序列表中序列15的多肽HP25-N3；b9)氨基酸序列是序列表中序列12的多肽HP24-N2；blO)氨基酸序列是序列表中序列17的多肽HP27-N3；bll)氨基酸序列是序列表中序列16的多肽HP26-N3；bl2)氨基酸序列是序列表中序列13的多肽HP24-N3；bl3)氨基酸序列是序列表中序列11的多肽HP24-N1；bl4)氨基酸序列是序列表中序列I的多肽MT-SC22EK；bl5)氨基酸序列是序列表中序列2的多肽MT-SC21EK；bl6)氨基酸序列是序列表中序列3的多肽MT-SC20EK；bl7)氨基酸序列是序列表中序列4的多肽MT-SC19EK。3.根据权利要求I或2所述的多肽、其药用盐或其衍生物，其特征在于权利要求I或2所述的多肽衍生物为下述I)-5)中的至少一种1)权利要求I或2所述的多肽的氨基端连接氨基端保护基和/或权利要求I或2所述的多肽的羧基端连接羧基端保护基得到的连接物；2)权利要求I或2所述的多肽的羧基端连接寡肽或亲脂性基团或胆固醇得到的连接物；3)权利要求I或2所述的多肽的氨基端连接寡肽或亲脂性基团或胆固醇得到的连接物；4)权利要求I或2所述的多肽的氨基端和羧基端均连接寡肽或亲脂性基团或胆固醇得到的连接物；5)权利要求I或2所述的多肽被蛋白质、聚乙二醇、马来酰亚胺修饰得到的修饰物。4.根据权利要求3所述的多肽、其药用盐或其衍生物，其特征在于权利要求I或2所述的多肽衍生物为权利要求I或2所述的多肽的氨基端连接乙酰基和权利要求I或2所述的多肽的羧基端连接酰胺基得到的连接物。5.由权利要求1-4中任一所述的多肽和/或其药用盐和/或其衍生物形成的多聚体。6.一种组合物，其包含Cl)和C2):C1)权利要求1-4中任一所述的多肽、其衍生物、或其可药用盐，和/或权利要求5所述的多聚体；C2)药学上可接受的载体或辅料；所述组合物具有下述Dl)-D5)中的至少一种功能Dl)抗HIV；D2)治疗和/或预防和/或辅助治疗HIV感染所致疾病(如艾滋病)；D3)抑制HIV进行细胞融合；D4)抑制HIV侵入细胞；D5)抑制HIV复制。7.权利要求1-4中任一所述的多肽、其衍生物、或其可药用盐，或权利要求5所述的多聚体，或权利要求6所述的组合物在制备如下至少一种产品中的应用Dl)抗HIV的产品，如药物或疫苗；D2)治疗和/或预防和/或辅助治疗HIV感染所致疾病的产品，如药物或疫苗；D3)抑制HIV进行细胞融合的产品；D4)抑制HIV侵入细胞的产品；D5)抑制HIV复制的产品。8.编码权利要求I至4中任一项所述多肽的核酸分子。9.产品的制备方法，包括el)或e2)的步骤el)化学合成权利要求1-4中任一所述的多肽的步骤；e2)生物表达权利要求1-4中任一所述的多肽的步骤；所述产品为fl)、f2)或f3)Π)权利要求1-4中任一所述的多肽、其药用盐、或其衍生物；f2)权利要求5所述的多聚体；f3)权利要求6所述的组合物。[10.gl)或g2)的生物材料gl)含有权利要求8所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组细胞或重组病毒；g2)表达权利要求1-4中任一所述多肽的重组表达载体或重组细胞。全文摘要本发明公开了抑制HIV的短小多肽及药物用途。该多肽为下述a)或b)或c)a)序列表中序列14所示的多肽HP25-N2；b)在序列表中序列19所示多肽的氨基末端和/或羧基末端添加一个以上氨基酸残基得到的具有抗HIV活性的衍生多肽，所述衍生多肽由21-30个氨基酸残基组成；c)在序列表中序列19所示多肽除氨基末端和羧基末端在内的任何位点添加或替代1个以上氨基酸得到的由21-30个氨基酸残基组成的衍生多肽，所述衍生多肽具有抗HIV活性。本发明的多肽与其他多肽相比虽然明显短小但却具有极强的抗病毒活性，具有易于合成、成本低廉的优点。文档编号C12N1/21GK102816215SQ20121028005公开日2012年12月12日申请日期2012年8月8日优先权日2012年8月8日发明者何玉先,种辉辉申请人:中国医学科学院病原生物学研究所