一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法

专利名称：一株解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株新筛选的解淀粉芽孢杆菌，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏名I7(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏号M206027。该菌株分离自甘肃省兰州市安宁区茄子地的土壤中，它对可引起植物病害的病原真菌具有显著的抑制生长作用，而且对人畜无毒，对生态环境友好，可制备成生物农药产品。
背景技术：
1921年，Hartely利用拮抗真菌防治棉苗猝倒病(Pythium debaryanum)是人们利用拮抗微生物防治植物病害的开端[1]。随后，世界各国都对这一新兴领域进行了广泛研究，试图筛选出拮抗微生物用于植物病害的防治。上世纪50年代以后，大量广泛使用化学农药造成病原菌对化学农药产生抗性，高残留引起环境污染，以及化学农药对人畜产生毒害等加速了人们寻求新的、安全有效的植物病害防治途径。植物病害每年给农业生产带来重大损失，在防治植物病害的各种措施中，生物防治具有对环境、生态和人类健康较为安全的优点，因此，世界各国十分重视生防研究的开展和利用，它将在病害防治中发挥越来越重要的作用。其中生防微生物具有不易使病原菌产生耐药性、对环境安全、生产工艺较简单以及不少微生物同时具有促进作物生长的特点而引起人们的关注和重视[2]。
1973年澳大利亚植物病理学家Kerr利用放射土壤杆菌(Agrobacterium radiobacterK84)成功地防治植物了根癌病，并迅速形成商品化制剂，在美、澳、日等国迅速地推广应用，极大地促进了人们对植物病害生物防治的兴趣[1]。目前广泛应用于植物生防的细菌制剂约有20多种，主要为Agrobacterium、Pseudomonas、Bacillus等属的菌株[3]。
芽孢杆菌属细菌是一类好氧和兼性厌氧、产生芽孢的G+杆状细菌，其生理特征丰富多样，分布及其广泛，是土壤和植物体表根际的重要微生物种群。芽孢杆菌突出的特征是能产生对热、紫外线、电离辐射和某些化学药品有很强抗逆性的芽孢，可忍受各种不良的环境，这有利于生防菌剂的生产、剂型加工及在环境中存活、定殖与繁殖[3，4]。它能产生多种抑制植物病原真菌的抗菌物质，包括大分子量的抗菌蛋白和低分子量的抗菌肽，同时它又是自然界广泛存在的非致病细菌，对人畜无害，对环境无污染，因而在生物防治植物病害中起着重要的作用。田间应用研究已经证实芽孢杆菌生防菌剂在稳定性、与化学农药的相容性和在不同植物不同年份防效的一致性等方面，明显优于非芽孢杆菌和真菌生防菌剂[5]。目前芽孢杆菌属细菌用于防治植物病害的主要有，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、短小芽孢杆菌(B.pumillus)、多粘芽孢杆菌(B.polymyxa)等。
真菌病害一直是危害植物生长、影响作物产量的主要病害[6]，在植物病害中数量最多，达80％以上，分布极广，是植物病害中最重要的一类[7]，植物真菌病害一直给我国农业生产带来严重危害。如侯宪鹏指出陇东地区无公害蔬菜生产中就以真菌病害种类最多、发生面积最大，危害最严重[8]。张俐清通过调查天水市保护地主要蔬菜病害，鉴定确认其中真菌病害就多达37种，而细菌病害和病毒病分别只有3种和5种[9]。国内目前还未见利用解淀粉芽孢杆菌防治植物真菌病害产品的专利，国际上也仅见美国专利6,960,342中公开了一株从台湾百合地土壤中分离到的解淀粉芽孢杆菌菌株，用其作为生防菌，防治由椭圆葡萄孢引起的百合灰霉病[10]。另外，生防菌发挥生防作用还涉及其在不同土壤环境中的定殖，但至今还未见任何一种解淀粉芽孢杆菌生防菌剂能适用于多种土壤类型。本发明中所涉及的解淀粉芽孢杆菌I7，不但该菌株本身具有广谱生防潜力，而且I7的无细胞培养液也具有广谱生防潜力，它们对不少于16株的病原真菌有较高的防效。同领域的研究人员由此还可以预见I7菌株的发酵液以及从I7菌株、I7发酵液、I7发酵液的无细胞培养液中提取的单体或者混合物也同样会具有广谱生防潜力，并且对不少于16株的病原真菌有较高的防效。特别需要指出的是这株解淀粉芽孢杆菌菌株、其发酵液及其提取液等在西北干旱、半干旱的不同土壤类型、气候条件、强紫外线条件下仍表现较高的活性，可用于防治对农业生产危害严重的真菌病害，减少化学农药的用量，保护西北地区的生态环境。由于本发明所涉及的病原真菌广泛存在，显而易见，本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株、其发酵液及从其无细胞培养液中提取的单体或者混合物，尤其是无细胞培养液中提取的单体或者混合物，不仅仅限于在上述地域中应用。
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10.US6，960，342 Method for inhibiting pathogenic fungi in plants usingBacillus amyloliquefaciens.

发明内容
本发明提供了一株新用途的解淀粉芽孢杆菌菌株，它对多种病原真菌的生长都具有明显的抑制作用，而且适应于西北地区的土壤气候条件。该菌株在NA固体培养基和NA液体培养基中的培养温度为28～30℃，培养时间24～48h，NA种子培养基中培养的最佳种龄为24h(接种量1∶100)，再按接种量1∶20接种于发酵培养基，发酵液的pH7.0，转速120rpm/min，温度30℃，发酵时间72h。在以上条件下，该菌株的鉴定特征为杆状细菌，G+性；鞭毛侧生，每个菌体上着生有8～20根鞭毛，其长度约为菌体的2～3倍；有荚膜；形成芽孢，中生，芽孢囊膨大；可在45℃以上的温度条件下正常生长，为高温微生物；可在12％的盐浓度下生长，但不属于嗜盐细菌；生长最适pH在7～8之间，而且在碱性环境中的生长状况要明显好于酸性环境；经VITEK32全自动微生物鉴定系统鉴定为鉴定为Bacillus amyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌)；所测得的16SrRNA序列比对结果显示与已知的解淀粉芽孢杆菌的16SrRNA序列的同源性＞99％；(G+C)mol％测定结果显示I7的(G+C)mol％为49.4％，与解淀粉芽孢杆菌的(G+C)mol％一般值(43.5～44.9％)差别在4～5％，可认为是同种内不同菌株。
本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株I7、I7的发酵液、I7发酵液的无细胞培养液及其从I7菌株、I7发酵液、I7发酵液的无细胞培养液中提取的单体或者混合物对植物病害真菌有强烈的抑制活性，可制备成生物农药应用。
具体实施例方式
实施例1菌株的分离纯化从甘肃省兰州市安宁区发病的茄子地土壤中，选择适当的地点，于5～20mm处采取土样，用稀释平板法从中分离细菌(1)制备土壤稀释液称取土样10g，放入100ml无菌水中，摇床上振荡30min。静置使澄清。无菌操作吸取上清液100μl加入900μl无菌水中，用无菌水稀释为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8共八个浓度梯度。
(2)培养各稀释浓度加入冷至55～60℃的灭菌的NA(牛肉膏3g、蛋白胨5g、葡萄糖10g、酵母浸膏1g、琼脂15g、蒸馏水1000ml、pH7.0)琼脂培养基，制成平板。倒置恒温箱内30℃培养。
(3)挑取单菌落3～4天后，待平板上长出菌落后，根据形态挑取单菌落于20ml灭菌的NA液体培养基中，摇床上30℃恒温振荡培养。
(4)纯化采用平板划线分离法纯化。涂平板检验直至获得纯培养，命名为I7。
(5)保藏纯化的I7采用甘油保藏法，在菌种管中，加/入1ml 30％的甘油，灭菌后加入1ml细菌培养液，使甘油终浓度为15％，-20℃冻存。
该培养物在NA固体培养基上呈白色，菌落形状不规则，表明有褶皱，用接种环挑取时感觉粘稠。
实施例2菌株的鉴定特征1.菌体形态观察和染色反应将I7接种于NA液体培养基中恒温振荡培养适合时间后染色镜检。包括革兰氏染色(结晶紫草酸胺染色法)、鞭毛染色(硝酸银染色法)、荚膜染色(湿墨水法)、芽孢染色(改良的Schaeffer-Fulton氏染色法)。
染色结果I7为杆状细菌，G+性；鞭毛侧生，每个菌体上着生有8～20根鞭毛，其长度约为菌体的2～3倍；有荚膜；形成芽孢，中生，芽孢囊膨大。
2.环境因素对菌株I7的影响2.1 O2对菌株I7的影响采用深层琼脂法来测定O2对I7生长的影响，在装有葡萄糖牛肉膏蛋白胨琼脂深层培养基(pH7.0)的试管中接入I7，28℃恒温箱内静置保温48h后开始连续观察其生长状况，直至10d后结果清晰为止。根据其在试管中的生长部位，判断各自对O2的需求及耐受能力。
结果显示I7只在试管表面生长，为好氧菌。
2.2温度对菌株I7的影响制备NA琼脂平板，使凝固后的培养基厚度为一般培养基的1.5～2倍。将I7涂平板，各取两套平板倒置于4℃、10℃、30℃、45℃、50℃、55℃、60℃及65℃条件下保温48h，观察其生长状况。
表1温度对I7生长的影响

“-”表示不生长，“+”表示生长较差，“++”表示生长一般，“+++”表示生长良好。
由上表看出，I7可在45℃以上的温度条件下正常生长，为高温微生物。
2.3渗透压对菌株I7的影响制备含0.85％、5％、10％、12％、15％、20％及25％NaCl的牛肉膏蛋白胨琼脂培养基平板。将I7涂平板，各两套，28℃恒温箱内培养。7d后观察并记录含不同浓度NaCl平板上I7的生长情况。
表2 渗透压对I7生长的影响

“-”表示不生长，“+”表示生长较差，“++”表示生长一般，“+++”表示生长良好。
由上表看出，I7可在12％的盐浓度下生长，但不属于嗜盐细菌。
2.4 pH对菌株I7的影响制备pH 3，4，5，6，7，8，9，10，11，12的NA液体培养基。无菌操作接种等量的I7幼龄菌液，保证各培养瓶中接入的菌液浓度一致。120rpm/min，30℃下振荡培养24h后，测定培养物的OD600值。
表3 pH对菌株I7生长的影响

由上表看出，I7的生长最适pH在7～8之间，而且它在碱性环境中的生长状况要明显好于酸性环境。
3.I7的生理生化反应以全自动微生物鉴定系统VITEK 32及配套需氧芽孢杆菌鉴定卡(BAC卡)进行生化特性鉴定，共检测31项生化指标。
表4 I7的生化鉴定结果

注生化指标缩写全称参考VITEK需氧芽孢杆菌鉴定卡(BAC卡)使用说明。
I7鉴定为Bacillus amyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌)，可信度＞99％。
4.16S rRNA寡核苷酸序列分析使用CEQXL2000，BECKENMAN-COUNLTERDNA测序仪进行I7的16S rRNA序列测定。测序引物为27f 5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3685r5-TCTACGCATTTCACCGCTAC-3705f5-GTAGCGGTGAAATGCGTAGA-31492r 5-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3测出该菌株16S rRNA基因的2部分序列，分别是625bp和721bp。
625bp序列GTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGAGGGAACTTGAGTGC721bp序列CGACTCTCTGGTTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCT将这2部分序列在www.ncbi.nlm.nih.govhttp://www.ncbi.nlm.nih.gov网站上用BLAST工具与已登录的部分菌株的16S rRNA基因序列进行比对，结果表明与解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的同源性均＞99％。
5.DNA碱基比例的测定使用的仪器为带配套温控装置的SHIMADZU UV-1700紫外可见分光光度计，波长固定在260nm，待测I7DNA样品用0.1SSC稀释至OD260在0.3～0.6之间。以E.coli K12做参比菌株，采用热变性温度法测定由于测出的E.coli-K12的Tm值为75.7(0.1SSC中)，所以由以下公式计算I7的(G+C)mol％值0.1SSC(G+C)mol％＝51.2+2.08(Tm未知菌-Tm E.coli K12)所测得的I7的Tm值为74.87，计算得I7的(G+C)mol％为49.4％。
解淀粉芽孢杆菌的(G+C)mol％一般在43.5～44.9％(伯杰细菌鉴定手册，第八版)。由于不同细菌(G+C)mol％差异2％内无意义，可认为是同一细菌；4～5％同种内不同菌株；＞5％不属同一种；10～15％同属内不同细菌；20～30％不同属甚至不同科。I7的(G+C)mol％为49.4％，与解淀粉芽孢杆菌的(G+C)mol％一般值差别在4～5％，也可认为是同种内不同菌株实施例3I7菌株无细胞培养液的制备①将I7按接种量1∶100的比例接种于25ml小量NA液体培养基(pH7.0)中，120rpm/min，30℃，振荡培养24h；②再将上述培养液按1∶20的比例接种于1000ml大量NA液体培养基(pH7.0)中，120rpm/min，30℃，振荡培养72h；③将发酵液经8000～12000r/min离心取上清，收集到的上清液经细菌滤膜(0.22μm)过滤后得到的浓缩液，将其涂布在平板上，检测至无活菌，即为I7无细胞培养液。
实施例4I7菌株、I7无细胞培养液对病原菌的抑菌效果1.I7菌株对病原菌的抑菌效果将I7按1∶100的比例接种于NA液体培养基中，120rpm/min，温度30℃，振荡培养24h后，吸取200μl菌液均匀涂布于NA琼脂平板，恒温箱内30℃培养48h后，用打孔器打取7mm的I7菌饼，接入PDA琼脂平板中央，20mm外四周等距接入7mm的病原真菌菌饼，对照以NA琼脂块代替I7菌饼，每处理重复3皿。恒温箱内28℃培养。待对照长满平皿时，十字交叉法测量拮抗带直径，每皿测2个数据，共测6个。(D1、D2为第1皿测量数据，D3、D4为第2皿测量数据，D5、D6为第3皿测量数据，D为平均数)表5 I7对16种病原菌的抑菌效果

1-桃炭疽病菌 2-梨黑斑病菌 3-苹果褐腐病菌4-锐顶镰刀菌5-尖孢镰刀菌 6-半裸镰刀菌 7-辣椒黑腐病菌8-黄瓜枯萎病菌9-番茄早疫病菌 10-茄子早疫病菌11-立枯丝核菌 12-小麦根腐病菌13-马铃薯丝核菌 14-马铃薯早疫病菌 15-马铃薯晚疫病菌 16-西瓜霜霉病菌2.I7无细胞培养液对病原菌的抑菌效果采用含介质的方法将I7菌株制剂稀释10倍(1/10)、20倍(1/20)、40倍(1/40)、100倍(1/100)和400倍(1/400)，在PDA平板中央移入病原真菌菌块；采用直接滴定法将原液及各稀释梯度的稀释液取200μl直接滴定在直径为7mm的菌块上，置28℃下培养，72h后测定病原菌菌块生长直径。对照在病原真菌菌块上滴加无菌水。每处理设5个重复，试验重复2次。
表6 72h后各稀释梯度下病原菌生长直径

1-桃炭疽病菌 2-梨黑斑病菌 3-苹果褐腐病菌 4-锐顶镰刀菌5-尖孢镰刀菌 6-半裸镰刀菌 7-辣椒黑腐病菌 8-黄瓜枯萎病菌9-番茄早疫病菌 10-茄子早疫病菌11-立枯丝核菌 12-小麦根腐病菌13-马铃薯丝核菌 14-马铃薯早疫病菌 15-马铃薯晚疫病菌 16-西瓜霜霉病菌表7由表6的数据计算得到抑制率＝100％×(CK直径-病原菌直径)/CK直径表7 72h后各稀释梯度对病原菌生长的抑制率

1-桃炭疽病菌 2-梨黑斑病菌 3-苹果褐腐病菌 4-锐顶镰刀菌5-尖孢镰刀菌 6-半裸镰刀菌 7-辣椒黑腐病菌 8-黄瓜枯萎病菌9-番茄早疫病菌 10-茄子早疫病菌11-立枯丝核菌 12-小麦根腐病菌13-马铃薯丝核菌 14-马铃薯早疫病菌 15-马铃薯晚疫病菌 16-西瓜霜霉病菌
权利要求
1.一株解淀粉芽孢杆菌I7，分离自甘肃省兰州市安宁区茄子地的土壤中，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏名Bacillus amyloliquefaciens I7，保藏号为M206027。
2.根据权利要求1所述的一株解淀粉芽孢杆菌I7，其特征如下解淀粉芽孢杆菌I7在NA固体培养基(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10g，酵母浸膏1.0g，琼脂15g，水1000ml，pH7.0)和NA液体培养基(牛肉浸膏3.0g，蛋白胨5.0g，葡萄糖10g，酵母浸膏1.0g，水1000ml，pH7.0)中培养，培养条件温度28～30℃，培养时间24～48h，该菌的鉴定特征为I7为杆状细菌，G+性；鞭毛侧生，每个菌体上着生有8～20根鞭毛，其长度约为菌体的2～3倍；有荚膜；形成芽孢，中生，芽孢囊膨大；可在45℃以上的温度条件下正常生长，为高温微生物；可在12％的盐浓度下生长，但不属于嗜盐细菌；生长最适pH在7～8之间，而且它在碱性环境中的生长状况要明显好于酸性环境；经VITEK 32全自动微生物鉴定系统鉴定为鉴定为Bacillus amyloliquefaciens(解淀粉芽孢杆菌)；所测得的16SrRNA序列比对结果显示与已知的解淀粉芽孢杆菌的16S rRNA序列的同源性＞99％；(G+C)mol％测定结果显示I7的(G+C)mol％为49.4％，与解淀粉芽孢杆菌的(G+C)mol％一般值(43.5～44.9％)差别在4～5％，可认为是同种内不同菌株。
3.根据权利要求1和2所述的一株解淀粉芽孢杆菌I7，其特征在于该菌株可作为广谱抗真菌生防菌应用，尤其是用于桃炭疽病菌、梨黑斑病菌、苹果褐腐病菌、锐顶镰刀菌、尖孢镰刀菌、半裸镰刀菌、辣椒黑腐病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、茄子早疫病菌、立枯丝核菌、小麦根腐病菌、马铃薯丝核菌、马铃薯早疫病菌、马铃薯晚疫病菌、西瓜霜霉病菌等植物病原真菌的生物防治。
4.根据权利要求1和2所述的一株解淀粉芽孢杆菌I7，其特征在于该菌株的无细胞培养液可作为广谱抗真菌生防剂应用，尤其是用于桃炭疽病菌、梨黑斑病菌、苹果褐腐病菌、锐顶镰刀菌、尖孢镰刀菌、半裸镰刀菌、辣椒黑腐病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、茄子早疫病菌、立枯丝核菌、小麦根腐病菌、马铃薯丝核菌、马铃薯早疫病菌、马铃薯晚疫病菌、西瓜霜霉病菌等植物病原真菌的生物防治。
5.根据权利要求1和2所述的一株解淀粉芽孢杆菌I7，其特征在于I7菌株的发酵液以及从I7菌株、I7发酵液、I7发酵液的无细胞培养液中提取的单体或者混合物可作为广谱抗真菌生防剂应用，尤其是用于桃炭疽病菌、梨黑斑病菌、苹果褐腐病菌、锐顶镰刀菌、尖孢镰刀菌、半裸镰刀菌、辣椒黑腐病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、茄子早疫病菌、立枯丝核菌、小麦根腐病菌、马铃薯丝核菌、马铃薯早疫病菌、马铃薯晚疫病菌、西瓜霜霉病菌等植物病原真菌的生物防治。
全文摘要
一株解淀粉芽孢杆菌及应用。菌株分离自甘肃省兰州市安宁区茄子地的土壤中，经鉴定为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏名Bacillus amyloliquefaciens I7，保藏号M206027；菌株I7、I7发酵液、I7发酵液的无细胞培养液及其从I7菌株、I7发酵液、I7发酵液的无细胞培养液中提取的单体或者混合均可用于桃炭疽病菌、梨黑斑病菌、苹果褐腐病菌、锐顶镰刀菌、尖孢镰刀菌、半裸镰刀菌、辣椒黑腐病菌、黄瓜枯萎病菌、番茄早疫病菌、茄子早疫病菌、立枯丝核菌、小麦根腐病菌、马铃薯丝核菌、马铃薯早疫病菌、马铃薯晚疫病菌、西瓜霜霉病菌等植物病原真菌的生物防治。本发明原料易得，易于实施，可大批量生产和推广应用。
文档编号A61P3/00GK1952116SQ20061020036
公开日2007年4月25日 申请日期2006年4月18日 优先权日2006年4月18日
发明者李红玉, 王亚丽, 支德娟 申请人:兰州大学