一种培养人羊膜间充质干细胞的方法
【专利摘要】本发明涉及一种培养人羊膜间充质干细胞的方法。它包括如下步骤：取新鲜采集的人羊膜，清洗，放入羊膜保护液中2-8℃保存备用；取浸泡在羊膜保护液中不超过48小时的人羊膜，清洗，再依次置临用新配的青霉素钠和硫酸链霉素含量分别为2500-3500U/mL和3500-4500U/mL的氯化钠溶液和每毫升含30-50U注射用两性霉素B的甲硝唑注射液中进行浸洗，最后再清洗后置于一次性无菌培养皿中进行备用，然后分离，培养至细胞融合度达80-90%即得。本发明能避免动物血清及动物来源的试剂带来的潜在的危险性；48小时内均可用于羊膜间充质干细胞的培养，可操作性强；可大大减少因霉菌、厌氧菌污染造成的间充质干细胞分离培养不合格的几率。
【专利说明】一种培养人羊膜间充质干细胞的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及一种培养人羊膜间充质干细胞的方法。
【背景技术】
[0002]干细胞是一种未分化的细胞，有两个基本特性，一是具有自我复制能力，二是能分化成一种以上的功能细胞，根据分化潜能的大小，干细胞一般分成三类，第一类是全能干细胞(totipotent stem cell)，其可以分化为功能一致的全能细胞，可以发育为胎儿；第二类是多潜能干细胞(pturipotent stem cel),它能够分化为身体中的每种细胞类型,但是不能形成羊膜或胎儿发育所必需的支持组织。由于多潜能干细胞的分化潜能不是“全体”的，因此不将这种细胞称为“全能”，而且它们不是胚胎。多潜能干细胞进一步特化为多能(multiPotent)干细胞,其专用于分化为特定功能特化的特定种系的细胞。多能干细胞能够分化为它们所源自的组织中含有的细胞类型；例如血液干细胞只能够分化为红血细胞、白血细胞和血小板。胚胎干细胞(Embryonic stem cell)具有广泛的潜能,能生成除羊膜外的机体所有的组织细胞；第三类是成体干细胞(aduit stem cell)是一种将拥有终生自我复制(identical copies)和自我更新(self-renewal)能力的未分化细胞，它分布于不同的组织，并可演变成为各种类型的资质细胞。干细胞的分类，主要分为造血干细胞及非造血干细胞。造血干细胞主导血液、免疫方面的疾病，来源例如胎盘血；非造血干细胞则以细胞分化与修复为主，可应用于中风、糖尿病、老年痴呆等再生医学，来源有脐带、羊膜、乳牙等。
[0003]间充质干细胞(mesenchymal stem cell MSC)是可形成多种细胞类型的多能干细胞。间充质干细胞(MSC)最早在骨髓中发现，随后还发现存在于人体发生、发育过程的许多种组织中。鉴于间充质干细胞具有多向分化潜能、能支持造血和促进造血干细胞植入、调节免疫以及分离培养操作简便等特点，正日益受到人们的关注。间充质干细胞的应用范围也越来越广泛。目前国内外已开展了多项临床应用研究，主要疾病类型包括骨关节炎疾病、肝硬化、移植物宿主排斥反应(GVHD)，脊髓损伤及退行性神经系统疾病和糖尿病等。
【发明内容】
[0004]本发明所要解决的技术问题在于提供一种培养人羊膜间充质干细胞的方法。
[0005]为解决本发明的技术问题，本发明采用的技术方案如下:
一种培养人羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于:它包括如下步骤:
(1)取新鲜采集的人羊膜，清洗，放入羊膜保护液中2-8°C保存备用，所述的羊膜保护液是在AIM-V培养基中加入青霉素钠和硫酸链霉素得到的，其中青霉素钠和硫酸链霉素在羊膜保护液中的终浓度分别为100-200 U/mL和100-200 U /mL ；
(2)取浸泡在羊膜保护液中不超过48小时的人羊膜，清洗，再依次置临用新配的青霉素钠和硫酸链霉素含量分别为2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化钠溶液和每毫升含30-50 U两性霉素B的甲硝唑注射液中进行浸洗，最后再清洗后置于一次性无菌培养皿中进行备用；(3)将无菌清洗过的人羊膜剪碎，加入AIM-V培养基，置分离管中用全自动组织分离器进行分离，得羊膜组织匀浆；
(4)将全自动组织分离器处理好的羊膜组织匀浆进行离心，弃上清，收集下层，置于培养瓶中，然后向其中加入无血清培养基，置于36-38°C、饱和湿度、体积分数为5%的CO2孵育箱中培养，至观察到瓶壁上形成多个大小不一、细胞数量密集的细胞岛时，则获得人羊膜间充质干细胞原代细胞混合液，然后经离心，即可获得人羊膜间充质干细胞原代细胞，再经传代培养至细胞融合度达80-90%即得。
[0006]按上述方案，所述步骤(1)中的羊膜保护液是将注射用青霉素钠和注射用硫酸链霉素预先溶解后再加入到AIM-V培养基(治疗级)中得到的；所述步骤(2)中青霉素钠和硫酸链霉素含量分别为2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化钠溶液是将注射用青霉素钠和注射用硫酸链霉素按一定量加入0.9%氯化钠注射液中混合得到的；所述每毫升含30-50 U两性霉素B的甲硝唑注射液的配制是将注射用两性霉素B先用0.9%氯化钠注射液溶解后，再和一定量的甲硝唑注射液混合得到的；所述人羊膜在青霉素钠和硫酸链霉素含量分别为2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化钠溶液和每毫升含30-50 U两性霉素B的甲硝唑注射液中的浸洗时间均为8-12min。
[0007]按上述方案，所述步骤(1)和步骤(2)中的清洗均为0.9%氯化钠注射液清洗。
[0008]按上述方案，所述的步骤(4)为培养5-6天后，取出未贴壁的上层置另一新培养瓶中，向原培养瓶和新培养瓶中均加入无血清培养基继续培养，并每隔3-4天换液一次，待培养10-15天后即可获得人羊膜间充质干细胞原代细胞；
然后将原培养瓶和新培养瓶中的培养基完全移出，往原培养瓶和新培养瓶中加入质量百分数为0.25%的重组动物胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液浸没贴壁细胞，放入36~38°C培养箱保温消化7-9分钟，当观察到贴壁细胞圆缩，且已经脱离瓶底后，加入消化液同等体积的无血清培养基终止消化，然后转移至离心管中，离心弃上清，吹匀沉淀在离心管底部的细胞，再根据4000-6000个细胞/cm2接种到培养瓶中，并向培养瓶中补充无血清培养基，置36~38°C、饱和湿度，体积分数为5%的CO2孵育箱中培养，每3-4天全量换液一次，至贴壁细胞彼此融合，且融合度达80-90%，即得人羊膜间充质干细胞，在有需要时，可重复上述操作进行多代细胞培养扩增。
[0009]按上述方案，所述T25培养瓶可放置不超过5g的人羊膜经全自动组织分离器处理、离心后的下层组织进行培养；所述T75培养瓶可放置10-15 g的人羊膜经全自动组织分离器处理、离心后的下层组织进行培养；所述T175培养瓶可放置30-35 g的人羊膜经全自动组织分离器处理、离心后的下层组织进行培养；
所述T25培养瓶中需要的无血清培养基的体积为6-8mL ;所述T75培养瓶中需要的无血清培养基的体积为20-25mL ;所述T175培养瓶中需要的无血清培养基的体积为30_35mL。
[0010]人羊膜间充质干细胞的分离制备首先要求羊膜组织具有一定的活性，一般为保证羊膜组织的活性，需要对羊膜进行及时处理，而这也给实际应用带来了障碍。本发明通过将新鲜采集的羊膜置于羊膜保护液中保存，既可达到对羊膜中残留的微生物杀菌的作用，又能维持羊膜组织的活性的目的。使用本发明的羊膜保护液2-8°C进行保存的羊膜在48小时内均可用于出羊膜间充质干细胞的培养，这给实际制备生产带来了极大的可操作性。
[0011]除此，本发明在对羊膜进行无菌清洗时，除使用青霉素钠和硫酸链霉素的氯化钠溶液进行无菌处理外，本发明还特别结合羊膜的自身污染特点，尤其是顺产收集的人羊膜易受厌氧菌和霉菌污染的问题，特别添加了注射用两性霉素B的甲硝唑注射液中进行无菌处理，而由此可明显提高人羊膜间充质干细胞培养的成功率。其中，甲硝唑注射液主要可用于抗厌氧菌感染、抗滴虫的治疗，注射用两性霉素B是多烯类抗真菌药物，其可破坏新型隐球菌、皮炎芽生菌、组织胞浆菌、球孢子菌属、孢子丝菌属、念珠菌属等真菌细胞的正常代谢从而抑制其生长。但是注射用两性霉素B对细胞有一定的毒性，本发明经过反复实验研究发现，通过控制两性霉素B的浓度，可达到使其发挥作用但又不影响羊膜间充质干细胞的活性的目的。
[0012]本发明的有益效果:
(1)本发明全程使用无血清无动物来源的试剂及利用全自动组织处理器，替代传统人羊膜间充质干细胞培养中使用的的胎牛血清、动物来源的胰蛋白酶及胶原酶，在临床应用中能避免动物血清及动物来源的试剂带来的潜在的危险性；
(2)采集后放入羊膜保护液，能起到保持离体组织活性的作用，使得生产制备有更强的操作性，在48小时内分离制备，仍能分离出活性好的羊膜间充质干细胞；
(3)羊膜清洗过程除使用广谱的青链霉素进行无菌处理外，加入两性霉素B和甲硝唑注射液，对分娩过程中带有霉菌、厌氧菌的羊膜处理非常有效，可大大减少因霉菌、厌氧菌污染造成的间充质干细胞分离培养不合格的几率。
【具体实施方式】
[0013]实施例1
1.胎盘娩出后，用0.9%氯化钠注射液即9g/L的氯化钠注射液冲洗胎盘上的血迹及污物，分离胎盘最内层的羊膜，经0.9%氯化钠注射液即9g/L的氯化钠注射液清洗后加入到羊膜保护液中于2-8°C保存，所述的羊膜保护液将注射用青霉素钠和注射用硫酸链霉素分别先用少量AIM-V培养基溶解后加入到AIM-V培养基(治疗级)中，其中青霉素钠和硫酸链霉素在羊膜保护液中的终浓度分别为200U/mL和200U/mL。如此，将羊膜放于羊膜保护液中于2-8°C保存进行保存，可使羊膜在羊膜保护液的保护下48小时内皆可用于分离制备间充质干细胞。
[0014]2.人羊膜的无菌清洗
用无菌镊子从羊膜保存液中取出人羊膜放入灭菌容器中，加入250mL 0.9%氯化钠注射液，用8cm无菌镊子将人羊膜来回震荡漂洗一次。后再用无菌镊子将人羊膜转移到另一灭菌容器中，加入250mL临用新配的青霉素钠和硫酸链霉素分别为3200U/mL、4000U/mL的氯化钠溶液(浓双抗溶液)，每隔1-2分钟用无菌镊子将人羊膜来回震荡几次，共浸洗10分钟。再用无菌镊子将人羊膜夹起，转移到灭菌容器中加入每毫升含50单位注射用两性霉素B的甲硝唑注射液，以同样的方法浸洗10分钟。浸洗后用8cm无菌镊子将人羊膜夹起，再置另一灭菌容器中，加入0.9%氯化钠注射液，并将人羊膜来回震荡清洗三次,清洗后的人羊膜分置于一次性无菌培养皿中。
[0015]上述浓双抗溶液为临用前新配，具体配制方法为:取80万单位的注射用青霉素钠和100万单位的注射用硫酸链霉素各一支加入到250mL 0.9%氯化钠注射液中而得。
[0016]上述每毫升含50U两性霉素B的甲硝唑注射液的配制:取2.5万单位的注射用两性霉素B —支，加入5mL 0.9%氯化钠注射液溶解，然后取前述溶液ImL和IOOmL甲硝唑注射液中混匀而得。
[0017]将最后清洗羊膜用的0.9%氯化钠注射液抽取样品并经薄膜过滤法进行微生物情况检测，得:经14天培养样品未见细菌、霉菌生长。
[0018]3.人羊膜干细胞的分离制备
将一次性无菌培养皿中无菌处理过的人羊膜用5cm无菌剪刀剪碎。每次取IOg置C管(全自动组织处理器配套分离管)，加入SmLAM-V培养基，经全自动组织分离器处理如在全自动组织处理器(C一01)程序下搅拌2次进行处理，然后转移至50mL离心管中；用同样的方法处理剩余的人羊膜组织，直至全部分离完所有的人羊膜组织。
[0019]将全自动组织处理器处理获得的人羊膜匀浆在300g下离心15min，弃上清，收集下层，分别置于2个T25培养瓶中，然后向其中加入无血清培养基后，将培养瓶置36~38°C、饱和湿度、体积分数为5%的CO2孵育箱中培养。培养瓶的数量可根据处理羊膜的重量来选择，一般T25培养瓶可约放置不超过5g的人羊膜经全自动组织分离器处理、离心后的组织。T25培养瓶加入的培养基为6-8mL。
[0020]4.人羊膜间充质干细胞原代培养
培养5天后，取未贴壁的上层置另一培养瓶中，然后在两培养瓶中均加入无血清培养基继续进行培养，并每隔3-4天换液一次，约10-15天后可用倒置显微镜观察到有贴壁细胞生长，接着继续培养，能观察到贴壁细胞逐渐增殖成较大的细胞集落。当观察到细胞培养瓶壁形成多个大小不一、细胞数量密集的细胞岛时，即获得人羊膜间充质干细胞原代细胞混合液，再经离心，即可获得人羊膜间充质干细胞原代细胞。
[0021]5.人羊膜间充质干细胞传代
将培养瓶中的培养基完全移出，往培养瓶中加入质量百分数为0.25%的重组动物胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液(T25加3mL，T75加4mL，T175加6mL)，然后放入36~38°C培养箱保温消化约7-9分钟，在此过程中在倒置显微镜下观察到贴壁细胞圆缩，且细胞已经脱离瓶底后，加入消化液同等体积的无血清培养基终止消化，然后转移至离心管中，用双目显微镜上用计数板计数及其苔盼蓝染色计细胞活性。然后将离心管置300g条件下离心5min，离心后弃上清，用巴氏管轻轻吹匀沉淀在离心管底部的细胞，再根据4000-6000个细胞数/cm2接种到培养瓶中，并做好标记，向培养瓶中补充无血清培养基，置36~38°C、饱和湿度，体积分数为5%的CO2孵育箱中培养，每3-4天全量换液一次。当培养24h后，传代细胞开始贴壁，成单个分散长条形细胞，3-4天后通过全量换液可去除未贴壁细胞，此时细胞为融合度达到50%左右的长梭形细胞。约6天后细胞基本能达到80%以上的融合，即可得间充质干细胞，然后根据需要可重复上述操作进行P2、P3、P4……传代。
[0022]实施例2
1.胎盘娩出后，用0.9%氯化钠注射液即9g/L的氯化钠注射液冲洗胎盘上的血迹及污物，分离胎盘最内层的羊膜，经0.9%氯化钠注射液即9g/L的氯化钠注射液清洗后加入到羊膜保护液中于2-8°C保存，所述的羊膜保护液为AIM-V培养基(治疗级)中加入青霉素纳和硫酸链霉素，其中青霉素纳和硫酸链霉素在羊I旲保护液中的终浓度分别为100U/mL和100U/mL。如此，将羊 膜放于羊膜保护液中于2-8°C保存进行保存，可使羊膜在羊膜保护液的保护下48小时内皆可用于分离制备间充质干细胞。[0023]2.人羊膜的无菌清洗
用无菌镊子从羊膜保存液中取出人羊膜放入灭菌容器中，加入0.9%氯化钠注射液，用8cm无菌镊子将人羊膜来回震荡漂洗一次。后再用无菌镊子将人羊膜转移到另一灭菌容器中，加入临用新配的青霉素钠和硫酸链霉素分别为2500U/mL、3500U/mL的氯化钠溶液(浓双抗溶液)，每隔1-2分钟用无菌镊子将人羊膜来回震荡几次，共浸洗8分钟。再用无菌镊子将人羊膜夹起，转移到灭菌容器中加入每毫升含30U两性霉素B的甲硝唑注射液，以同样的方法浸洗8分钟。浸洗后用8cm无菌镊子将人羊膜夹起，再置另一灭菌容器中，加入0.9%氯化钠注射液，并将人羊膜来回震荡清洗三次，清洗后的人羊膜分置于一次性无菌培养皿中。
[0024]上述浓双抗溶液为临用前新配，其具体配制和每毫升含30U注射用两性霉素B的甲硝唑注射液的配制方法参考实施例1。
[0025]将最后清洗羊膜用的0.9%氯化钠注射液抽取样品并经薄膜过滤法进行微生物情况检测，得:经14天培养样品未见细菌、霉菌生长。
[0026]3.人羊膜干细胞的分离制备
将一次性无菌培养皿中无菌处理过的人羊膜用5cm无菌剪刀剪碎。每次取IOg置C管(全自动组织处理器配套分离管)，加入8mL AIM-V培养基，经全自动组织分离器处理，然后转移至50mL离心管中；用同样的方法处理剩余的人羊膜组织，直至全部分离完所有的人羊膜组织。
[0027]将全自动组织处理器处理获得的人羊膜匀浆离心，弃上清，收集下层，置于培养瓶中，然后向其中加入无血清培养基后，将培养瓶置36~38°C、饱和湿度、体积分数为5%的CO2孵育箱中培养。
[0028]4.人羊膜间充质干细胞原代培养
培养5-6天后，取未贴壁的上层置另一培养瓶中，然后在两培养瓶中均加入无血清培养基继续进行培养，并每隔3-4天换液一次，约10-15天后可用倒置显微镜观察到有贴壁细胞生长，接着继续培养，能观察到贴壁细胞逐渐增殖成较大的细胞集落。当观察到细胞培养瓶壁形成多个大小不一、细胞数量密集的细胞岛时，即获得人羊膜间充质干细胞原代细胞混合液，再经离心，即可获得人羊膜间充质干细胞原代细胞。
[0029]5.人羊膜间充质干细胞传代
将培养瓶中的培养基完全移出，往培养瓶中加入质量百分数为0.25%的重组动物胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液，然后放入36~38°C培养箱保温消化约7-9分钟，在此过程中在倒置显微镜下观察到贴壁细胞圆缩，且细胞已经脱离瓶底后，加入消化液同等体积的无血清培养基终止消化，然后转移至离心管中，用双目显微镜上用计数板计数及苔盼蓝染色计细胞活性。然后将离心管离心，弃上清，用巴氏管轻轻吹匀沉淀在离心管底部的细胞，再根据4000-6000个细胞数/cm2接种到培养瓶中，并做好标记，培养瓶中补充无血清培养基，置36~38°C、饱和湿度，体积分数为5%的CO2孵育箱中培养，每3-4天全量换液一次。当培养24h后，传代细胞开始贴壁，成单个分散长条形细胞，3-4天后通过全量换液可去除未贴壁细胞，此时细胞为融合度达到50%左右的长梭形细胞。约6天后细胞基本能达到80%以上的融合，即可得间充质干细胞，然后根据需要可重复上述操作进行P2、P3、P4……传代。
[0030]将实施例1和2得到的间充质干细胞进行流式细胞检测，检测方法及结果见下:实验原理:利用流式细胞技术检测荧光标记抗体。根据抗原抗体结合原理，用特定荧光素标记的抗体对已知携有相应抗原的细胞进行染色。经荧光素标记抗体染色的细胞可以被流式细胞仪识别，并根据已知细胞所携带的荧光素的强度，对标记抗体进行定性，定量分析。
[0031]检测步骤:
(1)取5根流式管，分别标记为对照管①FITC/PE/APC②FITC/PE样本管③90/34/14④DR/105/19 ⑤ 45/34。
[0032](2)各流式管分别加入相同量的传代细胞(有核细胞数2-5X IO5个)，不可粘到管壁。
[0033](3)对照管①加入 Mouse IgG2a_PE、Mouse IgGl-FITC、Mouse IgGl-APC 分别5 ul，混匀；对照管②加入Mouse IgG2a_PE、Mouse IgGl-FITC分别5 ul，混匀；样本管③加入 CD90-FITC、CD73-PE、CD14-APC 分别 5 ul，混匀；样本管④加入 DR-FITC、CD105-PE、⑶19-APC分别5 ul，混匀；样本管⑤加入⑶45-FITC、⑶34-PE分别5 ul，混匀。
[0034](4)室温避光放置 15min,加入 2mL PBS/ 管，1400 rpm/min,离心 5min。
[0035](5)上清，将管内细胞弹起，加入0.5mL PBS,混匀，上机检测(若不能及时上机，应加入多聚甲醛固定)。
[0036](6)上机分析结果得:CD73、CD90、CD105 大于 95%，为阳性；CD14、CD19、CD34、CD4、5HLA-DR小于2%，为阴性。
[0037]上述说明:按照实施例中的方法分离培养得到的人羊膜间充质干细胞，满足CD73、CD90、CD105 大于 95%，为阳性；CD14、CD19、CD34、CD4、5HLA_DR 小于 2%，为阴性的结
果，经鉴定为间充质干细胞。
[0038]上述无菌检测过程中使用的薄膜过滤法如下:
无菌检查法包括比薄膜过滤法和直接接种法，薄膜过滤法能避免能有效去除抗生素及其他水溶性物质对无菌检测的干扰，能更准确地反映细胞培养过程中微生物存在的状态。
[0039]本实施方案的无菌检测采依照《中国药典2010版》薄膜过滤法检测，采用HTY-601集菌仪和APY系列培养器。无菌检测的全过程均在环境洁净度10000级下局部洁净度100级的单向流空气区域内进行，其全过程严格遵守无菌操作，防止微生物污染。隔离系统内部环境的洁净度符合无菌检查的要求。
[0040]具体实施步骤如下:
(I)取出培养器先检查包装是否完好无损。检查用滤膜孔径应不大于0.45 μ m，直径约为50_。根据供试品特性选择滤膜材质，滤器及滤膜使用前应经适宜的方法灭菌。使用时，应保证滤I旲在过滤如后的完整性。
[0041](2)将培养器逐个插放在不锈钢座上，将培养器的弹性软管装入集菌仪泵头，注意定位准确，软管走势顺畅。
[0042](3)润湿滤膜:选用PH7.0的氯化钠_蛋白胨缓冲液作为冲洗液，用75%乙醇或0.2%洗洁尔灭仔细对带胶塞的冲洗液瓶表面进行消毒(特别是容器顶部需要穿刺的部位)，干燥。然后将培养器导管上的针头插至冲洗液容器胶塞内，开启集菌仪，调节转速为160RMP，启动约3秒之后倒置冲洗液瓶并置于载瓶架上，每只杯体内注入约50ml冲洗液，润湿滤膜(润湿液无需滤干)，取下冲洗液瓶直立于操作台面上，排空液体后停止集菌仪。
[0043](4)供试品的稀释、转移、过滤:用75%乙醇或0.2%洗洁尔灭仔细对样品管装供试品表面进行消毒，干燥。打开样品管的盖子，将样品管身以45°C角握住，然后将培养器导管上的针头插至样品管的底部，开启集菌仪，调节转速为160RMP，将供试液转移至杯体内并进行过滤，待供试液排放尽，停止集菌仪。
[0044](5)冲洗:取下杯体滤杯上端口的弹性护帽。将针头插入冲洗液瓶内，开启集菌仪，调节转速为160RMP，再将冲洗液瓶倒置，向每只杯体内注入约IOOmL左右冲洗液，冲洗3次。冲洗完成后取下红色护帽泄压，使用黄色帽塞封闭出液口(旋转推紧)，然后将培养基重新放入排液槽中。特别注意:在冲洗时，不建议对杯体进行过度振摇，否则导致冲洗液进入空气过滤器。
[0045](6)加培养基:
用红色夹片夹住培养器四通和定位扣处的另外一管。以100R转速启动集菌仪，再倒置培养基瓶，使所有硫乙醇酸盐流体培养基转移到培养器杯体内。先用绿色夹片夹住另两管，再把红色夹片拿掉，注入改良马丁培养基，仪器操作方法同加硫乙醇酸盐流体培养基。当两个杯体全加满培养基时，用相对应的夹片夹住离培养器杯体上方2~3cm处的软管，同时剪下两根软管，留下5~6cm，并将另一头插入杯体的空气过滤器处。(剪刀需过酒精灯火焰)
(7)取相应的冲洗液同法操作，作为阴性对照。
[0046](8)将已操作完毕的含培养基的集菌培养器移出无菌室，取其一管作阳性对照，依阳性对照菌选择原则加入相应对照菌液。
[0047](9)硫乙醇酸盐流体培养基在30~35°C培养14天，改良马丁培养基在23~28°C培养14天。培养期间应逐日检查是否有菌生长，并填写无菌检查记录。如供试品管出现浑浊或沉淀，经培养后不能从外观判断时，可取该培养液接种在另一支相同新鲜培养基中，细菌培养2天，真菌培养3天，观察接种的同种新鲜培养基是否再出现浑浊；或取培养液涂片，染色，镜检，判断是否有菌。
[0048](10)结果判断:阳性对照管应生长良好，阴性对照管不得有菌生长。否则，试验无效。
[0049]若供试品管均澄清，或虽显浑浊但经确证无菌生长，判供试品符合规定；若供试品管中任何显浑浊并确证有菌生长，判供试品不符合规定，除非能充分证明实验结果无效，即生长的微生物非供试品所含。当符合下列至少一个条件时，方可判试验结果无效:
①无菌检查试验所用设备及环境的微生物监控结果不符合无菌检查要求；
②回顾无菌试验过程，发现有可能引起微生物污染的因素；
②供试品管中生长的微生物经鉴定后，确证是因无菌试验中所使用的物品和(或)无菌操作技术不当引起的。试验若经确认无效，应重试。重试时，重新取同量供试品，依法检查，若无菌生长，判供试品符合规定；若有菌生长，判供试品不符合规定。
【权利要求】
1.一种培养人羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于:它包括如下步骤: (1)取新鲜采集的人羊膜，清洗，放入羊膜保护液中2-8°C保存备用，所述的羊膜保护液是在AIM-V培养基中加入青霉素钠和硫酸链霉素得到的，其中青霉素钠和硫酸链霉素在羊膜保护液中的终浓度分别为100-200 U/mL和100-200 U /mL ； (2)取浸泡在羊膜保护液中不超过48小时的人羊膜，清洗，再依次置临用新配的青霉素钠和硫酸链霉素含量分别为2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化钠溶液和每毫升含30-50 U两性霉素B的甲硝唑注射液中进行浸洗，最后再清洗后置于一次性无菌培养皿中进行备用； (3)将无菌清洗过的人羊膜剪碎，加入AIM-V培养基，置分离管中用全自动组织分离器进行分离，得羊膜组织匀浆； (4)将全自动组织分离器处理好的羊膜组织匀浆进行离心，弃上清，收集下层，置于培养瓶中，然后向其中加入无血清培养基，置于36-38°C、饱和湿度、体积分数为5%的CO2孵育箱中培养，至观察到瓶壁上形成多个大小不一、细胞数量密集的细胞岛时，则获得人羊膜间充质干细胞原代细胞混合液，然后经离心，即可获得人羊膜间充质干细胞原代细胞，再经传代培养至细胞融合度达80-90%即得。
2.根据权利要求1所述的培养人羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于:所述步骤(1)中的羊膜保护液是将注射用青霉素钠和注射用硫酸链霉素预先溶解后再加入到AIM-V培养基(治疗级)中得到的；所述步骤(2)中青霉素钠和硫酸链霉素含量分别为2500-3500U /mL和3500-4500 U /mL的氯化钠溶液是将注射用青霉素钠和注射用硫酸链霉素按一定量加入0.9%氯化钠注射液中混合得到的；所述每毫升含30-50 U两性霉素B的甲硝唑注射液的配制是将注射用两性霉素B先`用0.9%氯化钠注射液溶解后，再和一定量的甲硝唑注射液混合得到的；所述人羊膜在青霉素钠和硫酸链霉素含量分别为2500-3500 U /mL和3500-4500 U /mL的氯化钠溶液和每毫升含30-50 U两性霉素B的甲硝唑注射液中的浸洗时间均为8-12min。
3.根据权利要求1所述的培养人羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于:所述步骤(1)和步骤(2)中的清洗均为0.9%氯化钠注射液清洗。
4.根据权利要求1所述的培养人羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于:所述的步骤(4)为培养5-6天后，取出未贴壁的上层置另一新培养瓶中，向原培养瓶和新培养瓶中均加入无血清培养基继续培养，并每隔3-4天换液一次，待培养10-15天后即可获得人羊膜间充质干细胞原代细胞； 然后将原培养瓶和新培养瓶中的培养基完全移出，往原培养瓶和新培养瓶中加入质量百分数为0.25%的重组动物胰蛋白酶的磷酸盐缓冲液浸没贴壁细胞，放入36~38°C培养箱保温消化7-9分钟，当观察到贴壁细胞圆缩，且已经脱离瓶底后，加入消化液同等体积的无血清培养基终止消化，然后转移至离心管中，离心弃上清，吹匀沉淀在离心管底部的细胞，再根据4000-6000个细胞/cm2接种到培养瓶中，并向培养瓶中补充无血清培养基，置36~38°C、饱和湿度，体积分数为5%的CO2孵育箱中培养，每3-4天全量换液一次，至贴壁细胞彼此融合，且融合度达80-90%，即得人羊膜间充质干细胞，在有需要时，可重复上述操作进行多代细胞培养扩增。
5.根据权利要求1所述的培养人羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于:所述T25培养瓶可放置不超过5g的人羊膜经全自动组织分离器处理、离心后的下层组织进行培养；所述T75培养瓶可放置10-15 g的人羊膜经全自动组织分离器处理、离心后的下层组织进行培养；所述T175培养瓶可放置30-35 g的人羊膜经全自动组织分离器处理、离心后的下层组织进行培养；所述T25培养瓶中需要的无血清培养基的体积为6-8mL ;所述T75培养瓶中需要的无血清培养基的体积为20-25mL ;所述T175培养瓶中需要的无血清培养基的体积为30_35mL。
【文档编号】C12N5/0775GK103555663SQ201310579708
【公开日】2014年2月5日 申请日期:2013年11月19日 优先权日:2013年11月19日
【发明者】操春红, 蔡鹏 , 余顺, 吴珍兰 申请人:武汉道培胎盘干细胞生物技术有限公司