专利名称：用于递送核酸的脂肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于向细胞递送各种分子的新型药物递送增强剂，该增强剂包括 脂质。本发明提供了多种化合物，组合物，制剂，最终引导药物递送的此试剂的方法和应 用，疗法，以及疾病或病症的诊断和治疗，其中包括对受试者基因表达或活性的调控作出 响应的那些疾病或病症。更具体地，本发明涉及化合物、脂质体、复层脂质体(lamellar vesicles)、乳液、胶束、悬液、颗粒、溶液和其它形式的递送增强组合物和制剂，以及这些递 送物质的治疗方法和应用。
背景技术：
化合物到达目标细胞或组织的能力有限以及化合物在细胞内的进入或运输受限 可阻止治疗性化合物向受试者的递送。治疗性物质的递送通常受到细胞膜的制约。这些递 送障碍和制约可导致需要使用的化合物浓度远高于获得治疗结果的理想浓度，而这样会带 来毒性作用和副作用的风险。一个递送策略是利用脂质或聚合载体分子提高化合物向细胞内的运输。这些物质 可以利用用于选择性进入细胞，并同时还排除外源分子(例如核酸和蛋白)的机制。例如， 阳离子脂质可以与药物试剂相互作用，并提供与细胞膜的接触。脂质分子也可以被组装成 脂质体或颗粒，作为药物试剂的载体。脂质药物载体可以保护药物分子免于降解，并同时提 高细胞对药物的摄取。另外，脂质药物载体还可以通过静电或其它相互作用而封装或结合 某些化合物，并且与带负电荷的细胞膜相互作用，从而启动跨膜运输。对调控RNA的了解以及RNA干扰(RNAi)、RNAi治疗、基于RNA的药物、反义治疗和 基因治疗等的发展提高了对向细胞内引入活性核酸试剂的有效方式的需求。通常，核酸在 细胞或血浆内仅稳定存在有限的时间。然而，可以使基于核酸的试剂在组合物和制剂中获 得稳定，然后分散以用于细胞递送。需要的是保持细胞保护作用和较低毒性的组合物和制剂，是它们用于细胞内和体 内递送最终用作治疗剂的核酸试剂。另外，还需要向细胞递送双链RNA的组合物和方法，从 而产生RNA干扰应答。另外，还需要向所选择的细胞、组织或腔室递送干扰RNA的组合物和 方法，从而以改变表型或疾病状态的方式调节基因表达。发明概述通过提供利用干扰核酸或其前体与包括脂肽、脂质和天然或合成聚合物在内的多 种组分所组合的大量新型化合物、组合物、制剂和方法，本发明可以满足这些需要并实现了 其它目的和优点。在一些实施方式中，本发明包括具有2-100个氨基酸残基的肽和与所述肽的至少 一个末端或至少一个氨基酸残基相连的亲脂基团，其盐及其应用。所述亲脂基团可以与所 述肽的N-末端、C-末端或两端相连。所述亲脂基团可以与至少一个内部氨基酸残基(即， 既不是所述肽的N-末端，也不是C-末端氨基酸残基的氨基酸残基)相连。所述亲脂基团 可以与任一末端或两端以及至少一个内部氨基酸残基相连。
以上简述与本发明的详述以及所附实施例和权利要求书作为一个整体，包含了本 发明的内容。发明详述本发明主要涉及RNA干扰、RNA治疗剂的递送以及脂质化学的领域。更具体地，本 发明涉及用于核糖核酸的组合物和制剂，以及其作为治疗剂用于药物和用于递送的应用。 本发明主要涉及利用核糖核酸进行RNA干扰，从而基因特异性地抑制哺乳动物基因表达的 方法。本发明提供了包含干扰核酸或其前体与多种组分所组合的多种组合物、制剂和方 法，其中，所述多种组分包括脂肽、脂质、类脂部分和天然或合成聚合物。在一些方面，本发明提供了促进向细胞、组织、器官和活体动物(例如哺乳动物和 人)递送包括RNAi诱导试剂、反义RNA试剂或DNA在内的核酸的新型组合物。Mli本发明提供了用于递送和施用干扰-RNA试剂或反义RNA的多种脂肽。所述脂肽 可以为阳离子或非阳离子。本文使用的非阳离子包括中性和阴离子。阳离子脂肽可以具有 一个或多个阳离子位点。可以通过在肽的N-末端或C-末端或所述肽的两端取代核酸递送增强基团或类脂 基团，形成本发明的脂肽。在一些方面，所述核酸递送基团或类脂基团可以连接到所述肽 的一个或多个氨基酸残基的α-碳，或者连接到分别与所述肽的氨基酸残基α-碳相邻的 一个或多个氨基基团，或者是连接到所述肽的N-末端、C-末端、一个或多个氨基酸残基的 α -碳的这些连接方式的组合，或者连接到分别与所述肽的氨基酸残基α -碳相邻的一个 或多个氨基基团。在一些实施方式中，所述核心结构肽可以包含两个或更多个连续氨基酸， 或有 2-100 个氨基酸残基(或者 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、 21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、 46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、 96、97、98、99或100个氨基酸残基)的肽。在一些方面，本发明提供了式I所示的一系列脂肽结构R3-J- (NRN-CR1R2- (C = 0)} n_Z_R4 式 I其中各个R1每次出现独立地为氨基酸的非氢侧链；
(NRN-CR1R2- (C = 0)} n 为核心结构肽；R2和Rn彼此独立地为氢，或由碳、氧、氮、硫和氢原子组成且具有1-20个碳原子 的有机基团，或者为C(l-22)烷基、(6-12)环烷基、(6-12)环烷基烷基、C(3_18)烯基、 C (3-18)炔基、C (1-5)烷酰基、C (1-5)烷酰氧基、C (1-5)烷氧基、C(l_5)烷氧基_C(1_5) 烷基、C(l-5)烷氧基-C(l-5)烷氧基、C(l-5)烷基-氨基-C(l-5)烷基_、C(1_5) 二烷 基-氨基-C(l_5)烷基_、硝基-C(l-5)烷基、氰基-C(l-5)烷基、芳基-C(l-5)烷基、4-联 苯基-C (1-5)烷基、羧基或羟基；R3和R4彼此独立地为亲脂性尾部，其源自天然存在的或合成的脂质、磷脂、糖脂、 三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷酯或神经节苷脂，其中所述尾部可以包含类固醇或由碳、氧、氮、硫和氢原子组成并且具有1-20个碳原子的有机基团，或者为 取代或未取代的C(l-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-烷基、C(3-18)烯基、 C (3-18)炔基、C (1-5)烷氧基-C (1-5)烷基，或者为二氢神经鞘氨醇(sphinganine), (2R， 3R) -2-氨基-1，3-十八烷二醇、2-氨基-1，3- 二十烷二醇(icosasphinganine)、鞘氨醇、植 物鞘氨醇、顺式-4-鞘氨醇(cis-4-sphingenine)或者神经酰胺；Z为NH，0，或包含马来酰亚胺基、硫醚、酰胺、半胱胺(cysteamide)、半胱氨酸、硫 醇或二硫基的连接子，或包含1-400个原子的聚氧乙烯或聚氧丙烯基，或者包含选自C、H、 F、Cl、Br、N、0、S、Si和P的组的1-200个原子的连接子；J为(C = 0)，0，或包含马来酰亚胺基、硫醚、酰胺、半胱胺、半胱氨酸、硫醇或二硫 基的连接子，或包含1-400个原子的聚氧乙烯或聚氧丙烯基，或者包含选自C、H、F、Cl、Br、 N、0、S、Si和P的组的1-200个原子的连接子；并且，η为 2-100。可以制备本发明的脂肽，其中，例如所述肽能够结合核酸。可以制备本发明的脂肽，其中，例如所述肽可以为两性氨基酸序列。例如，所述肽 可以具有形成疏水序列域或基序的多个非极性或疏水氨基酸残基，所述疏水序列域或基序 可以与形成带电序列域或基序的多个带电氨基酸残基相连，从而形成两性肽。可以制备本发明的脂肽，其中，例如所述肽可以为聚-Lys-Trp(4 :1， Mw20, 000-50，000)，聚-Orn-Trp (4 :1，Mw 20，000-50，000)，蜂毒肽(mellitin)蛋白的片段 或变体，以及组蛋白(例如组蛋白HI、组蛋白H2A、组蛋白H2B、组蛋白H3或组蛋白H4)的片 段或变体。可以制备本发明的脂肽，其中，例如所述肽可以具有多个阳离子位点或多个带正 电荷的残基。所述肽可以包含约2-约45个带正电荷的残基，约3-约45个带正电荷的残基，约 4-约45个带正电荷的残基，约5-约45个带正电荷的残基，约10-约45个带正电荷的残 基，约15-约45个带正电荷的残基，约20-约45个带正电荷的残基，约25-约45个带正电 荷的残基，约30-约45个带正电荷的残基，约35-约45个带正电荷的残基，约40-约45个 带正电荷的残基。所述肽可以是被充分硫醇化(thiolylated)的聚赖氨酸肽。它们可以包含至少约 3、4、5、6、7或8个硫醇基团等，或者可以仅具有两个硫醇基团。可以制备本发明的脂肽，其中，例如所述核心结构肽为精氨酸(Arg) n (SEQID NO 341)、高精氨酸(homoArg)n(侧链-(CH2) 4NH(C = NH) NH2)、降精氨酸(norArg)n(侧 链 _ (CH2) 2NH (C = NH) NH2)、降-降精氨酸(nornorArg) n (侧链-(CH2) NH (C = NH) NH2)、鸟氨 酸(Om)n、赖氨酸(LyS)n(SEQ ID NO :342)、组氨酸(His)n(SEQ ID NO :343)，其中 η 为 2-100。可以制备本发明的脂肽，其中，例如所述肽为(Arg, His)n、(Lys, His)n、(Arg, Lys)n、His-(Arg)n-His (SEQ ID NO :344)、His-(Lys)n-His (SEQ ID NO :345)、(His)n-(Arg) n-(His)n(SEQ ID NO 346)或(His)n-(Lys)n-(His)n(SEQ ID NO :347)，其中 η 为 2-100。本发明脂肽的核心结构肽的实例包括表1所示的肽。表1 脂肽的肽结构氨基酸序列SEQ ID NO (R)n，其中 η = 1-201(!(、，其中！! = 1-202(R)n (K)m，其中每个η和m均独立地为1-203(RH) 或(HR)n,其中 η = 1-204&348[(RH)n(HR)J，其中每个η和m均独立地为1_205(KH) 或(HK)n,其中 η = 1-206&349[(KH)n(HK)J，其中每个η和m均独立地为1_207H(K)nH,其中 η = 1-208H(R)nH,其中 η = 1-209(H)8(R)810(H)4(R)811(H)4(R)4(K)412(H)8(R)8(H)8(K)13(H)4(R)5(H)3(K)314ΗΗΗΗΗΚΗΗΗΚΚΚΗΚΗΚΚΚ15KGSKKAVTKAQKKDGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ16KGSKKAVTKAQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ17AQKKEGKKRKRSRKESYSVYVYKVLKQ18KRSRKESYSVYVYKVLKQ19
8ESYSVYVYKVLKQ20YKVLKQ21RVIRffFQNKRSKDKK22GALFLGFLGAAGSTMGAffSQPKSKRKV23RQIKIffFQNRRMKffKK24RQIKIWFQNRRMKWKK (均为 D-氨基酸)25GffTLNSAGYLLKINLKALAALAKKIL26LLNQLAGRMIPKffSQKSKRKV27TLDHVLDHVQTffSQKSKRKV28SYFILRRRRKRFPYFFTDVRVAA29RRRRRRRRRR30RRRRRRRR(均为D-氨基酸)31KETffffETffffTEffSQPGRKKRRQRRRPPQ32GRPRESGKKRKRKRLKP33KSYSVYVYKVLKQ34ESYSVYVYRVLRQ35RSYSVYVYRVLRQ36QKLVKYVYVSYSE37ESYSVYVYKVLKQ (均为 D-氨基酸)38ASYSVYVYAVLAQ39QKLVKYVYVSYSE (均为 D-氨基酸)40
权利要求
包含式I所示结构的化合物R3 J {NRN CR1R2 (C＝O)}n Z R4式I其中各个R1独立地为氨基酸的非氢侧链；{NRN CR1R2 (C＝O)}n为核心结构肽；R2和RN彼此独立地为氢，或为由碳、氧、氮、硫和氢原子组成且具有1 20个碳原子的有机基团，或者为C(1 22)烷基、C(6 12)环烷基、C(6 12)环烷基烷基、C(3 18)烯基、C(3 18)炔基、C(1 5)烷酰基、C(1 5)烷酰氧基、C(1 5)烷氧基、C(1 5)烷氧基 C(1 5)烷基、C(1 5)烷氧基 C(1 5)烷氧基、C(1 5)烷基 氨基 C(1 5)烷基 、C(1 5)二烷基 氨基 C(1 5)烷基 、硝基 C(1 5)烷基、氰基 C(1 5)烷基、芳基 C(1 5)烷基、4 联苯基 C(1 5)烷基、羧基或羟基；R3和R4彼此独立地为亲脂性尾部，其源自天然存在的或合成的脂质、磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷酯或神经节苷脂，其中所述尾部可以包含类固醇，或由碳、氧、氮、硫和氢原子组成并且具有1 20个碳原子的有机基团，或取代或未取代的C(1 22)烷基、C(6 12)环烷基、C(6 12)环烷基 烷基、C(3 18)烯基、C(3 18)炔基、C(1 5)烷氧基 C(1 5)烷基，或二氢神经鞘氨醇、(2R，3R) 2 氨基 1，3 十八烷二醇、2 氨基 1，3 二十烷二醇、鞘氨醇、植物鞘氨醇、顺式 4 鞘氨醇或者神经酰胺；Z为NH、O，或包括马来酰亚胺基、硫醚、酰胺、半胱胺、半胱氨酸、硫醇或二硫基的连接子，或包含1 400个原子的聚氧乙烯基或聚氧丙烯基，或者包含1 200个选自C、H、F、Cl、Br、N、O、S、Si和P的组中的原子的连接子；J为(C＝O)，O，或包括马来酰亚胺基、硫醚、酰胺、半胱胺、半胱氨酸、硫醇或二硫基的连接子，或包含1 400个原子的聚氧乙烯基或聚氧丙烯基，或包含1 200个选自C、H、F、Cl、Br、N、O、S、Si和P的组中的原子的连接子；其中n为2 100。
2.如权利要求1所述的化合物，其中，所述肽的氨基酸序列选自由SEQIDN0s:l-300和 350-356组成的组。
3.如权利要求1所述的化合物，其中，所述肽的氨基酸序列选自由以下组 成的组GALFLAFLAAALXaaLMGLWXaaQXaaKKKRKV (SEQ ID NO :291)、WSQPKKKRKV (SEQ ID NO 292) , WffHHKKRRCCRRKKHHffff (SEQ ID NO :94)、XaaWSQPKKKRKVXaa (SEQ ID NO 293) , WXaaQPKKKRKXaa (SEQ ID NO 294) XaaXaaQPKKKRKV (SEQ ID N0:295)、 LIRLffXaaHLIHIffFQXaaRRLKffKKK (SEQ ID NO 297) , QNRRLKffKKK (SEQ ID NO :298)、 XaaQNRRLKffKKKXaa(SEQ ID NO :299)和 QXaaRRLKWKKK (SEQ ID NO :300)，其中每个Xaa独立地 为 L、A、Q、H、E、R 或 K。
4.如权利要求1所述的化合物，其中，所述肽连有侧链，所述侧链包含选自以下的释放 官能团3，5- 二碘-酪氨酸，1-甲基组氨酸，2-甲基丁酸，2-0-茴香基丙酸，内消旋酒石酸， 4，6-二甲基氨基嘧啶，对苯二甲酸，肌氨酸酐，丁酸，N, N-二甲基-1-萘胺，戊酸，4-甲基 戊酸，N-甲基苯胺，1，10-邻二氮杂菲，3-吡啶羧酸，己酸，丙酸，4-氨基苯甲酸，2-甲基丙 酸，庚酸，辛酸，环己羧酸，喹啉，3-氨基喹啉，2-氨基苯甲酸，4-吡啶羧酸，壬酸，三聚氰胺，8-羟基喹啉，三甲基乙酸，6-甲氧基喹啉，4_(甲基氨基)苯甲酸，对甲苯胺，3_(甲基氨基) 苯甲酸，苹果酸，N-乙基苯胺，2-苯甲基吡啶，3，6_二硝基酚，N，N-二甲基苯胺，2，5-二甲基 哌嗪，对氨基苯乙醚，5-甲基喹啉，2-苯基苯并咪唑，吡啶，吡啶甲酸，3，5- 二碘酪氨酸，对 茴香胺，2-(甲基氨基)苯甲酸，2-氨基噻唑，戊二酸，己二酸，异喹啉，衣康酸，邻苯二甲酸， 苯并咪唑，哌嗪，庚二酸，吖唳，菲唳，琥珀酸，甲基琥珀酸，4-甲基喹啉，3-甲基吡唳，7-羟 基异喹啉，丙二酸，甲基丙二酸，2-甲基喹啉，2-乙基吡唳，2-甲基吡唳，4-甲基吡啶，组胺， 组氨酸，马来酸，顺式-1，2-环己二胺，3，5-二甲基吡啶，2-乙基苯并咪唑，2-甲基苯并咪 唑，可卡酸，萘嵌间二氮杂苯，柠檬酸，异柠檬酸，2，5- 二甲基吡啶，罂粟碱，6-羟基-4-甲 基蝶啶，L-甲状腺素，3，4_ 二甲基吡唳，甲氧基吡唳，反式-1，2-环己二胺，2，5_吡啶二胺， 1-1-甲基组氨酸，1-3-甲基组氨酸，2，3_ 二甲基吡唳，黄蝶呤，1，2_丙二胺，N，N-二乙基 苯胺，阿脲酸，2，6- 二甲基吡啶，L-肌肽，2-氨基吡啶，N-b-丙氨酰基组氨酸，毛果芸香碱， 1-甲基咪唑，IH-咪唑，2，4- 二甲基吡啶，4-硝基酚，2-硝基酚，酪氨酸酰胺，5-羟基喹唑 啉，1，1_环丙二羧酸，2，4，6_三甲基吡啶，巴比妥，2，3-二氯苯酚，1，2-乙二胺，1-氨基异喹 啉，及其组合。
5.药物组合物，其包含干扰RNA试剂和一种或多种权利要求1所述的化合物或其药学 上可接受的盐。
6.如权利要求5所述的组合物，其中，所述干扰RNA试剂为siRNA。
7.如权利要求5所述的组合物，其中，所述干扰RNA试剂为mdRNA。
8.药物组合物，其包含干扰RNA试剂、一种或多种权利要求1所述的化合物或其药学上 可接受的盐、一种或多种非阳离子脂质、和聚合脂质。
9.如权利要求8所述的组合物，其中，所述干扰RNA试剂为siRNA。
10.如权利要求8所述的组合物，其中，所述干扰RNA试剂为mdRNA。
11.如权利要求8所述的组合物，其中，所述一种或多种化合物为 (C20)-(H)88(H)8K-NH-(C20) (SEQ ID NO: 13)。
12.如权利要求8所述的组合物，其中，所述非阳离子脂质选自DDPE、DLPE、DSPE、DOPE、 DLinPE, DlenPE、DARAPE, DDHAPE, DphPE, DSPC、DPPC, DDPC, DPPS, DSPS、胆固醇、羊毛甾醇、 豆甾醇、二氢羊毛留醇、酵母留醇、酵母留烯醇、链留醇、7-脱氢胆固醇、PEG化的胆固醇、胆 甾醇乙酸酯、胆留醇花生四烯酸酯、胆留醇丁酸酯、胆留醇己酸酯、胆留醇辛酸酯、胆留醇正 癸酸酯、胆留醇月桂酸酯、胆留醇肉蔻酸酯、胆留醇棕榈酸酯、胆留醇山嵛酸酯、胆留醇硬脂 酸酯、胆留醇神经酸酯、胆留醇壬酸酯、胆留醇正戊酸酯、胆留醇油酸酯、胆留醇反油酸酯、 胆甾醇芥酸酯、胆留醇庚酸酯、胆留醇反亚油酸酯、胆留醇亚油酸酯、及其混合物和衍生物。
13.如权利要求8所述的组合物，其中，所述聚合脂质选自DMPE-MPEG-2000、 DMPE-MPEG-5000、DPPE-MPEG-2000、DPPE-MPEG-5000、DSPE-MPEG-750、DSPE-MPEG-2000、 DSPE-MPEG-5000、胆固醇硫酸酯钠盐、PEG化的胆固醇、其药学上可接受的盐、及其混合物。
14.向细胞递送干扰RNA试剂的方法，其包括制备权利要求8所述的组合物和用所述组 合物处理细胞。
15.抑制细胞中基因表达的方法，其包括制备权利要求8所述的组合物和用所述组合 物处理细胞。
16.抑制哺乳动物中基因表达的方法，其包括制备权利要求8所述的组合物和向所述哺乳动物施用所述组合物。
17.权利要求8所述的组合物在制备用于治疗疾病、病变或病症的药物中的应用。
18.如权利要求17所述的应用，其中，所述疾病或病症为癌症、代谢疾病或病变、或炎症。
19.权利要求8的组合物在制备用于治疗病毒感染的药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及包含具有2-100个氨基酸残基的肽，且具有与所述肽的至少一个末端或所述肽的至少一个氨基酸残基相连的亲脂基团的脂肽化合物，其盐及其应用。所述亲脂基团可以与所述肽的N-末端、C-末端或两端相连。所述亲脂基团可以与至少一个内部氨基酸残基(即，既不是所述肽的N-末端，也不是C-末端氨基酸残基的氨基酸残基)相连。所述亲脂基团可以与任一末端或两端以及至少一个内部氨基酸残基相连。
文档编号A61P31/12GK101939027SQ200880110140
公开日2011年1月5日 申请日期2008年10月2日 优先权日2007年10月2日
发明者罗格·C·阿达米, 迈克尔·E·休斯顿, 雷切尔·E·约翰斯 申请人:Mdrna有限公司