小儿脑性瘫痪基因变异检测用引物及其检测试剂盒、检测方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及生物检测【技术领域】，具体涉及小儿脑性瘫痪基因变异检测用引物及其检测试剂盒、检测方法和应用，该引物包括分别对应4个待检变异位点的4对共8条引物，4个待检变异位点分别为基因片段rs7095891、rs16476、rs1801133和rs1042714，8条引物分别简写为：G1F、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F和G4R；引物G1F和G1R扩增位点为rs7095891，G2F和G2R扩增位点为rs16476，G3F和G3R扩增位点为rs1801133，G4F和G4R扩增位点为rs1042714。本发明的引物能满足4个待检变异位点在同一个反应体系和反应条件下扩增，引物特异性好。
【专利说明】小儿脑性瘫痪基因变异检测用引物及其检测试剂盒、检测方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物检测【技术领域】，具体涉及小儿脑性瘫痪基因变异检测用引物及其检测试剂盒、检测方法和应用。
【背景技术】
[0002]小儿脑性瘫痪(cerebral palsy，CP，简称脑瘫)是指出生前至出生后I个月各种原因所引起的非进行性脑损伤或发育缺陷所致的运动障碍及姿势异常，症状在婴儿期出现，有时合并智力障碍、癫痫、感知觉障碍及其他异常。脑瘫是引起儿童残疾最常见的疾病，发病率为1.0-2.5/1000个活产儿或儿童。在我国，脑瘫患儿的发病率为1.5%。飞％。，其中男性发病率高于女性，农村发病率高于城市。我国现有31万学龄前脑瘫患儿，有200万以上脑瘫患儿需要康复治疗，且每年以4.6万人左右的速度增长，给个人、家庭和社会带来了巨大的心理和经济负担，同时也严重影响我国人口素质的提高和计划生育这一基本国策的贯彻实施。
[0003]遗传因素被证实是影响小儿脑瘫的重要因素，但目前临床上还没有试剂盒检测脑瘫的相关基因应用。
【发明内容】
[0004]为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种小儿脑性瘫痪基因变异检测用引物，该引物能满足4个待检变异位点在同一个反应体系和反应条件下扩增，引物特异性好。
[0005]本发明的另一目的在于提供一种小儿脑性瘫痪基因变异检测试剂盒，该检测试剂盒针对中国人群小儿脑瘫相关基因4个变异位点而开发，对4个风险变异位点(rs7095891、rsl6476、rsl801133、rsl042714)进行检测分析，以达到从分子水平上对脑瘫的发生进行预报、预警，降低脑瘫发病率、提高出生缺陷救治水平。
[0006]本发明的另一目的在于提供一种小儿脑性瘫痪基因变异检测试剂盒的检测方法，该检测方法快速、准确性高、特异性强，可以对脑瘫患儿早发现、早预防、早治疗，以减少脑瘫儿的发病率、改善脑瘫患儿预后。
[0007]本发明的另一目的在于提供一种小儿脑性瘫痪基因变异检测试剂盒在检测小儿脑性瘫痪基因变异的应用，可以对脑瘫患儿早发现、早预防、早治疗，以减少脑瘫儿的发病率、改善脑瘫患儿预后。
[0008]本发明的目的通过下述技术方案实现:小儿脑性瘫痪基因变异检测用引物，包括分别对应4个待检变异位点的4对共8条引物，4个待检变异位点分别为基因片段rs709589U rsl6476、rsl801133 和 rsl042714，8 条引物分别简写为:G1F、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F和G4R ;其中，引物GlF和GlR扩增位点为rs7095891, G2F和G2R扩增位点为rsl6476，G3F和G3R扩增位点为rsl801133，G4F和G4R扩增位点为rsl042714。4个待检变异位点分别位于基因 MBL+4 (rs7095891)、MTHFR 677 (rsl801133)、NPY A6411C (rsl6476)和 ADRB2 Q27E (rsl042714)。
[0009]优选的，所述8条引物的序列分别为:
GlF:5，- GCTCTGAAGAACAAATGAAAGG -3，
GlR:5’ - AAATAGGACATCAGTCTCCTCA -3’
G2F:5’ - ATCTTCATAACCTCCTGACTCTT -3’
G2R:5’ - TGTTTCCCTTGCATTTGCTATT -3’
G3F:5’ - GCTCAAGGCAGGACAGTGT -3’
G3R:5， - GGAAGAACTCAGCGAACTCAG -3，
G4F:5’ - CCGCTGAATGAGGCTTCCA -3’
G4R:5’ - AGCAGGCTCTGGTACTTGAA -3’。
[0010]本发明的另一目的通过下述技术方案实现:一种用于检测小儿脑性瘫痪基因变异的试剂盒，该试剂盒包括权利要求广2任一项所述的引物。
[0011]本发明的另一目的通过下述技术方案实现:一种使用上述的试剂盒检测小儿脑性瘫痪基因变异的检测方法，依次包括如下步骤:
A、提取模板DNA:从待检者的血液中提取基因组DNA，作为PCR扩增的模板DNA ；
B、PCR扩增:以上述提取的基因组DNA为模板，采用所述引物进行PCR扩增，得到DNA扩增产物；
C、PCR产物纯化:采用纯化板对上述DNA扩增产物进行纯化，得到纯化DNA；
D、测序反应:采用Sanger方法对纯化DNA进行测序；
E、结果分析:采用测序峰图分析软件对测序结果进行分析。
[0012]优选的，所述步骤B中，PCR扩增的反应体系以30.Ομ?计为:
2Χ GC buffer I12.5μ?
2.5 mM dNTP4.Ομ?
1mM 引物 F1.Ομ?
1mM 引物 R1.Ομ?
10?30ng/^L 模板 DNA3.Ομ?
LA Taq 聚合酶0.3μ?
ddH203.2μ?。
[0013]优选的，所述步骤B中，PCR扩增的反应条件为:1) 95°C预变性2min ；2) 95°C变性30s，60。。退火 30s、72°C延伸 lmin，共 35 个循环；3) 72°C后延伸 5min ；4) 12°C保藏；
另一优选的，PCR扩增的反应条件为:1) 95°C预变性2min ；2) 95°C变性30s，57°C退火30s、72°C延伸 lmin，共 35 个循环；3) 72°C后延伸 5min ；4) 12°C保藏；
另一优选的，PCR扩增的反应条件为:1) 95°C预变性2min ；2) 95°C变性30s，53°C退火30s、72°C延伸 lmin，共 35 个循环；3) 72°C后延伸 5min ；4) 12°C保藏。
[0014]优选的，所述步骤C中，PCR产物纯化的步骤具体为:向96孔纯化板孔中加入100μ? ddH20,将上述DNA扩增产物加入96孔纯化板中室温静置lOmin，真空抽滤1min至抽干；向96孔纯化板中加入40μ? ddH20，室温溶解lOmin，取出对应的孔中的纯化产物至另一个96孔PCR板中，回收纯化产物，得到纯化DNA。
[0015]优选的，所述步骤D中，测序的反应体系以6.0μ?计为:
30?50ng /μ? 纯化 DNA2.Ομ?
3ρΜ测序引物Ι.Ομ?
Bigdye2.0M-L
DMSO1.Ομ?。
[0016]Bigdye包含Taq聚合酶以及标记了大荧光染料的ddNTP等，在DNA聚合酶催化的测序反应中需要测序引物，不论是单链DNA模板，还是双链DNA模板，都可通过使用克隆位点两侧的载体序列互补的通用引物，本发明的测序引物采用Bigdye的通用引物。
[0017]优选的，所述步骤D中，测序的反应条件为:1)95°C预变性2min ;2)95°C变性30s，55°C退火30s、60°C延伸90s，共30个循环；3) 12°C保藏。
[0018]所述步骤E中，结果分析的步骤具体为:使用测序峰图分析软件，对测序结果进行分析，得到每个测试样本相应位点的碱基信息，从而分析待检者生育小儿脑性瘫痪的风险性以及预测小儿脑性瘫痪后期引发的相关疾病的风险性。
[0019]本发明的另一目的通过下述技术方案实现:一种上述的试剂盒在检测小儿脑性瘫痪基因变异的应用。
[0020]本发明的有益效果在于:本发明首次根据4个待检变异位点设计了 8条引物，引物能满足4个待检变异位点在同一个反应体系和反应条件下扩增，引物特异性好。
[0021]本发明的检测试剂盒针对中国人群小儿脑瘫相关基因4个变异位点而开发，对4个风险变异位点(rs7095891、rsl6476、rsl801133、rsl042714)进行检测分析，以达到从分子水平上对脑瘫的发生进行预报、预警，降低脑瘫发病率、提高出生缺陷救治水平。
[0022]本发明的检测方法快速、准确性高、特异性强，可以对脑瘫患儿早发现、早预防、早治疗，以减少脑瘫儿的发病率、改善脑瘫患儿预后。
[0023]本发明的小儿脑性瘫痪基因变异检测试剂盒在检测小儿脑性瘫痪基因变异的应用，可以对脑瘫患儿早发现、早预防、早治疗，以减少脑瘫儿的发病率、改善脑瘫患儿预后。
[0024]【专利附图】
【附图说明】:
图1是本发明实施例的测试样本与对照样本在rs7095891变异位点的测序比对图。
[0025]图2是本发明实施例的测试样本与对照样本在rsl6476变异位点的测序比对图。
[0026]图3是本发明实施例的测试样本与对照样本在rsl801133变异位点的测序比对图。
[0027]图4是本发明实施例的测试样本与对照样本在rsl042714变异位点的测序比对图。
[0028]【具体实施方式】:
为了便于本领域技术人员的理解，下面结合实施例及附图Γ4对本发明作进一步的说明，实施方式提及的内容并非对本发明的限定。
[0029]小儿脑性瘫痪基因变异检测用引物，包括分别对应4个待检变异位点的4对共8条引物，4个待检变异位点分别为基因片段rs7095891、rsl6476、rsl801133和rsl042714，8条引物分别简写为:G1F、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F和G4R ;其中，引物GlF和GlR扩增位点为rs7095891，G2F和G2R扩增位点为rs 16476，G3F和G3R扩增位点为rsl801133，G4F和G4R扩增位点为rsl042714。4个待检变异位点分别位于基因MBL+4(rs7095891 )、MTHFR677 (rsl801133)、NPY A6411C (rsl6476)和 ADRB2 Q27E (rsl042714)。
[0030]其中，所述8条引物的序列分别为:
GlF:5，- GCTCTGAAGAACAAATGAAAGG -3，
GlR:5’ - AAATAGGACATCAGTCTCCTCA -3’
G2F:5’ - ATCTTCATAACCTCCTGACTCTT -3’
G2R:5’ - TGTTTCCCTTGCATTTGCTATT -3’
G3F:5’ - GCTCAAGGCAGGACAGTGT -3’
G3R:5， - GGAAGAACTCAGCGAACTCAG -3，
G4F:5’ - CCGCTGAATGAGGCTTCCA -3’
G4R:5’ - AGCAGGCTCTGGTACTTGAA -3’。
[0031]本发明首次根据4个待检变异位点设计了 8条引物，引物能满足4个待检变异位点在同一个反应体系和反应条件下扩增，引物特异性好。
[0032]一种用于检测小儿脑性瘫痪基因变异的试剂盒，该试剂盒包括权利要求f 2任一项所述的引物。
[0033]本发明的检测试剂盒针对中国人群小儿脑瘫相关基因4个变异位点而开发，对4个风险变异位点(rs7095891、rsl6476、rsl801133、rsl042714)进行检测分析，以达到从分子水平上对脑瘫的发生进行预报、预警，降低脑瘫发病率、提高出生缺陷救治水平。
[0034]一种使用上述的试剂盒检测小儿脑性瘫痪基因变异的检测方法，依次包括如下步骤:
A、提取模板DNA:从待检者的血液中提取基因组DNA，作为PCR扩增的模板DNA ；
B、PCR扩增:以上述提取的基因组DNA为模板，采用所述引物进行PCR扩增，得到DNA扩增产物；
C、PCR产物纯化:采用纯化板对上述DNA扩增产物进行纯化，得到纯化DNA；
D、测序反应:采用Sanger方法对纯化DNA进行测序；
E、结果分析:采用测序峰图分析软件对测序结果进行分析。
[0035]其中，所述步骤B中，PCR扩增的反应体系以30.Ομ?计为:
2Χ GC buffer I12.5μ?
2.5 mM dNTP4.Ομ?
1mM 引物 F1.Ομ?
1mM 引物 R1.Ομ?
10?30ng/^L 模板 DNA3.Ομ?
LA Taq 聚合酶0.3μ?
ddH203.2μ?。
[0036]其中，所述步骤B中，PCR扩增的反应条件为:1)95°C预变性2min;2)95°C变性30s，60。。退火 30s、72°C延伸 lmin，共 35 个循环；3) 72°C后延伸 5min ；4) 12°C保藏；
本发明的另一种较佳的实施方式为=PCR扩增的反应条件为:1) 95°C预变性2min ；2)95°C变性 30s，57。。退火 30s、72°C延伸 lmin，共 35 个循环；3) 72°C后延伸 5min ；4) 12。。保藏；
本发明的另一种较佳的实施方式为=PCR扩增的反应条件为:1) 95°C预变性2min ；2)95°C变性 30s，53。。退火 30s、72°C延伸 lmin，共 35 个循环；3) 72°C后延伸 5min ；4) 12。。保藏。
[0037]其中，所述步骤C中，PCR产物纯化的步骤具体为:向96孔纯化板孔中加入ΙΟΟμ?ddH20,将上述DNA扩增产物加入96孔纯化板中室温静置lOmin，真空抽滤1min至抽干；向96孔纯化板中加入40μ? ddH20,室温溶解lOmin，取出对应的孔中的纯化产物至另一个96孔PCR板中，回收纯化产物，得到纯化DNA。
[0038]其中，所述步骤D中，测序的反应体系以6.Ομ?计为:
30?50ng /μ? 纯化 DNA2.Ομ?
3ρΜ测序引物Ι.Ομ?
Bigdye2.0M-L
DMSO1.Ομ?。
[0039]Bigdye包含Taq聚合酶以及标记了大荧光染料的ddNTP等，在DNA聚合酶催化的测序反应中需要测序引物，不论是单链DNA模板，还是双链DNA模板，都可通过使用克隆位点两侧的载体序列互补的通用引物，本发明的测序引物采用Bigdye的通用引物。
[0040]其中，所述步骤D中，测序的反应条件为:I) 95 °C预变性2min ;2 ) 95 °C变性30s，55°C退火30s、60°C延伸90s，共30个循环；3) 12°C保藏。
[0041]所述步骤E中，结果分析的步骤具体为:使用测序峰图分析软件，对测序结果进行分析，得到每个测试样本相应位点的碱基信息，从而分析待检者生育小儿脑性瘫痪的风险性以及预测小儿脑性瘫痪后期引发的相关疾病的风险性。
[0042]如图1?4所示，如果测试样本的基因在4个风险变异位点(rs7095891、rsl6476、rsl801133、rsl042714)中的任意一个变异位点的碱基发生突变，即可判断待检者为生育小儿脑性瘫痪的高危人群。
[0043]本发明的检测方法快速、准确性高、特异性强，可以对脑瘫患儿早发现、早预防、早治疗，以减少脑瘫儿的发病率、改善脑瘫患儿预后。
[0044]—种上述的试剂盒在检测小儿脑性瘫痪基因变异的应用。本发明的小儿脑性瘫痪基因变异检测试剂盒在检测小儿脑性瘫痪基因变异的应用，可以对脑瘫患儿早发现、早预防、早治疗，以减少脑瘫儿的发病率、改善脑瘫患儿预后。
[0045]上述实施例为本发明较佳的实现方案，除此之外，本发明还可以其它方式实现，在不脱离本发明构思的前提下任何显而易见的替换均在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.小儿脑性瘫痪基因变异检测用引物，其特征在于:包括分别对应4个待检变异位点的4对共8条引物，4个待检变异位点分别为基因片段rs7095891、rsl6476、rsl801133和rsl042714，8 条引物分别简写为:G1F、G1R、G2F、G2R、G3F、G3R、G4F 和 G4R ;其中，引物 GlF和GlR扩增位点为rs7095891, G2F和G2R扩增位点为rs 16476，G3F和G3R扩增位点为rsl801133, G4F 和 G4R 扩增位点为 rsl042714。
2.根据权利要求1所述的小儿脑性瘫痪基因变异检测用引物，其特征在于:所述8条引物的序列分别为:
GlF:5，- GCTCTGAAGAACAAATGAAAGG -3，
GlR:5’ - AAATAGGACATCAGTCTCCTCA -3’
G2F:5’ - ATCTTCATAACCTCCTGACTCTT -3’
G2R:5’ - TGTTTCCCTTGCATTTGCTATT -3’
G3F:5’ - GCTCAAGGCAGGACAGTGT -3’
G3R:5， - GGAAGAACTCAGCGAACTCAG -3，
G4F:5’ - CCGCTGAATGAGGCTTCCA -3’
G4R:5’ - AGCAGGCTCTGGTACTTGAA -3’。
3.一种用于检测小儿脑性瘫痪基因变异的试剂盒，其特征在于:该试剂盒包括权利要求广2任一项所述的引物。
4.一种使用权利要求3所述的试剂盒检测小儿脑性瘫痪基因变异的检测方法，其特征在于:依次包括如下步骤: A、提取模板DNA:从待检者的血液中提取基因组DNA，作为PCR扩增的模板DNA ； B、PCR扩增:以上述提取的基因组DNA为模板，采用所述引物进行PCR扩增，得到DNA扩增产物； C、PCR产物纯化:采用纯化板对上述DNA扩增产物进行纯化，得到纯化DNA； D、测序反应:采用Sanger方法对纯化DNA进行测序； E、结果分析:采用测序峰图分析软件对测序结果进行分析。
5.根据权利要求4所述的一种检测小儿脑性瘫痪基因变异的检测方法，其特征在于:所述步骤B中，PCR扩增的反应体系以30.Ομ?计为: 2Χ GC buffer I12.5μ? 2.5 mM dNTP4.Ομ? 1mM 引物 F1.Ομ? 1mM 引物 R1.Ομ? 10?30ng/^L 模板 DNA3.Ομ? LA Taq 聚合酶0.3μ? ddH203.2μ?。
6.根据权利要求4所述的一种检测小儿脑性瘫痪基因变异的检测方法，其特征在于:所述步骤B中，PCR扩增的反应条件为:1)95°C预变性2min ;2)95°C变性30s，60°C退火30s、72°C延伸lmin，共35个循环；3) 72°C后延伸5min ；4) 12°C保藏； 或者，PCR扩增的反应条件为:1)95°C预变性2min ;2)95°C变性30s，57°C退火30s、72°C延伸lmin，共35个循环；3) 72°C后延伸5min ；4) 12°C保藏； 或者，PCR扩增的反应条件为:1)95°C预变性2min ;2)95°C变性30s，53°C退火30s、72°C延伸lmin，共35个循环；3) 72°C后延伸5min ；4) 12°C保藏。
7.根据权利要求4所述的一种检测小儿脑性瘫痪基因变异的检测方法，其特征在于:所述步骤C中，PCR产物纯化的步骤具体为:向96孔纯化板孔中加入10PL ddH20，将上述DNA扩增产物加入96孔纯化板中室温静置lOmin，真空抽滤1min至抽干；向96孔纯化板中加入40μ? ddH20，室温溶解lOmin，取出对应的孔中的纯化产物至另一个96孔PCR板中，回收纯化产物，得到纯化DNA。
8.根据权利要求4所述的一种检测小儿脑性瘫痪基因变异的检测方法，其特征在于:所述步骤D中，测序的反应体系以6.Ομ?计为: 30?50ng /μ? 纯化 DNA2.Ομ? 3ρΜ测序引物Ι.Ομ? Bigdye2.0M-L DMSO1.Ομ?。
9.根据权利要求4所述的一种检测小儿脑性瘫痪基因变异的检测方法，其特征在于:所述步骤D中，测序的反应条件为:1)95°C预变性2min ;2) 95°C变性30s，55°C退火30s、60°C延伸90s，共30个循环；3) 12°C保藏。
10.一种权利要求3所述的试剂盒在检测小儿脑性瘫痪基因变异的应用。
【文档编号】C12N15/11GK104278104SQ201410592802
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2014年10月29日 优先权日:2014年10月29日
【发明者】何晓光, 马可泽, 陆小梅, 彭琪, 何婷, 黎四平, 李文瑞 申请人:东莞市石龙博爱医院