一种可分泌的绿色荧光蛋白及其在重组蛋白高产表达细胞株筛选方面的应用的制作方法
【专利摘要】本发明是一种可分泌到细胞外的绿色荧光蛋白(SEGFP)。本发明提供了该蛋白的构建方法，并确定该蛋白的可分泌的特性。本发明公开了利用SEGFP蛋白分泌到细胞外的特性，可以使用多功能酶标仪快速简便的检测其荧光强度，从而可以在细胞筛选过程的早期快速筛选大量克隆。本发明还提供了利用SEGFP蛋白便捷的比较细胞产量的高低及细胞克隆表达稳定性的方法，这可以替代常规GFP的流式分析的方法，极大的降低了实验成本并减少实验操作的复杂性，具有大规模高通量筛选的优势。本发明还公开了SEGFP蛋白在流式细胞分选中的便捷应用。本发明还公开了该SEGFP蛋白的DNA编码序列。
【专利说明】—种可分泌的绿色荧光蛋白及其在重组蛋白高产表达细胞株筛选方面的应用
【技术领域】:
[0001]本发明涉及分子生物学和细胞生物学领域，其技术属于分子生物学和细胞生物学的相关实验方法与技术，特别是一种可用于稳定高表达细胞系构建的分泌型绿色荧光蛋白。
【背景技术】:
[0002]绿色突光蛋白(GreenFluorescent Protein,简称GFP)是一种在学名为 Aequoreavictoria 的水母中所发现的一种蛋白质(Morin, J.G.J.Cell Physiol.(1971)77,305-318)。在它包含238个氨基酸的序列中，第65至67个氨基酸(丝氨酸一酪氨酸一甘氨酸)残基，可自发地形成一种荧光发色团，因此在有激发光的照射下可以自发荧光，而不需要借助底物或其他的共同作用因子(Tsien，R.Y.Annu.Rev.Biochem.(1998).67:509-544.)随着生物技术的进步，GFP报告基因还被用于基因组范围的表达调控分析，蛋白质在体内的亚细胞定位研究以及蛋白质在细胞内运动的实时观测(J M Tavar?等Journal of Endocrinology.(2001).170，297-306)。GFP 可以在细菌，酵母，昆虫表达系统及转基因动植物中用作报告基因，构建出高表达报告基因的实验模型(Chalfie，Μ.等Science (1994)263,802-805 ；Plautz JD 等(1996)Genel73:83-87 ;Suzuki J 等(2006)JBiotechnol 126:463-474 ；Blumenthal A 等 Plant Sci (1999) 142:93-99)。
[0003]然而随着生物制药工业的发展，对重组蛋白越来越多的需求量，使得在尽可能短的时间内构建得到的尽可能稳定高表达生产用细胞系成为生物技术发展的方向和目标。而不论是利用GFP指示目的蛋白的表达还是指示高效表达的位点，寻找到表达足够高并且稳定的细胞系都是其中的关键步骤(Qiao，J.等Molecular Biology (2009) 390 (4):579-59)这需要进行构建和筛选大量的细胞克隆，进而快速比较他们的产量，并且要求筛选到表达高的细胞要保持稳定的表达水平。
[0004]虽然GFP有其高通量筛选的优势，但是在细胞系构建上GFP仍存在一些负面的影响。一方面GFP在抑制细胞生长和诱导细胞凋亡方面的作用，使得在许多细胞中，不易构建稳定表达 GFP 的细胞系(Hsiao-Sheng Liu 等 Biochemical and Biophysical ResearchCommunications (1999) 260 (3):712-717)，这制约了筛选到表达GFP足够高的细胞克隆。另一方面GFP作为胞内蛋白，比较不同细胞克隆产量的高低需要裂解细胞进行检测或进行流式分析，这降低了细胞克隆的分析通量，并且不便于比较细胞克隆的稳定性。另外由于流式分析方法成本高，操作步骤复杂，实践中只能通过比较单一代次的变化来评判细胞稳定性。而单一代次的比较可能出现一定的误差，并且无法准确反映细胞产量变化趋势。因此如何简单便捷的检测目的基因表达水平的变化并且准确判断出稳定的细胞克隆也是工业上筛选闻表达细胞系的关键步骤。
[0005]因此改进GFP，保留其荧光特性同时降低其对细胞生长的负面影响和不易于检测的性质，开发出可以快速简便检测的荧光蛋白，可以为工业上进行细胞构建提供新的报告基因和开发手段。
【发明内容】
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[0006]本发明的目的是为了解决上述【背景技术】存在的不足，构建得到一种分泌型的绿色荧光蛋白——SEGFP，为筛选高表达稳定的工程细胞系提供了新的思路。
[0007]本发明的目的按下述方案实现:根据原有的GFP蛋白的序列，在其N端加上一段人IgGkappa链的信号肽序列，构建一种分泌型绿色荧光蛋白。转染分泌型绿色荧光蛋白至哺乳动物细胞CHO中，并在细胞外检测到该蛋白的分泌。利用该蛋白构建了稳定表达的细胞系，并且该蛋白可用于细胞系的表达水平及表达稳定性的比较。分泌型荧光蛋白还可以用于流式细胞仪的分选。
[0008]本发明的突出优点是SEGFP可以分泌到细胞外的特点，可以使其方便用于细胞克隆筛选，并可以快速检测细胞克隆的蛋白表达水平及分析细胞克隆的表达稳定性，大量节省了实验成本，为筛选出高表达的工程细胞株提供新的工具。
【专利附图】
【附图说明】:
[0009]图1.Western Blotting检测分泌型绿色荧光蛋白的表达水平。L:细胞裂解液；S:
培养液上清
[0010]图2.分泌型绿色荧光蛋白细胞克隆表达水平的分析
[0011]图3.SEGFP细胞克隆之间单日单细胞荧光强度(QFI)的比较。
【具体实施方式】:
[0012]实施例1、分泌型绿色荧光蛋白(SEGFP)的构建
[0013]关于分泌型绿色荧光蛋白(SEGFP)的构建，是通过在引物设计中将人IgG kappa链的信号肽加在GFP蛋白基因的5’端。引物序列如下:
[0014]SEGFP上游引物:
[0015]5 ^-atggacatga gggtccccgc tcagctcctg gggctcctgc tactctggct ccgaggtgccagatgtatgg tgagcaaggg-3，SEGFP 下游引物:
[0016]5' -tcagcggtttgggcccgcggtaccgtcgactgcagaattcgaagcttgagct-3'
[0017]通过标准PCR技术，克隆得到GFP蛋白，同时将信号肽序列与GFP蛋白序列构建到同一序列中。通过MluI和XhoI两个酶切位点将该序列酶切后进行DNA片段的纯化，然后将该片段连入哺乳动物表达载体中，鉴定出连有该片段的阳性克隆。从而构建得到分泌型绿色荧光蛋白。经过测序确定分泌型绿色荧光蛋白的序列如附录所示。
[0018]实施例2、分泌型绿色荧光蛋白的转染和细胞外分泌的荧光蛋白的强度检测及WesternBlotting 检测
[0019]在哺乳动物细胞CHO中转染分泌型绿色荧光蛋白(SEGFP)，并将转染后的细胞在摇瓶中培养。转染的细胞在摇瓶中72小时后，取Iml细胞，lOOOrpm，离心5min，将细胞和培养液分离，培养液按照12000rpm离心5min，留取上清待测。细胞加入Imll XTXWSB裂解液(TXSWB ；1% Triton X-100, IOOmM Tris-HCl pH8，IOOmMNaCl，IOmM) EDTA 冰上裂解 15min，12000rpm,离心5min，得到裂解液。以新鲜培养液和I X TXffSB为对照，用多功能酶标仪检测培养液和裂解液的荧光强度(Ex:485 ;Em:525)。计算胞外与胞内荧光强度比值，可以发现SEGFP在细胞外的荧光强度明显高于细胞内的荧光强度。随着培养天数的增加，SEGFP在第六天荧光强度值明显高于第三天的荧光强度，说明添加信号肽的SEGFP蛋白可以持续将荧光蛋白分泌到细胞外。
[0020]对转染SEGFP三天后的CHO细胞，进行收集并离心分离上清和细胞，将细胞使用1*TXWSB裂解细胞，收集细胞裂解液。将得到的细胞裂解液和培养液上清进行SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白条带通过转膜过程转移到PVDF膜上。然后一抗使用兔抗GFP的抗体(I:1000，康为世纪)孵育I小时，TBST清洗3次，每次10分钟；二抗使用HRP标记的羊抗兔IgG的抗体(1:2000,中杉金桥)孵育I小时，TBST清洗3次，每次10分钟；最后使用DAB染色检测检测SEGFP蛋白在上清和裂解液中表达水平。Western Blotting检测结果表明大部分的分泌型绿色荧光蛋白分泌到细胞外(图1)。
[0021]借助于信号肽的定位和分泌作用，GFP蛋白可以被分泌到细胞外，可以通过更为简单快捷的方法对细胞分泌的GFP蛋白进行检测，极大的提高了实验的操作效率。同时SEGFP的分泌效果减少了细胞内荧光蛋白的积累，避免了由于GFP在细胞内的大量积累可能会引起的细胞凋亡。
[0022]实施例3、分泌型绿色荧光蛋白(SEGFP)较GFP蛋白有利于稳定细胞系的构建
[0023]在CHO细胞中，分别电转染GFP和SEGFP表达载体，用5 X IO6细胞进行转染，电转条件为IOug DNA，350V，30ms。转染后24小时，按照1000细胞/孔接种96孔板，用含有0.6mg/ml的G418的培养基进行稳定细胞克隆的筛选。2周后在突光显微镜下观察生长出来的细胞，对细胞的荧光蛋白表达水平进行分类统计，进行细胞克隆的统计分析。如图2所示SEGFP的阳性克隆率为62.50%，稍高于GFP的61.82% ;进一步分析阳性单克隆比例表明SEGFP有超过75%的阳性克隆为阳性单克隆，而GFP则不足40%。统计分析表明SEGFP在细胞成克隆率，特`别是形成阳性单克隆的比例上较GFP有显著优势(P < 0.05)。从克隆数目上看到SEGFP有18个阳性单克隆，GFP只有13个，表明SEGFP在稳定高表达细胞克隆的筛选上要明显优于GFP。
[0024]将筛选到的单细胞阳性克隆分别从96孔板扩大到24孔板及6孔板并分别于培养3天后收集细胞培养上清。按照实施例2中所述的方法检测上清中的荧光强度，并且利用上清中荧光强度比较细胞表达水平。随着培养体积的增加，荧光强度逐渐增强，96孔板中荧光值高的细胞克隆在24孔板中也有较高的荧光值，回归分析显示两者的荧光强度有显著正相关性。进一步的扩大培养后，细胞在6孔板的突光强度正相关于24孔板的突光值。如图2所示在24孔板水平不同细胞克隆荧光表达水平的分布，绝大多数细胞克隆表达量很低，随着荧光强度的增加克隆的分布迅速减少，荧光强度低于200的克隆占到了 80%左右，甚至有65%左右的细胞克隆几乎没有GFP的表达，而荧光强度在500-1000的克隆不足10%，表达最高的细胞克隆荧光强度大于900。
[0025]进一步挑选了 GFP和SEGFP表达量最高的4个阳性单克隆进行生长的稳定性分析。按照0.5 X 106/ml密度，按照IOmi/瓶的培养体积50ml摇瓶进行细胞接种，在CO2培养箱中37°C，5% C02，150rpm培养。每次传代时进行细胞计数，并计算每个代次的细胞群体倍增时间(PDT)。在接近40天的细胞传代过程中，GFP和SEGFP细胞克隆均能正常生长。然而分析细胞群体倍增时间发现虽然8株细胞平均的群体倍增时间(TOT)分布在18-30小时之间，但是其中SEGFP4个克隆的PDT为21.0l~23.69小时，而GFP克隆I3DT的平均值为22.51~29.46小时。对细胞克隆的PDT均值进行统计分析也表明SEGFP克隆的TOT明显小于GFP克隆(P < 0.05)，说明SEGFP4株细胞相较GFP的4株克隆倍增更快，对细胞生长的影响较弱。进一步观察GFP有3株克隆超过24小时，甚至有2个偏差大于10小时。表明GFP有两个克隆在细胞生长的过程中表现的很不稳定。因此可见GFP在细胞内的表达确实对细胞生长有负面影响。对不同GFP各自的细胞克隆进行TOT的方差分析也表明SEGFP克隆之间PDT的方差差异不显著(P = 0.47)，而GFP的4株细胞克隆的PDT的方差之间有非常显著性差异(P < 0.01)，说明SEGFP的4株细胞克隆之间生长状态较为一致，细胞表达高低对生长没有显著影响。由此可说明利用信号肽将荧光蛋白分泌到细胞外，降低了其在细胞内的浓度，缓解了 GFP蛋白在细胞内积累的不利影响，有利于保证细胞更加稳定的生长。 [0026]SEGFP可以被持续分泌到细胞的培养液中，并且在培养液中仍然保持可激发性，在488nm的激发光下可以检测到培养液中荧光强度。这样可以改善胞质内GFP的检测方法的复杂性，在筛选细胞克隆的时候直接利用培养基中GFP的荧光强度的高低挑选出表达GFP高的细胞克隆。研究结果还揭示了在细胞克隆筛选的过程中，在96孔板时期表达较高的细胞克隆在扩大培养后也有较高的荧光强度，细胞克隆的荧光强度在不同培养阶段保持较好的一致性。因此利用SEGFP分泌到胞外的荧光强度值可以便捷的选出GFP表达水平高的细胞克隆。我们还观察到直接利用荧光强度筛选到高表达的细胞克隆绝大多数为阳性单克隆，筛选正确的比例要高于通过荧光显微镜观察判断的结果，而GFP蛋白的阳性克隆则需要在荧光显微镜下观察选取，因此SEGFP在克隆筛选上明显优于GFP蛋白。所以利用SEGFP蛋白可以增加细胞筛选的通量，在细胞克隆的早期筛选过程就挑取到高表达的克隆。
[0027]实施例4、分泌型绿色荧光蛋白便于细胞克隆产量的比较
[0028]将筛选到的4株SEGFP细胞克隆进行传代培养，每周3次。每次传代时按照0.5 X 106/ml密度，按照IOml/瓶的培养体积50ml摇瓶进行细胞接种，在CO2培养箱中37°C，5% C02，150rpm培养。将筛选到的细胞克隆培养6周以上，每次细胞传代时使用台盼蓝染色法，在血球计数板上计数死活细胞数目。同时检测细胞培养上清中的荧光强度，检测到的荧光强度表明4株细胞之间的荧光强度均在3000-12000之间波动，平均值可见有一定差异。
[0029]我们借助分泌蛋白的单细胞表达产量的概念，构建了一个可以量化细胞表达水平的指标一单细胞单日的荧光强度(QFI)，该指标可以扣除了细胞培养密度和代次的影响，反映不同细胞克隆中对数生长期的单个细胞的GFP表达能力。计算四株细胞克隆的QFI则表明其QFI平均值范围在1.5-3.0X 10_3FI/cell/Day左右，统计分析表明不同细胞克隆之间表达产量QFI有明显差异。其中SEG-3A3表达水平显著高于SEG-3G4和SEG-4D1 (p< 0.001)，而 SEG-1Bl 克隆的产量稍高于 SEG-3G4 和 SEG-4D1 (p < 0.05)(图 3)。而且SEG-3G4和SEG-4D1在荧光强度的比较上可以发现SEG-3G4的平均荧光强度还是要高于SEG-4D1的值，但是QFI的分析就表明SEG-3G4和SEG-4D1的平均值基本没有差异，说明两者的表达水平相当。
[0030]因此利用SEGFP可以使得GFP分泌到细胞外，在早期细胞克隆筛选过程中可以快速简便的利用胞外的荧光强度筛选出表达水平高的细胞克隆，而进一步的在摇瓶上扩大培养时，通过计算单细胞产量QFI代替荧光强度，消除细胞密度带来的影响，可以更加真实的反映出细胞克隆的表达能力，较为简单的区分出克隆表达水平的高低。
[0031]实施例5、分泌型绿色荧光蛋白可用于细胞克隆表达稳定性分析
[0032]对于筛选的SEGFP细胞克隆，按照每周3次进行传代培养。使用50ml摇瓶，按照IOml/瓶的培养体积，37°C，5% C02,150rpm培养。将筛选到的细胞克隆在50ml摇瓶中培养6周以上，每次细胞传代时使用台盼蓝染色法，在血球计数板上计数死活细胞数目。同时收集每个代次的细胞培养液上清，检测上清中荧光强度，根据活细胞密度计算单细胞单曰的荧光强度(QFI)，通过比较不同细胞克隆的QFI变化可以判断细胞克隆表达的稳定性，从而筛选出能够持续稳定高表达的细胞克隆。
[0033]对于利用GFP构建的细胞克隆来说，分析细胞克隆稳定性的方法主要是通过流式细胞仪进行细胞克隆的群体分析，根据流式分析中不同代次GFP阳性细胞的比例(Qiao，J.等 Molecular Biology (2009) 390 (4):579-59)及加权平均荧光强度的的变化(Bailey，C.G 等 Biotechnology and Bioengineering (2002) 80 (6):670-676)来反映细胞克隆的表达是否稳定。我们使用的SEGFP在细胞内也能够检测到荧光强度的高低，利用流式细胞仪分析上述4株细胞克隆第4代和第13代的细胞后发现SEG-4D1群体确实向产量低的方向明显偏移，而另外3株细胞克隆两次流式分析几乎没有变化，表明这些细胞克隆稳定性较好。
[0034]同时，我们检测了上述细胞克隆培养上清中的荧光强度，计算不同细胞克隆之间传代过程中QFI的变化，来反映细胞克隆的表达水平的变化。结果显示4株细胞克隆在第4代和第13代的QFI的比较情况，和流式分析的结果的一致，SEG-4D1的QFI从第4代的
3.14X10_3FI/cell/day 下降到第 13 代的 1.99 X l(T3FI/cell/day，降低了大约 35%，并且统计分析两个代次之间的产量有显著差异(P < 0.05)。另外3株克隆与流式分析结果相似，QFI没有显著变化，可以认为这些克隆在传代过程中保持稳定。
[0035]由于流式分析方法成本高，操作步骤复杂，实践中只能通过比较单一代次的变化来评判细胞稳定性。而单一代次的比较可能出现一定的误差，并且无法准确反映细胞产量变化趋势。因此如何简单便捷的检测目的基因表达水平的变化并且准确判断出稳定的细胞克隆也是工业上筛选高表达细胞系的关键步骤。对于SEGFP蛋白来说，我们可以在每次传代培养后检测上清中的荧光强度，并计算QFI的值，按照每个代次的QFI值进行回归分析，可以得到与上述结果相同的结论，并且随时监控细胞产量的变化情况，达到早期判定细胞稳定性的目的。但是由于代次之间的误差，使得QFI在每代的结果会出现高低的差异，不易直观的反映细胞克隆的稳定性(未出示结果)。于是我们以多个代次的QFI平均值代表细胞的表达能力，随着传代次数的增加，对于稳定的细胞系QFI的均值应该会逐渐趋向平稳。而表达水平不稳定的细胞，由于群体的不均一性，细胞克隆的QFI的均值会表现出明显的下降趋势。
[0036]对于工程细胞系来说，除了生长稳定的要求外，同样重要的就是产量的稳定。对于细胞内的GFP流式细胞仪的分析虽然可以比较出细胞克隆的表达稳定与否，但是方法依赖于昂贵的设备，而且仪器在不同时间点检测时存在系统的误差，难于进行细致的比较。SEGFP作为分泌型的GFP，其检测方法简便，误差小，可以随时监测细胞产量的变化。传代培养过程中计算得到的QFI也可以直接用于细胞克隆表达稳定性的分析。在每次细胞传代后，可以使用多功能酶标仪进行荧光强度的检测并计算得到QFI，每得到一个新的数据后，就可以结合该数据进行QFI平均值的分析，从而在早期筛选出表达稳定的细胞株。[0037]实施例6、分泌型绿色荧光蛋白用于流式细胞仪的细胞分选
[0038]根据实施例2的方法，收集细胞培养液上清和细胞裂解液。首先比较SEGFP细胞克隆胞内外荧光强度的相关性，以确定SEGFP细胞内外的表达高低是否有一致性。结果显示SEGFP细胞克隆胞内外荧光强度的相关性十分显著(R2值=0.866)。在SEGFP的细胞克隆中，胞内荧光强度高的细胞克隆其分泌到胞外的荧光蛋白也有相应高水平的荧光强度，表明SEGFP细胞克隆的细胞内外的荧光强度相关性很好，为利用流式分选的筛选分泌荧光强度高的细胞提供实验基础。而且不同SEGFP细胞克隆胞外的荧光强度可以达到600-1300，不仅明显高于阴性对照，而且克隆之间的荧光强度有700左右的差异，保证了足够大的区分区间可以便于筛选GFP表达水平高的细胞克隆。
[0039]根据Kaufman, ff.L.等的方法.(Nucleic Acids Research36 (17):elll-elll(2008))，收集瞬时转染后第3天的细胞，使用2ml培养基重悬后，转入BD的细胞分选收集管中，以488nm作为激发光检测GFP的荧光强度，使用FACS Calibur (BDBiosciences, San Jose, CA, USA)收集SEGFP表达最高的10%的细胞。将收集的细胞加入
0.6mg/ml G418筛选稳定表达的细胞，7天后再一次进行细胞分选，然后将收集到的细胞逐渐培养扩大得到细胞群。将收集前的细胞及2次富集后的细胞群体按照统一的条件进行流式分析表明，随着分选次数的增加流式分析的荧光曲线明显向右偏移。阳性细胞的百分比在分选前只有34.37%,经过一次FACS阳性比例增加到73.9%，二次FACS后阳性细胞达到了 95.28%，而且其荧光强度的加权平均值也是分选前的5倍。
[0040]我们还比较了传统的有限稀释法得到的细胞克隆与分选后的SEGFP阳性细胞筛选的单细胞克隆产量的高低。比较筛选到的克隆的胞外荧光强度的分布，其中传统的有限稀释法得到的绝大多数细 胞克隆表达量很低，随着荧光强度的增加克隆的分布迅速减少。而利用FACS得到的细胞克隆中荧光强度低于200 (FI = 0-200)的克隆比例不超过15%，而荧光强度超过500的细胞克隆比例大约为55%，并且还筛选到荧光强度大于900的细胞克隆。但是利用FACS富集后GFP的细胞群体在进行单克隆化的过程中，由于GFP是在细胞内的表达的，对于克隆的表达水平的判断及稳定性的分析，需要借助流式细胞仪或荧光显微镜，这就影响了筛选的通量。而由于SEGFP蛋白细胞内外荧光强度的高度一致性，可以首先使用它在流式细胞仪上进行细胞分选，然后通过检测培养基中的荧光强度快速高通量的筛选分选后的细胞克隆。因此SEGFP可以十分简便的应用于FACS并能够在随后的亚克隆中高通量的筛选高产单细胞克隆。
【权利要求】
1.一种包含有附录所示序列的分泌型绿色荧光蛋白(SEGFP)。
2.如权利要求1所述的分泌型绿色荧光蛋白含有人IgGkappa链的信号肽。
3.如权利要求1所述的分泌型绿色荧光蛋白可以在哺乳动物细胞中分泌到细胞培养液中。
4.如权利要求1所述的分泌型绿色荧光蛋白在早期的细胞克隆快速筛选中的应用。
5.如权利要求1所述的分泌型绿色荧光蛋白在稳定表达细胞克隆表达水平的比较的应用。
6.如权利要求1所述分泌型绿色荧光蛋白可以用于稳定细胞系表达水平稳定性的比较。
7.如权利要求1所述分泌型绿`色荧光蛋白可以用于流式细胞仪的细胞分选。
【文档编号】C12N15/12GK103773770SQ201210394984
【公开日】2014年5月7日 申请日期:2012年10月18日 优先权日:2012年10月18日
【发明者】高峰, 石磊, 唐文英, 刘新军, 孙雷 申请人:高峰, 石磊