一种高产丁醇的基因工程菌株及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种高产丁醇的基因工程菌株，它是在拜氏梭菌中插入失活编码NADH-辅酶Q氧化还原酶关键亚基的基因Cbei_4110，从而得到基因Cbei_4110失活的重组菌株。本发明还公开了上述基因工程菌株的构建方法和应用。本发明的基因工程菌株，以葡萄糖为碳源时，在2L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了12.7g/L和9.9g/L，分别比出发菌提高了17.5%和25.3%，丁醇比高达78%，糖转化率高达0.42，利用本发明方法构建的重组菌株，能提高丁醇产量和糖转化效率，降低生产成本。
【专利说明】—种高产丁醇的基因工程菌株及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种高产丁醇的基因工程菌株及其应用，属于基因工程和发酵工程【技术领域】。
【背景技术】
[0002]丁醇已广泛应用于化工、塑料、油漆等工业领域。丁醇具有能量密度大、可直接用于内燃机、运输方便等优点；作为新型的可再生生物能源，丁醇有着广阔的发展前景。随着化石能源日近枯竭，生物法制备丁醇受到越来越多的关注。生物法制备丁醇一般是利用产丁醇梭菌(丙酮丁醇梭菌、拜氏梭菌等)在严格厌氧条件下进行的，其主要产物是丁醇、丙酮和乙醇，简称ABE发酵。传统的ABE发酵包括产酸期和产溶剂期，丁醇、丙酮和乙醇的比例约为6:3:1。在产酸期，细胞通过乙酸和丁酸的偶联会通过一系列的质子传递体，将两个还原H形成一个H2释放出菌体。在产溶剂期，产生的乙酸和丁酸在此阶段被转变为溶剂(丙酮、丁醇和乙醇)，释放大量CO2和少量H2 ;导致底物的转化利用率仅在35%左右。因此，提高底物转化率和丁醇比例是生物丁醇研究的热点之一。
[0003]中国专利ZL95111733.5报道，上海植物生理研究所通过化学诱变的方法得到一株高产丁醇的菌株C.acetobutylicum EA2018，最终发酵产溶剂比为B:A:E=7:2:1，得率在0.35-0.38之间。美国专利US2005/0089979A1报道了利用gas-stripping和连续发酵耦合来生产丙酮丁醇，在IL发酵罐中，以葡萄糖为底物，丁醇比停留在60-70%之间；Mutschlechner 等利用拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii) NRRL B592,通过两阶段调控的方法连续发酵产溶剂，在稳定期丁醇比例的平均值为61%，溶剂产率平均值为0.25。
[0004]NADH-辅酶Q氧化还原酶是拜氏梭菌专属的一种位于细胞膜上的质子传递体，作用是以辅酶Q作为质子受体，脱下NADH上一个H，氢气的溢出是菌体维持其内部氧化还原电势稳定的一种方式，然而这种方式造成了还原力的极大浪费，是ABE发酵得率不高的原因之一。可见，利用二型内含子技术阻`断位于细胞膜上的还原氢的传递，降低H2的溢出，提高还原力的利用效率，进而提高丁醇产量，是提高ABE发酵经济性的手段之一。
【发明内容】
[0005]本发明所要解决的技术问题是提供一种高产丁醇的基因工程菌株。
[0006]本发明还要解决的技术问题是提供上述基因工程菌株的构建方法。
[0007]本发明最后要解决的技术问题是提供上述基因工程菌株的应用。
[0008]为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下:
[0009]一种高产丁醇的基因工程菌，它是在拜氏梭菌中插入失活编码NADH-辅酶Q氧化还原酶关键亚基的基因Cbei_4110从而得到重组菌株。
[0010]本发明通过在菌种中失活NADH-辅酶Q氧化还原酶关键亚基的基因Cbei_4110，以提高丁醇产量。所述菌株可以是所有能够发酵产丁醇的拜氏梭菌，例如拜氏梭菌野生菌，或者经过诱变和基因工程改造后能出产生丁醇的拜氏梭菌，例如拜氏梭菌(Clostridiumbei jerinckii) IB4 等。
[0011]其中，所述的拜氏梭菌优选为拜氏梭菌(Clostridium bei jerinckii) NCIMB8052。
[0012]其中，所述的基因Cbei_4110，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
[0013]上述高产丁醇的基因工程菌的构建方法，它包括如下步骤:
[0014](I)构建Cbei_4110基因的插入失活载体pWJ-392;
[0015](2)将步骤⑴得到的载体pWJ-392转化入拜氏梭菌中，获得Cbei_4110基因插入
失活的重组菌株。
[0016]具体可通过如下方法构建基因工程菌:在线设计内含子序列并基因合成，构建Cbei_4110基因缺失载体，并将构建好的重组载体转化拜氏梭菌，筛选出阳性重组菌。将含有重组载体的菌株划线挑选，菌落PCR筛出内含子插入的重组菌株，再将内含子插入的重组菌株在含有和不含有红霉素抗性平板上复筛，获得载体丢失、且Cbei_4110基因插入失活的目标重组菌株。
[0017]步骤⑴中，以含有二型内含子的大肠杆菌-拜氏梭菌穿梭载体pWJ为出发载体，构建Cbei_4110基因的插入失活载体pWJ-392。
[0018]步骤(2)中，将载体pWJ-392引入拜氏梭菌中，实现Cbei_4110基因的插入失活，采用电转化法。
[0019]上述高产丁醇的基因工程菌株在发酵制备丁醇中的应用。
[0020]有益效果:本发明 是借助含有二型内含子的大肠杆菌-拜氏梭菌穿梭载体pWJ，实现拜氏梭菌中编码NADH-辅酶Q氧化还原酶关键亚基的Cbei_4110基因的插入失活，构建得到Cbei_4110基因失活的重组菌株。本发明的基因工程菌株，以葡萄糖为碳源时，在2L发酵罐中总溶剂产量和丁醇产量分别达到了 12.7g/L和9.9g/L，分别比出发菌提高了 17.5%和25.3%，丁醇比高达78%，糖转化率高达0.42，利用本发明方法构建的重组菌株，能提高丁醇产量和糖转化效率，降低生产成本。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为本发明Cbei_4110基因插入失活载体pWJ-392的质粒图谱。
[0022]图2为本发明使用二型内含子插入失活的机理图。
[0023]图3为挑取转化子菌落PCR电泳图。
【具体实施方式】
[0024]根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
[0025]实施例1:
[0026]本实例说明拜氏梭菌Cbei_4110基因插入失活重组菌株的构建方法。
[0027]1.设计内含子序列
[0028]根据NCBI数据库收录的拜氏梭菌的Cbei_4110基因序列，借助软件设计合适的插入基因位点(http://www.clostron.com),选择插入在392和393之间，并生成内含子序列，合成内含子序列S-392，其序列如SEQ ID NO:2所示，并设计引物:[0029]
【权利要求】
1.一种高产丁醇的基因工程菌株，其特征在于，它是在拜氏梭菌中插入失活编码NADH-辅酶Q氧化还原酶关键亚基的基因Cbei_4110，从而得到重组菌株。
2.根据权利要求1所述的高产丁醇的基因工程菌株，其特征在于，所述的拜氏梭菌为拜氏梭菌(Clostridium beijerinckii)NCIMB8052。
3.根据权利要求1所述的高产丁醇的基因工程菌株，其特征在于，所述的基因Cbei_4110，其核苷酸序列如SEQ ID No:1所示。
4.权利要求1所述的高产丁醇的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，它包括如下步骤: (1)构建Cbei_4110基因的插入失活重组载体； (2)将步骤(1)得到的重组载体转化入拜氏梭菌中，获得Cbei_4110基因插入失活的重组菌株。
5.根据权利要求4所述的高产丁醇的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤(1)中，以含有二型内含子的大肠杆菌-拜氏梭菌穿梭载体PWJ为出发载体，构建Cbei_4110基因的插入失活载体pWJ-392。
6.根据权利要求4所述的高产丁醇的基因工程菌株的构建方法，其特征在于，步骤(2)中，将PWJ-392引入拜氏梭菌中，实现Cbei_4110基因的插入失活，采用电转化法。
7.权利要求1所述 的高产丁醇的基因工程菌株在发酵制备丁醇中的应用。
【文档编号】C12P7/16GK103820367SQ201410069441
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年2月27日 优先权日:2014年2月27日
【发明者】应汉杰, 王冬, 郭亭, 刘俊, 华莹, 谢婧婧, 陈勇 申请人:南京工业大学