专利名称：一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法及应用，通过研究和改进莽草酸生产途径的相关基因和节点的影响，实现大肠杆菌细胞过量合成和积累莽草酸。 属于微生物基因工程技术领域。
背景技术：
莽草酸(Shikimic acid)是一种芳香族化合物，含有三个羟基、一个羧基和一个双键，具有手性异构体结构。不仅是手性药物(如抗病毒药)的原料，同时也是许多生物碱、芳香族氨基酸与吲哚衍生物的合成原料。更重要的是，它是神经氨酸酶抑制剂GS4104 (达菲)的关键原材料，可用于合成预防与治疗禽流感和甲型流感的药物。其理化性质如表I 所示。
表I莽草酸的理化性质
权利要求
1.一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌株，其分类命名为大肠杆菌coin BOO13 (SA4/pTHGAA),该重组菌株染色体DNA中有4个基因被删除，同时有3个基因过量表达；删除的基因为莽草酸激酶I基因arot莽草酸激酶II基因aroZ，葡萄糖磷酸转移酶系统的关键蛋白EIIBCele基因和圭尼酸/莽草酸脱氢酶基因；过量表达的基因是3_脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸合成酶基因eiroGt转酮酶A基因认 儿磷酸烯醇式丙酮酸合成酶A基因中的Γ3个。
2.权利要求1所述产莽草酸的大肠杆菌重组菌株的构建方法，其特征在于步骤如下(1)利用同源重组原理，以野生型大肠杆菌B0013为出发菌株，依次删除CICMB0013 染色体上aroK, aroL，p tsG和ydiB基因，获得菌株BOO13 SA4 ；(2)利用PCR技术分别扩增来源于CICIMB0013菌株的aro#，tktA和基因片段；(3)将aro以，tktA和基因插入pTH18Kr载体中，构建过量表达这三个基因的表达载体的重组质粒，命名为pTHGAA ；(4)将步骤(3)获得的表达载体pTHGAA导入步骤(I)的B0013SA4菌株中，筛选获得转化子，命名为大肠杆菌BOO13 (SA4/pTHGAA)。
3.根据权利要求2所述产莽草酸的大肠杆菌重组菌株的构建方法，其特征在于aro# 基因是解除了反馈抑制的突变基因，其突变位点在该基因编码蛋白的第146位氨基酸位点，Asp 146 Asn ;即将该基因编码蛋白中146位的天冬氨酸密码子突变为天冬酰酸。
4.根据权利要求2所述产莽草酸的大肠杆菌重组菌株的构建方法，其特征在于步骤(3)中过量表达基因所用表达载体是pTH18kr，但不仅限于该载体。
5.用权利要求1所述大肠杆菌重组菌株发酵生产莽草酸的方法，其特征在于从LB平板上挑取大肠杆菌B0013 (SA4/pTHGAA)单菌落接种于LB液体培养基中，37 °C培养过夜，然后按4%的接种量接种于发酵培养基中，37°C培养，发酵过程中控制碳源浓度在10 g/L，发酵时间60 h ；发酵培养基组成以 g/ L 计为Na2HPO4 · H2O 13，KH2PO4 3，NaCl 0.5，NH4Cl 0. LMgSO41.2,L-苯丙氨酸0. 7,L-色氨酸0. 35,L-酪氨酸0. 7,朽1檬酸铁铵0. 3,—水合朽1檬酸2.1, 对羟基苯甲酸0. 01，对氨基苯甲酸钾0. 01，2，3-二羟基苯甲酸0. 01，酵母抽提物15，蛋白胨 20，碳源25，以纯净水配制；所使用的碳源为葡萄糖、木糖、阿拉伯糖或其组合；发酵结束时莽草酸的含量达到 20g/L。
全文摘要
一株产莽草酸的大肠杆菌重组菌及其构建方法及应用，属于微生物基因工程技术领域。本发明首先利用分子生物学技术删除了大肠杆菌CICIMB0013的莽草酸激酶I基因(aroK)、莽草酸激酶II基因(aroL)，以及葡萄糖磷酸转移酶系统的关键蛋白EIIBCGlc的基因(ptsG)和圭尼酸/莽草酸脱氢酶基因(ydiB)，获得了大肠杆菌突变株CICIMB0013·SA4(△aroK,△aroL,△ptsG,△ydiB)。本发明还构建了含有莽草酸代谢途径中关键基因aroG*，ppsA，tktA的重组表达质粒pTHGAA，然后将重组表达质粒pTHGAA电转入重组菌CICIMB0013·SA4中，获得高效生产莽草酸的重组菌大肠杆菌B0013(SA4/pTHGAA)。本发明的大肠杆菌重组菌能够实现发酵过程中莽草酸的高效累积。
文档编号C12N1/21GK102994439SQ20121053391
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者陈献忠, 李明明, 王正祥 申请人:江南大学