稳定化的药物肽组合物的制作方法

专利名称：稳定化的药物肽组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及药物组合物领域。更具体而言，本发明涉及稳定的药物组合物的制备方法，该组合物由在高于中性pH的pH下处理的大量肽产物制备。
背景技术：
治疗肽广泛应用于医学实践。要求这种治疗肽的药物组合物的保存期为数年，以适于常规应用。但是，肽组合物天生是不稳定的，因为它们对化学和物理降解敏感。化学降解涉及共价键的变化，例如氧化、水解、外消旋化或交联。物理降解包括相对于肽的天然结构，即二级和三级结构的构象变化，例如聚集、沉淀或吸附至表面。
胰高血糖素已在医学实践中应用于糖尿病数十年，且许多胰高血糖素样肽正被研制用于多种治疗适应症。前高血糖素原基因编码胰高血糖素以及胰高血糖素样肽1(GLP-1)和胰高血糖素样肽2(GLP-2)。GLP-1类似物和衍生物以及同源性晰蜴肽(lizardpeptide)、exendin-4正被研制用于治疗II型糖尿病的高血糖症。GLP-2潜在地可用于治疗胃肠疾病。但是，所有这些包含29-39个氨基酸的肽具有高度同源性，且它们共同具有许多特性，特别是它们聚集和形成不溶性原纤维的倾向。这种性质似乎包括从主要的α-螺旋构象向β-折叠的转变(Blundell T.L.(1983)。胰高血糖素的构象。在Lef ébvre P.J.(Ed)Glucagon I.Springer Verlag，pp 37-55，Senderoff R.I.等人，J.Pharm.Sci.87(1998)183-189，WO01/55213)。胰高血糖素样肽的聚集主要在搅拌或振荡肽溶液时、在溶液和气相(空气)之间的界面以及在与疏水表面如Teflon接触时看到。
因此，经常必须将多种赋形剂添加到胰高血糖素样肽的药物组合物中，以改善它们的稳定性。这些肽的液体肠胃外制剂的保存期限必须为至少一年，优选更长。可以每天在室温下转运并振荡的产物的使用期间优选应该为数周。因此，需要稳定性得到改善的胰高血糖素样肽的药物组合物。
我们已意外地发现，已在高于8.0的pH下处理的大量肽产物可以增加由这些大量肽产物制备的药物组合物的稳定性。
定义以下是用于说明书的术语的详细定义。
本文所用的术语“有效量”意指与不进行治疗相比足以有效地治疗患者的剂量。
本文关于药物组合物所用的术语“重构的(reconstituted)”意指已通过将水或适宜的水溶液添加到包含活性药物成分的固体材料中而形成的组合物水溶液。在不能生产具有可接受的保存期限的液体组合物时，会使用用于重构的药物组合物。重构的药物组合物的实例是在将水或适宜的水溶液加到冻干的组合物时产生的溶液。该溶液通常用于肠胃外给药，因此可以使用注射用水或任何其它适宜的溶剂以重构该固体材料。
本文所用的术语“治疗疾病”意指控制或护理已患疾病、症状或病症的患者。治疗的目的是抗击疾病、症状或病症。治疗包括施用活性化合物以消除或控制该疾病、症状或病症和缓解与该疾病、症状或病症有关的症状或并发症。
本文所用的术语“胰高血糖素样肽”指由前高血糖素原基因、exendins及其类似物和衍生物衍生的同源肽。由前高血糖素原基因衍生的肽为胰高血糖素、胰高血糖素样肽1(GLP-1)、胰高血糖素样肽2(GLP-2)和oxynthomodulin(OXM)。在Gila畸形中发现的exendins与GLP-1同源，也发挥促胰岛素作用。Exendins的实例为exendin-4和exendin-3。
胰高血糖素样肽具有以下序列1 5 1015202530 35胰高血糖素 HSQGT FTSDY SKYLD SRRAQ DFVQW LMNT-NH2GLP-1 HAEGT FTSDV SSYLE GQAAK EFIAW LVKGR GGLP-2 HADGS FSDEM NTILD NLAAR DFINW LIQTK ITDExendin-4 HGEGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS-NH2Exendin-3 HSDGT FTSDL SKQME EEAVR LFIEW LKNGG PSSGA PPPS-NH2OXMHSQGT FTSDY SKYLD SRRAQ DFVQW LMDTK RNKNN IA本文关于肽所用的术语“类似物”意指被修饰的肽，其中该肽的一个或多个氨基酸残基已被其它氨基酸残基取代，和/或其中该肽上缺失一个或多个氨基酸残基，和/或其中该肽上缺失一个或多个氨基酸残基，和/或其中已将一个或多个氨基酸残基添加到该肽上。这种氨基酸残基的添加或缺失可以在肽的N-末端和/或在肽的C-末端发生。通常用两种不同和简单的系统描述类似物例如Arg34-GLP-1(7-37)或K34R-GLP-1(7-37)指这样的GLP-1类似物，其中1-6位的氨基酸残基缺失，且在34位的天然存在的赖氨酸已被精氨酸取代(根据IUPAC-IUB命名法使用的氨基酸的标准单字母缩写)。
本文关于母体肽所用的术语“衍生物”意指化学修饰的母体蛋白或其类似物(其中在该母体蛋白或其类似物上不存在至少一个取代基)，即已被共价修饰的母体蛋白。典型的修饰是酰胺、糖类、烷基、酰基、酯、聚乙二醇化(pegylation)等。GLP-1(7-37)衍生物的实例为Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)。
本文所用的术语“GLP-1肽”意指GLP-1(7-37)、GLP-1类似物、GLP-1衍生物或GLP-1类似物的衍生物。
本文所用的术语“GLP-2肽”意指GLP-2(1-33)、GLP-2类似物、GLP-2衍生物或GLP-2类似物的衍生物。
本文所用的术语“exendin-4肽”意指exendin-4(1-39)、exendin-4类似物、exendin-4衍生物或exendin-4类似物的衍生物。
本文所用的术语“稳定的exendin-4化合物”意指化学修饰的exendin-4(1-39)，即通过以下方法测定在人身上表现出至少10小时的体内血浆消除半衰期的类似物或衍生物。exendin-4化合物在人体内的血浆消除半衰期的测定方法是将该化合物溶于等渗缓冲液，pH 7.4，PBS或任何其它适宜的缓冲液。外周注射该剂量，优选在腹部或上部大腿进行。以频繁的时间间隔取血样用于测定活性化合物，并持续充足的时间，以覆盖末期消除部分(例如服药前、服药后1、2、3、4、5、6、7、8、10、12、24(第2天)、36(第2天)、48(第3天)、60(第3天)、72(第4天)和84(第4天)小时)。如Wilken等人，Diabetologia 43(51)A143，2000所述测定活性化合物的浓度。使用非隔室方法，利用可商购得到的软件WinNonlin Version 2.1(Pharsight，Cary，NC，uSA)由各个单独的受试者的浓度-时间数据计算导出药代动力学参数。通过对浓度-时间曲线的末期log-线性部分进行log-线性回归分析来估算末期消除速率常数，并用于计算消除半衰期。
本文所用的术语“DPP-IV保护的exendin-4化合物”意指已被化学修饰以使该化合物耐受血浆肽酶-二肽基氨肽酶-4(DPP-IV)的exendin-4化合物。
本文所用的术语“免疫调节的exendin-4化合物”意指作为与exendin-4(1-39)相比在人体内的免疫反应减小的exendin-4(1-39)的类似物或衍生物的exendin-4化合物。评价免疫反应的方法是测定在治疗患者4周后与该exendin-4化合物有反应性的抗体的浓度。
本文所用的术语“大量产物”或“大量肽产物”意指将用于制备药物组合物的纯化肽产物。因此，大量肽一般以来自最后的纯化、干燥或调制步骤的产物形式得到。该大量产物可以是结晶、沉淀、溶液或悬浮液。该大量产物在本技术中还已知为药物。
本文所用的术语“等电点”意指大分子如肽的总净电荷为零时的pH值。在肽中可以存在许多带电的基团，在等电点处，所有这些电荷的总和为零，即负电荷数与正电荷数平衡。在高于等电点的pH下，肽的总净电荷为负电荷，而在低于等电点的pH值下，肽的总净电荷为正电荷。肽的等电点可以通过等电聚焦测定，或者它可以通过本领域中已知的计算算法由肽的序列估计。
发明描述在一方面，本发明涉及一种用于增加包含胰高血糖素样肽、药学上可接受的缓冲剂和药学上可接受的防腐剂的药物组合物的保存期限的方法，其特征在于由已在pH 8.1-9.6范围内处理过的大量肽产物制备该药物组合物。
在另一方面，本发明涉及一种增加包含胰高血糖素样肽和药学上可接受的防腐剂的药物组合物的保存期限的方法，其特征在于由已在pH8.1-9.6范围内处理过的大量肽制备该药物组合物。
在另一方面，本发明涉及一种增加包含肽、药学上可接受的缓冲剂和药学上可接受的防腐剂的药物组合物的保存期限的方法，其特征在于由已在pH8.1-9.6范围内处理过的大量肽产物制备该药物组合物。
在另一方面，本发明涉及一种增加包含肽和药学上可接受的防腐剂的药物组合物的保存期限的方法，其特征在于由已在pH8.1-9.6范围内处理过的大量肽产物制备该药物组合物。
在另一方面，本发明涉及一种用于增加包含胰高血糖素样肽、药学上可接受的缓冲剂和药学上可接受的防腐剂的药物组合物的保存期限的方法，其特征在于由已在pH8.5-9.6范围内处理过的大量肽产物制备该药物组合物。
在一方面，本发明涉及一种用于增加包含胰高血糖素样肽、药学上可接受的缓冲剂和药学上可接受的防腐剂的药物组合物的保存期限的方法，其特征在于由已在pH9.0-9.6范围内处理过的大量肽产物制备该药物组合物。
在一方面，本发明涉及一种用于增加包含胰高血糖素样肽、药学上可接受的缓冲剂和药学上可接受的防腐剂的药物组合物的保存期限的方法，其特征在于由已在pH8.1-11.5范围内处理过的大量肽产物制备该药物组合物。
在一个实施方案中，该大量肽产物已在pH8.1-10.0范围内处理过。
在另一个实施方案中，该大量肽产物已在pH8.5-11.5范围内处理过。
在另一个实施方案中，该大量肽产物已在pH8.5-10.0范围内处理过。
在本发明的另一个实施方案中，该大量肽产物已在指定的pH范围内和高于该大量肽的成核(作为不均匀或均匀的成核)的温度至大约25℃的温度下处理大约1分钟至大约12小时。
在本发明的另一个实施方案中，该大量肽产物已在指定的pH范围和大约5℃至大约25℃的温度下处理大约1分钟至大约30分钟。
应该理解，本发明可以通过pH值、温度和时间的多种组合实现。这三个变量可以在上述范围内相组合。但是，若一个或二个变量可以适宜地在该范围的高端选择，则剩下的一个或两个变量一般取低值。例如，如果使用高pH值(如pH10)，则优选将它与较低的温度(如大约5-10℃)和/或短时间(如少于大约1分钟至大约6小时)相组合。变量的有用组合为pH 10.0、5℃下大约3小时，pH 10.0、15℃下大约1小时，或者pH 11.0、5℃下大约1小时。
不管是作为单一晶体还是作为多晶体，冰晶的生长是最初的成核过程，在缓慢和快速冷冻时，在低压下冷冻水或水溶液均只产生冰。溶液的成核可以两种方式发生，这取决于溶质的浓度和温度。如果将饱和溶液冷却，则它不仅针对于冰相而言变得过度冷却，还针对于溶质而言变得过饱和。在缺少适宜冷冻核的情况下，该溶液可以是过冷却的。因此，在多数情况下，使在较高pH下处理肽时的温度保持高于肽的成核温度。成核温度对本领域技术人员来说是已知的，且通常可以通过在不同的温度下进行实验来测定相关肽的这一温度。
在一个实施方案中，该药物组合物为溶液。
在另一个实施方案中，该药物组合物为悬浮液。
在另一个实施方案中，该药物组合物为固体，例如冻干制剂，在使用前由医师或患者向其中加入溶剂。用于重构的溶剂可以是注射用水或其它适宜的溶剂。
在另一个实施方案中，该大量肽产物由在该pH下冻干该胰高血糖素样肽的溶液或悬浮液而制备。
在另一个实施方案中，在制备该药物组合物期间，在该pH下处理该大量肽产物。
在另一个实施方案中，在制备过程中，在最终的纯化步骤之后，在该pH下处理该大量肽产物。
在另一个实施方案中，在与该药学上可接受的缓冲液混合前在该pH下处理该大量肽产物。
在另一个实施方案中，该药物组合物的pH低于处理该大量肽的溶液或悬浮液时的pH。
在另一个实施方案中，该药物组合物的pH比处理该大量肽的溶液或悬浮液时的pH低至少0.8pH单位。
在另一个实施方案中，该药物组合物的pH比处理该大量肽的溶液或悬浮液时的pH低至少1.5pH单位。
包含根据本发明的胰高血糖素样肽的药物组合物可以经肠胃外途径施用于需要这种治疗的患者。肠胃外给药可以通过皮下注射、肌内注射或静脉内注射，借助注射器，可选地笔状注射器来完成。可变通地，可以通过输注，例如通过使用输液泵来完成给药。
在一个实施方案中，该药物组合物或该药物组合物的重构溶液的pH为pH 7.0至pH 8.0，优选pH 7.2至pH 7.8。在另一个实施方案中，该药物组合物或该药物组合物的重构溶液的pH为pH 7.2至pH7.6。在另一个实施方案中，该药物组合物或该药物组合物的重构溶液的pH为pH 7.4至pH 7.8。
在另一个实施方案中，该胰高血糖素样肽的等电点为3.0-7.0，优选4.0-6.0。
在一个实施方案中，该胰高血糖素样肽为胰高血糖素、胰高血糖素类似物或其衍生物。
在另一个实施方案中，该胰高血糖素样肽为oxynthomodulin。
在一个实施方案中，该胰高血糖素样肽为GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1衍生物或GLP-1类似物的衍生物。
在另一个实施方案中，该GLP-1类似物选自下述中Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8-GLP-1(7-37)、Val8-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8-GLP-1(7-37)、Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Asp22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Lys22-GLP-1(7-37)、Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Arg22-GLP-1(7-37)、Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8His22-GLP-1(7-37)、Val8Trp19Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37)、Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)及其类似物。
在另-个实施方案中，该GLP-1类似物的衍生物为Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)。
GLP-1、其类似物以及GLP-1衍生物的制备方法可以见于例如WO 99/43706、WO 00/55119、WO 00/34331和WO 03/18516。
在另一个实施方案中，在pH 9.5下处理该大量肽产物的溶液或悬浮液，且该药物组合物的pH为7.4。
在另一个实施方案中，该胰高血糖素样肽为GLP-1肽，而该药物组合物或其重构的组合物中胰高血糖素样肽浓度为0.1mg/mL-50mg/mL、0.1mg/mL-25mg/mL、1mg/mL-25mg/mL、1mg/mL-10mg/mL或3mg/mL-8mg/mL。
在一个实施方案中，该胰高血糖素样肽为GLP-2、GLP-2类似物、GLP-2的衍生物或GLP-2类似物的衍生物。
在另一个实施方案中，该GLP-2的衍生物或GLP-2类似物的衍生物具有赖氨酸残基，例如一个赖氨酸，其中亲脂性取代基连接到该赖氨酸的ε氨基上(可选地经过间隔基)。
GLP-2、其类似物以及以及GLP-2衍生物的制备方法例如可见于WO 99/43361和WO 00/55119。
在另一个实施方案中，该胰高血糖素样肽为a GLP-2肽，而该药物组合物或其重构的组合物中胰高血糖素样肽浓度为0.1mg/mL-100mg/mL、0.1mg/mL-25mg/mL或1mg/mL-25mg/mL。
在一个实施方案中，该胰高血糖素样肽为exendin-4、exendin-4类似物、exendin-4的衍生物或exendin-4类似物的衍生物。
在另一个实施方案中，该胰高血糖素样肽为exendin-4。在另一个实施方案中，该胰高血糖素样肽为稳定的exendin-4。在另一个实施方案中，该胰高血糖素样肽为DPP-IV保护的exendin-4。在另一个实施方案中，该胰高血糖素样肽为免疫调节的exendin-4。在另一个实施方案中，该胰高血糖素样肽为ZP-10([Ser38Lys39]Exendin-4(1-39)LysLysLysLysLys-酰胺)。
exendin-4、其类似物以及exendin-4衍生物的制备方法可以例如见于WO 99/43708、WO 00/41546和WO 00/55119。
在另一个实施方案中，该胰高血糖素样肽为exendin-4肽，而该药物组合物或其重构的组合物中胰高血糖素样肽的浓度为5μg/mL-10mg/mL、5μg/mL-5mg/mL、5μg/mL-5mg/mL、0.1mg/mL-3mg/mL或0.2mg/mL-1mg/mL。
适用于药物组合物的缓冲液对本领域技术人员来说是已知的，它包括但不限于正磷酸盐、TRIS、甘氨酸、N-甘氨酰甘氨酸、乙酸柠檬酸钠(citrate sodium acetate)、碳酸钠、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸钠和柠檬酸钠或其混合物。在一个实施方案中，该药物组合物包含Tris的缓冲液。在另一个实施方案中，该药物组合物包含Bicine的缓冲液。
用于药物组合物的防腐剂对本领域技术人员来说是已知的，包括但不限于苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苄醇、氯丁醇和硫柳汞或它们的混合物。
在一个实施方案中，该药物组合物包含等渗剂。
在另一个实施方案中，该药物组合物包含等渗剂，它是氯化钠、木糖醇、甘露醇、山梨醇、甘油、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸、二甲砜、聚乙二醇、丙二醇或其混合物。
在本发明的另一个实施方案中，该药物组合物还包含稳定剂。
在本发明的另一个实施方案中，该制剂还包含选自高分子量聚合物或低分子量化合物的稳定剂。
在本发明的另一个实施方案中，该稳定剂选自聚乙二醇(例如PEG3350)、聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、不同的盐(例如氯化钠)、L-甘氨酸、L-组氨酸、咪唑、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸及其混合物。这些特定的稳定剂中的每一种均构成本发明的可选择的实施方案。在本发明的优选实施方案中，该稳定剂选自L-组氨酸、咪唑和精氨酸。
在本发明的另一个实施方案中，该稳定剂选自PEG 3350、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧甲基纤维素、氯化钠、L-甘氨酸、L-组氨酸、咪唑、L-精氨酸、L-赖氨酸、L-异亮氨酸、L-天冬氨酸、L-色氨酸、L-苏氨酸及其混合物。
在本发明的另一个实施方案中，该制剂还包含螯合剂。在本发明的另一个实施方案中，该螯合剂选自乙二胺四乙酸(EDTA)、柠檬酸和天冬氨酸的盐，以及它们的混合物。这些特定的螯合剂中的每一种均构成本发明的可替代选择的实施方案。
在本发明的另一个实施方案中，该药物组合物还包含表面活性剂。在本发明的另一个实施方案中，该表面活性剂选自去污剂、乙氧基化蓖麻油、聚二醇化甘油酯、乙酰化甘油一酸酯、脱水山梨醇脂肪酸酯、泊洛沙姆如188和407、聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯、聚氧乙烯衍生物如烷基化和烷氧基化衍生物(tweens、例如Tween-20或Tween-80)、甘油一酸酯或其乙氧基化衍生物、甘油二酸酯或其聚氧乙烯衍生物、甘油、胆酸或其衍生物、卵磷脂、醇和磷脂、甘油磷脂(卵磷脂、脑磷脂、磷脂酰丝氨酸)、甘油糖脂(吡喃半乳糖苷)、鞘磷脂(神经鞘磷脂(sphingomyelin))和鞘糖脂(神经酰胺、神经节苷脂)、DSS(多库酯钠、CAS登记号[577-11-7])、多库酯钙、CAS登记号[128-49-4])、多库酯钾、CAS登记号[7491-09-0])、SDS(十二烷基硫酸钠或月桂基硫酸钠)、二棕榈酰基磷脂酸、辛酸钠、胆酸及其盐和甘氨酸或牛磺酸缀合物、熊去氧胆酸、胆酸钠、去氧胆酸钠、牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠、N-十六烷基-N，N-二甲基-3-胺基-1-丙磺酸酯、阴离子(烷基-芳基-磺酸酯)一价表面活性剂、棕榈酰基溶血磷脂酰基-L-丝氨酸、溶血磷脂(例如乙醇胺、胆碱、丝氨酸或苏氨酸的1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酯)、溶血磷脂酰基和磷脂酰基胆碱的烷基、烷氧基(烷基酯)、烷氧基(烷基醚)-衍生物、例如溶血磷脂酰基胆碱、二棕榈酰基磷脂酰基胆碱的月桂酰基和肉豆蔻酰基衍生物，以及极性头基的修饰，即胆碱、乙醇胺、磷脂酸、丝氨酸、苏氨酸、甘油、肌醇和带正电的DODAC、DOTMA、DCP、BISHOP、溶血磷脂酰基丝氨酸和溶血磷脂酰基苏氨酸，两性离子表面活性剂(例如N-烷基-N，N-二甲基胺基-1-丙磺酸酯、3-胆酰胺基-1-丙基二甲基胺基-1-丙磺酸酯、十二烷基磷酸胆碱、肉豆蔻酰基溶血磷脂酰基胆碱、鸡蛋溶血卵磷脂)、阳离子表面活性剂(季铵碱)(例如十六烷基-三甲基溴化铵、十六烷基吡啶鎓氯化物)、非离子表面活性剂、聚环氧乙烷/聚环氧丙烷嵌段共聚物(Pluronics/Tetronics，Triton X-100，十二烷基β-D-吡喃葡萄糖苷)或聚合表面活性剂(Tween-40，Tween-80，Brij-35)、梭链孢酸衍生物-(例如牛磺-二氢梭链孢酸钠等)、长链脂肪酸及其盐C6-C12(例如油酸和辛酸)、酰基肉毒碱和衍生物，赖氨酸、精氨酸或组氨酸的Nα-酰基化衍生物，或者赖氨酸或精氨酸的侧链酰基化衍生物，包含赖氨酸、精氨酸或组氨酸与中性或酸性氨基酸的任意组合的二肽的Nα-酰基化衍生物、包含中性氨基酸和两个带电氨基酸的任意组合的三肽的Nα-酰基化衍生物，或者该表面活性剂可以选自咪唑啉衍生物或其混合物。这些特定的表面活性剂中的每一种均构成本发明的可替代的实施方案。
在药物组合物中使用赋形剂如防腐剂、等渗剂和表面活性剂对本领域技术人员来说是熟知的。为方便起见，参见RemingtonTheScience and Practice of Pharmacy，19th edition，1995。
在另一方面，本发明涉及包含胰高血糖素样肽、药学上可接受的缓冲液和药学上可接受的防腐剂的药物组合物，其特征在于该药物组合物是由根据本发明的方法制备的。
在另一方面，本发明涉及pH为大约7.2至大约7.8的药物组合物，该组合物包含胰高血糖素样肽和至少一种药学上可接受的赋形剂，其中该组合物在保存方面是稳定的，这是通过该组合物于37℃下储存1个月后该组合物中所含的胰高血糖素样肽在硫黄素(thioflavin)T试验中的荧光增加小于2倍所测得的。
在另一方面，本发明涉及包含肽、药学上可接受的缓冲液和药学上可接受的防腐剂的药物组合物，其特征在于该药物组合物是由根据本发明的方法制备的。
在另一方面，本发明涉及一种治疗高血糖症的方法，所述方法包括肠胃外施用有效量的根据本发明的药物组合物。
该母体胰高血糖素样肽可以通过肽合成，例如固相肽合成，使用t-Boc或F-Moc化学法或其它已确定的技术来生产。该母体胰高血糖素样肽还可以通过这样一种方法生产，该方法包括培养含有该编码多肽的DNA序列并能够在适宜的营养培养基上、在允许表达肽的条件下表达该多肽的宿主细胞，然后从培养基中回收所得的肽。
用于培养细胞的培养基可以是适于宿主细胞生长的任何常规培养基，例如含有适宜添加物的基本或复合培养基。适宜的培养基可购自商业供货商或者可以根据已公开的配方(例如在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。然后可以通过包括以下步骤的常规方法从培养基中回收细胞产生的肽通过离心或过滤从培养基中分离宿主细胞，通过盐(如硫酸铵)沉淀上清液或滤液中的蛋白质组分，通过多种色谱方法，例如离子交换色谱法、凝胶过滤色谱法、亲合色谱法等进行纯化，这取决于所讨论的肽的类型。
编码母体肽的DNA序列可以适宜地来源于基因组或cDNA，例如通过以下方法获得制备基因组或cDNA文库，并通过杂交法，使用合成寡核苷酸探针，根据标准技术(例如参见Sambrook，J，Fritsch，EF和Maniatis，T，Molecular CloningA Laboratory Manual，ColdSpring Harbor Laboratory Press，New York，1989)筛选编码所述肽的全部或部分的DNA序列。还可以通过已建立的标准方法，例如Beaucage和Caruthers，Tetrahedron Letters 22(1981)，18591869所述的phosphoamidite方法或者Matthes等人，EMBO Journal3(1984)，801 805所述的方法来合成制备编码肽的DNA序列。DNA序列还可以通过聚合酶链式反应，使用特异性引物，例如按照US4,683,202或Saiki等人，Science 239(1988)，487-491中所述来制备。
可以将DNA序列插到可以方便地完成重组DNA过程的任何载体内，载体的选择一般取决于待引入的宿主细胞。因此，该载体可以是自主复制型载体，即作为染色体外实体存在的载体，它的复制独立于染色体复制，例如质粒。作为可替代的选择，该载体可以是这样的载体它在被引入宿主细胞时将整合至宿主细胞基因组内，并与已经整合了它的染色体一起复制。
该载体优选为表达载体，其中编码肽的DNA序列可操作地连接了DNA转录所需的额外片断，例如启动子。该启动子可以是在所选择的宿主细胞中表现出转录活性的任何DNA序列，并可以源自编码与宿主细胞同源或异源的蛋白质的基因。用于在多种宿主细胞中指导编码本发明的肽的DNA转录的适宜启动子的实例在本领域中是已知的，例如参考Sambrook等人，上文。
如果需要的话，编码肽的DNA序列还可以可操作地连接适宜的终止子、聚腺苷酸化信号、转录增强子序列和翻译增强子序列。本发明的重组载体还可以包含能使该载体在所讨论的宿主细胞中复制的DNA序列。
该载体还可以包含可选择标记，例如其产物能弥补宿主细胞中的缺陷的基因或者赋予对药物(例如氨苄青霉素、卡那霉素、四环素、氯霉素、新霉素、潮霉素或氨甲喋呤)的耐受性的基因。
为了指导本发明母体肽进入宿主细胞的分泌途径，可以在重组载体中提供分泌信号序列(还已知为前导序列、prepro序列或pre序列)。该分泌信号序列以正确的阅读框中与编码该肽的DNA序列相连接。该分泌信号序列通常位于编码该肽的DNA序列的5′侧。该分泌信号序列可以是正常与该肽相关联的序列，或者可以来自编码另一种分泌蛋白的基因。
用于分别连接编码本发明肽、启动子和可选地终止子和/或分泌信号序列的DNA序列的方法，和将它们插入含有用于复制所需信息的适宜载体的方法，对本领域技术人员来说是熟知的(例如参见Sambrook等人，上文)。
引入DNA序列或重组载体的宿主细胞可以是任何能够产生本发明肽的细胞，包括细菌、酵母、真菌和高等真核细胞。在本领域中熟知并使用的适宜宿主细胞的实例有、但不限于大肠杆菌、酿酒酵母或哺乳动物BHK或CHO细胞系。
通过以下实施例进一步例示本发明，但这些实施例不应被理解为对本发明的保护范围进行限定。前面的说明和以下实施例公开的特征单独或者任意组合方式均可以构成以不同方式实现本发明的实质。
实施例在下面，“化合物1”意指Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)。
在冻干该肽的溶液或悬浮液之前，将其pH调节至目标pH。在冻干药物制剂后，根据一般方法1和2制备药物制剂。
一般方法1将防腐剂、等渗剂和缓冲液溶于水，并将pH调节至7.4。然后将冻干的肽溶解，同时缓慢搅拌。用氢氧化钠和/或盐酸将pH调节至7.4。最后通过0.22μm滤器过滤制剂。
一般方法2将防腐剂、等渗剂和缓冲液溶于水，并将pH调节至7.4。将肽溶于水，同时缓慢搅拌。将两种溶液混合，并用氢氧化钠和/或盐酸调节pH至7.4。最后通过0.22μm滤器过滤制剂。
另一种制备稳定的药物制剂的方法是在包含药物的溶液中将pH升至高于中性pH(＞8)。该药物制剂如一般方法3所述制备。
一般方法3将防腐剂、等渗剂和缓冲液溶于水，并将pH调节至7.4或更低。将化合物1溶于水，同时缓慢搅拌，并通过加入氢氧化钠而将pH调节至11.5。在大约5分钟后，将两种溶液混合，并用氢氧化钠和/或盐酸调节pH至7.4。最后通过0.22μm滤器过滤制剂。
通过硫黄素T-试验评价制剂的物理稳定性。不同制剂的物理稳定性由它们形成原纤维的趋势来表征。确定原纤维存在的方法是硫黄素T-试验。组织学噻唑染料硫黄素T(ThT)用作淀粉样原纤维形成的指示剂。该方法基于ThT的荧光特性。在存在淀粉样原纤维的情况下，ThT的荧光在450nm处表现出激发最大值，并在482nm处表现出增强的发射。已表明ThT荧光强度与淀粉样原纤维浓度的增加成线性关系。在该制剂作为完全填充的玻璃柱体储存不同的时间之后由ThT-试验评价制剂的物理稳定性。
用在冻干前调节至高于中性pH(＞8)的pH的药物制备的药物制剂的结果在开始时(t＝0)和在37℃下储存1个月之后的ThT-试验的结果可见于表1。
表1.在加速稳定性试验的1周或1个月后ThT-试验的结果(荧光单位)。
可以看出，与用在冻干前调节至pH 8.0的化合物1制备的药物制剂(其中看到ThT增加)相比，用在冻干前调节至pH 9.5和11.5的化合物1制备的药物制剂在37℃下储存1周和1个月之后在物理上是更加稳定的(因为没有看到ThT增加)。
通过在包含药物的溶液中升高pH至高于中性pH(＞8)来制备的药物制剂的结果。
表2.在加速稳定性试验的1个月后ThT-试验的结果(荧光单位)。
可以看出，与不将pH升高至高于中性pH(＞8)时制备的药物制剂相比，通过将包含药物的溶液的pH升高至大于中性pH(＞8)而制备的药物制剂在37℃下储存1个月之后在物理上是更加稳定的(因没有看到ThT增加)。
权利要求
1.一种用于增加包含胰高血糖素样肽、药学上可接受的缓冲剂和药学上可接受的防腐剂的药物组合物的保存期限的方法，其特征在于由已在pH8.1-9.6范围内处理过的大量肽产物制备该药物组合物。
2.一种用于增加包含胰高血糖素样肽、药学上可接受的缓冲剂和药学上可接受的防腐剂的药物组合物的保存期限的方法，其特征在于由已在pH8.5-9.6范围内处理过的大量肽产物制备该药物组合物。
3.根据权利要求1的方法，其中该pH在9.0-9.6范围内。
4.根据权利要求1-3之任一项的方法，其中该大量肽产物已在指定的pH范围内、大约5℃至大约25℃的温度下处理10分钟至12小时。
5.根据权利要求1-3之任一项的方法，其中该大量肽产物已在指定的pH范围内、大约5℃至大约25℃的温度下处理1分钟至30分钟。
6.根据权利要求1-5之任一项的方法，其中该药物组合物为溶液。
7.根据权利要求1-5之任一项的方法，其中该药物组合物为悬浮液。
8.根据权利要求1-5之任一项的方法，其中该药物组合物为固体。
9.根据权利要求8的方法，其中该药物组合物将用注射用水或其它适宜的溶剂重构。
10.根据权利要求1-9之任一项的方法，其中该大量肽产物通过在该pH下冻干该胰高血糖素样肽的溶液或悬浮液制备。
11.根据权利要求1-9之任一项的方法，其中在制备该药物组合物期间在所述pH下处理该大量肽产物。
12.根据权利要求1-9之任一项的方法，其中在与该药学上可接受的缓冲剂混合之前在该pH下处理该大量肽产物。
13.根据权利要求1-12之任一项的方法，其中该药物组合物的pH低于处理该大量肽的溶液或悬浮液时的pH。
14.权利要求1-13之任一项的方法，其中该药物组合物的pH比处理该大量肽的溶液或悬浮液时的pH低至少0.8pH单位。
15.根据权利要求1-14之任一项的方法，其中该药物组合物的pH比处理该大量肽的溶液或悬浮液时的pH低至少1.5pH单位。
16.根据前述权利要求之任一项的方法，其中该药物组合物适于肠胃外给药，例如通过注射或输注给药。
17.根据前述权利要求之任一项的方法，其中该药物组合物或该药物组合物的重构溶液的pH为pH 7.0至pH 8.0，优选pH 7.2至pH 7.8。
18.根据前述权利要求之任意项的方法，其中该胰高血糖素样肽的等电点为3.0-7.0，优选4.0-6.0。
19.根据权利要求1-18之任一项的方法，其中该胰高血糖素样肽为胰高血糖素、胰高血糖素类似物或其衍生物。
20.根据权利要求1-18之任一项的方法，其中该胰高血糖素样肽为GLP-1、GLP-1类似物、GLP-1衍生物或GLP-1类似物的衍生物。
21.根据权利要求20的方法，其中该GLP-1类似物选自下述中Gly8-GLP-1(7-36)-酰胺、Gly8-GLP-1(7-37)、Val8-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8-GLP-1(7-37)、Val8Asp22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Asp22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Lys22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Lys22-GLP-1(7-37)、Val8Arg22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8Arg22-GLP-1(7-37)、Val8His22-GLP-1(7-36)-酰胺、Val8His22-GLP-1(7-37)、Val8Trp19Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Val25-GLP-1(7-37)、Val8Tyr16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Leu16Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Tyr18Glu22-GLP-1(7-37)、Val8Glu22His37-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Glu22Val25Ile33-GLP-1(7-37)、Val8Trp16Glu22Val25-GLP-1(7-37)及其类似物。
22.根据权利要求20的方法，其中该GLP-1类似物的衍生物为Arg34，Lys26(Nε-(γ-Glu(Nα-十六烷酰基)))-GLP-1(7-37)。
23.根据权利要求1-22之任一项的方法，其中该大量肽产物的溶液或悬浮液在pH 9.5下处理，且该药物组合物的pH为7.4。
24.根据权利要求19-23之任一项的方法，其中该药物组合物中该胰高血糖素样肽的浓度为0.1mg/mL-50mg/mL、0.1mg/mL-25mg/mL、1mg/mL-25mg/mL、1mg/mL-10mg/mL或3mg/mL-8mg/mL。
25.根据权利要求1-18之任一项的方法，其中该胰高血糖素样肽为GLP-2、GLP-2类似物、GLP-2的衍生物或GLP-2类似物的衍生物。
26.根据权利要求25的方法，其中该GLP-2的衍生物或GLP-2类似物的衍生物具有赖氨酸残基，例如一个赖氨酸，其中亲脂性取代基(可选地通过间隔基)连接到该赖氨酸的ε氨基上。
27.根据权利要求25-26之任一项的方法，其中该药物组合物中该胰高血糖素样肽的浓度为0.1mg/mL-100mg/mL、0.1mg/mL-25mg/mL或1mg/mL-25mg/mL。
28.根据权利要求1-18之任一项的方法，其中该胰高血糖素样肽为exendin-4、exendin-4类似物、exendin-4的衍生物或exendin-4类似物的衍生物。
29.根据权利要求28的方法，其中该肽为exendin-4。
30.根据权利要求28的方法，其中该肽为稳定的exendin-4化合物。
31.根据权利要求28的方法，其中该肽为DPP-IV保护的exendin-4化合物。
32.根据权利要求28的方法，其中该肽为免疫调节的exendin-4化合物。
33.根据权利要求28的方法，其中该肽为ZP-10，即[Ser38Lys39]Exendin-4(1-39)LysLysLysLysLys-酰胺。
34.根据权利要求28-33之任一项的方法，其中该药物组合物中该肽的浓度为5μg/mL-10mg/mL、5μg/mL-5mg/mL、5μg/mL-5mg/mL、0.1mg/mL-3mg/mL或0.2mg/mL-1mg/mL。
35.根据前述权利要求之任一项的方法，其中该缓冲剂选自正磷酸盐、TRIS、甘氨酸、N-甘氨酰甘氨酸、乙酸柠檬酸钠(citratesodiumacetate)、碳酸钠、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸钠和柠檬酸钠或其混合物。
36.根据前述权利要求之任一项的方法，其中该防腐剂选自苯酚、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、2-苯氧基乙醇、对羟基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苄醇、氯丁醇和硫柳汞，或者它们的混合物。
37.根据前述权利要求之任一项的方法，其中包括等渗剂。
38.根据权利要求37的方法，其中该等渗剂为氯化钠、木糖醇、甘露醇、山梨醇、甘油、葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、L-甘氨酸、L-组氨酸、精氨酸、赖氨酸、异亮氨酸、天冬氨酸、色氨酸、苏氨酸、二甲砜、聚乙二醇、丙二醇或其混合物。
39.根据前述权利要求之任一项的方法，其中包括表面活性剂。
40.包含胰高血糖素样肽的药物组合物，其特征在于该药物组合物是根据权利要求1-39之任一项的方法制备的。
41.pH为大约7.2至大约7.8的药物组合物，该组合物包含胰高血糖素样肽和至少一种药学上可接受的赋形剂，其中该组合物在保存方面是稳定的，这是通过该组合物于37℃下储存1个月后该组合物中所含的胰高血糖素样肽在硫黄素T试验中的荧光增加小于2倍测得的。
42.一种用于治疗高血糖症的方法，所述方法包括肠胃外施用有效量的根据权利要求40-41之任一项的药物组合物。
全文摘要
本发明提供了一种增加用于肠胃外给药的包含胰高血糖素样肽的药物组合物的保存期限的方法，所述药物组合物中由已在高于中性pH的pH下处理的肽产物制备而来。
文档编号A61K38/26GK1812807SQ200480017924
公开日2006年8月2日 申请日期2004年6月3日 优先权日2003年6月3日
发明者C·尤尔-莫滕森, D·K·恩格伦德 申请人:诺沃挪第克公司