抗tl1a的人源化抗体的制作方法

专利名称：抗tl1a的人源化抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗TLlA的抗体，以及制造和使用这种抗体的方法。预期所述抗体在治 疗诸如克罗恩氏病之类的炎症性疾病方面特别有用。
背景技术：
结构上与肿瘤坏死因子(TNF)有关的蛋白质被统称为TNF超家族。作为TNF超家 族成员的TLlA是TNF样细胞因子，它结合至死亡域受体(DR) 3并向活化淋巴细胞提供共刺 激信号。通过这种相互作用，TLlA诱导IFN-Y的分泌，因此可能参与辅助性T细胞-1型 效应子应答的形成。TLlA是II型跨膜蛋白且已被命名为TNF超家族成员15(TNFSF15)。TLlA主要由 内皮细胞和单核细胞表达，并且其表达可由TNF-a和IL-Ia诱导。Migone等，Immunity，16 479-92(2002)。TLla受促炎细胞因子TNF和IL-I正调节，也受免疫复合物(IC)正调节。 Hsu 等，Exp. Cell Res.，292 :241_51 (2004)。TLlA经由其关联受体DR3介导信号转导，DR3是死亡受体，已知该受体的活化诱导 死亡因子和存活因子。类似于TNF，TL1A也被推定为以同源三体的可溶形式循环。Kim等， J. Immunol. Methods,298(1-2) 1-8(2005 年 3 月)。TLlA以高亲和性结合至死亡受体3 (DR3)，该受体是含死亡域的TNF受体家族的 成员，并且该受体也被称为Wsl-1、Apo-3、TRAMP和LARD，现被命名为TNF受体超家族成员 25(TNFRSF25)。根据细胞环境，TLlA与DR3的连接可引发两种信号通路中的一种、转录因 子NF-kB的活化或胱天蛋白酶的活化以及凋亡。TLl在T细胞共刺激和Thl极化中起作用。 在活化的T细胞上，TLlA经由其表面结合受体DR3特异性地起作用，以促进细胞存活和促 炎细胞因子的分泌。所分泌的诱饵受体3 (DcR3)(肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族的可溶 性蛋白)阻断 TLlA 的作用。Kim 等，“Identification of naturallysecreted soluble form of TL 1A, a TNF-Iike cytokine, “ J Immunol Methods，298 :1—8 (2005)。潜在的治疗靶标过敏反应和哮喘伴随由NKT细胞引起的升高的IgE水平和IL-13产量的CD4T细胞的Th2极化是过 敏反应和哮喘中肺部炎症的主要原因。TLlA在过敏性肺部炎症方面起主要作用(Fang等， J. Exp. Med. 2008)。TLlA共刺激NKT细胞中IL-4和IL-13产量。通过TLlA抗体或显性失 活TLlA突变体阻断TLlA和DR3的相互作用来消除肺部炎症。肺癌和结肠癌TNF及其受体超家族中的成员调节免疫应答并诱导凋亡。DR3优先由T淋巴细胞 表达，并在T细胞活化期间被上调。DR3的配体是TL1A。TLlA也结合诱饵受体DCR3/TR6，该诱饵受体在几种肺癌和结肠癌中表达，也在一些正常组织中表达。TLlA受促炎细胞因子 TNF和IL-I的正调节。TLlA是TLl的较长变体(也称为VEGI)。动脉粥样硬化另外，TL IA也已被报道是血管生成抑制性的(angiostatic)且诱导金属蛋白 酶和 IL-8 基因表达(Su 等，Exp. Cell Res.，312 :266_277 (2006) ；Kang 等，Cytokine, 29 229-235 (2005))。实际上，TLlA和DR3可能因增加促炎细胞因子和趋化因子的产量以及通 过诱导细胞外基质降解酶而降低斑块稳定性而与动脉粥样硬化的发病机制有关(Kang等， Cytokine,29 :229_235(2005))。风湿性关节炎也有证据表明TL1A/DR3与风湿性关节炎的病因有关(Bossen等，J. Biol. Chem.， 281 (20) 13964-13971(2006 年 5 月 19 日)。炎症性肠病研究者已发现TLlA的表达与炎症性肠病之间的关联(Prehn等，Clin. Immunol.， 112:66-77(2004) ；Bamias 等，J. Immunol, 171 4868-4874(2003)) Thl-介导的肠内疾病，例如克罗恩氏病克罗恩氏病是侵袭年轻成年人(20-30岁)的严重炎症性肠病。该病被认为是由 导致效应子(促炎性)和调节性T细胞应答的失衡的易感性遗传因素和环境因素引起的， 导致胃肠黏膜的炎症和疾病。TL1A/DR3通路在Thl-介导的肠内疾病(如克罗恩氏病)中起重要作用。 Konstantinos φ, The Journal of Immunology,2005,174 =4985-4990(2005) ；Bamias φ, J. Immunol, 171 =4868-74(2003)。因此，TL1A/DR3通路的阻断可为克罗恩氏病提供治疗机遇。TLlA通过抗⑶3和抗⑶28和IL-12/IL-18刺激的外周血(PB)T细胞来增加 IFN- Y产量。通过TLlA的DR3激活诱导形成包含TRADD、TRAF2和RIP的信号转导复合物， 并且激活NF-kB和ERK、JNK和p38促分裂原活化的蛋白激酶途径。Kang等，Cytokine，29 229-35(2005)。TLlA可被释放从而以同源三体的可溶形式循环。Wen等，〃 TL lA-induced NF-kappaB activation and c_IAP2production prevent DR3_mediated apoptosis in TF-I cells, “ J. Biol. Chem.，278 :39251-8(2003)。死亡受体及其配体在组织稳态的维持和程序性细胞死亡的生理学调节方面起着 关键作用。死亡配体的结合诱导受体的低聚化、经由保守的细胞质信号元件(被称为死亡 域)的衔接蛋白质的征集(recruitment)、胱天蛋白酶的活化和凋亡的诱导。Young等，Proc Natl. Acad. Sci. USA.，103(22) :8303_8304(2006 年 5 月 30 日)。虽然死亡受体(例如Fas/Apo-l/CD95、TNF-Rl、TRAIL-Rl、TRAIL-R2 或 DR3)最初 被描述为凋亡的诱导物，但越来越多的证据证明这些受体也具有非凋亡功能，包括适应性 免疫应答的调节。Bamias 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103 :8441_8446 (2006)报道称， TLlA由固有层树突细胞表达，并通过增加记忆细胞(而非天然CD4+T细胞)的增殖发挥作 用，且与IL-12和/或T细胞受体的低剂量刺激起协同作用以强烈增加IFN- γ基因表达。 肠中的INF-Y表达已被认为是炎症的标志，并且用于治疗克罗恩氏病的许多策略依赖于 对抑制免疫激活状态的大量尝试。但是，这些方法(类固醇治疗和免疫抑制药物)并不特定地针对肠，因此具有它们本身的并发症。基于使用TNF-α的拮抗物的靶向疗法在1990 年代被成功地提出，参考文件1中报道的结果显示，特异性地针对TLlA或其受体的疗法可 为这种虚弱疾病提供替代性的靶向疗法。如在Bamias 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，103 :8441_8446 (2006)中所报道的， 当在炎症期间在肠中表达时，TLlA似乎具有一种最深远的作用。虽然在自然杀伤细胞中也 观察到了增加的表达，但当与IL-12/18结合时，TLlA在诱导IFN- Y在人T细胞中的表达方 面起协同作用(Migone 等，Immunity.，16 :479_492 (2002) ；Papadakis 等，J. Immunol, 174 4985-4990(2005) ；Papadakis 等，J. Immunol，172 :7002_7007 (2004))。Bamias 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，103 =8441-8446(2006)是关于在克罗恩氏病的小鼠模型中观察到相 似结果的首次报道，并且通过显示出当T细胞受体被微弱刺激时或当用IL-12处理T细胞 时会发生协同作用而扩展了早期的数据。虽然在Bamias等中当将TLlA处理与IL-18结 合时未观察到协同作用，但这一结果并不意外，因为IL-18和TLlA通过NF-kB信号转导。 尽管Migone等关于TLlA的最初报道证实它是T细胞共刺激信号，但Bamias等证实它是 应答最强烈的记忆T细胞，这与这类T细胞群在表达IFN-γ方面增加的能力相适应。因 为该细胞群确实增殖，它也表达较高水平的TLlA受体，因此进一步提高细胞增殖和表达 IFN-Y的能力。鉴于仅知的TLlA的受体是DR3(—种含死亡域的受体)，并且可能已假定 触发该受体会导致细胞死亡，这个发现可能被认为有些意外。(TL1A经由DR3进行信号转 导，DR3是其仅知的细胞表面受体。TLlA也结合至可溶性诱饵受体(DcR3))。但是，NF-kB 依赖性抗凋亡基因(例如凋亡抑制剂2)已显示由TLlA诱导(Wen等，J. Biol. Chem.，278 39251-39258(2003))，因此凋亡的触发以及增殖可能是细胞类型依赖性的。克罗恩氏病的当前治疗方案包括抗TNF-α的单克隆抗体、英夫利西单 抗(infliximab) (Remi cade ； Centocor, Inc. , Horsham, ΡΑ)、单克隆抗体阿达木单抗 (Adalimumab)(商标Humira ；Abbott)以及抗发炎剂(例如，柳氮磺吡啶)、皮质酮或类固 醇(例如，泼尼松)、免疫系统抑制剂(例如，6-巯基嘌呤)和抗生素。但是，英夫利西单抗 是具有高度特异性的仅有的治疗方案；其余的治疗方案的特异性低。Proc Natl Acad Sci U. S. A.，103 (22) =8303-8304 (2006年5月30日)。这意味着治疗未靶向疾病区域。虽然英 夫利西单抗具有高特异性且通常具有良好的耐受性，但英夫利西单抗可导致肺结核感染的 复发以及心力衰竭的恶化、脱髓鞘病和增加的淋巴瘤的发生率。因此，在本领域中仍然需要可被用于各种炎症性和免疫疾病和病症的治疗和诊断 的组合物，例如过敏反应/哮喘、风湿性关节炎、多发性硬化、克罗恩氏病、炎症性肠病、慢 性阻塞性肺病、牛皮癣、I型糖尿病和移植排异反应。本发明涉及抗TLlA的单克隆抗体，其 可满足这种需要。

发明内容
本发明公开一种特异性地结合至TNF样细胞因子TL1A(参见GenBank登录号 AF520785)的抗原结合多肽分子。所述多肽包括人源化的重链可变区和人源化的轻链可变 区。例如，该多肽可包括人抗体的轻、重链可变区的构架区(framework region, FR)，同时 基本保持亲本单抗的抗原结合特异性。除互补决定区(CDR)之外，人源化的重链可变区和 /或人源化的轻链可变区至少约87%被人源化，至少约90%被人源化，至少约95%被人源化，至少约98%被人源化，或者至少约100%被人源化。所述抗原结合多肽分子可衍生自单 抗供体(例如，小鼠单抗供体)且可包括来自单抗的CDR(例如，小鼠单克隆CDR)。该多肽 可起TLlA受体拮抗剂作用。本发明还包括包含本发明的多肽的药物组合物、制造这种多肽和组合物的方法以 及治疗需要本发明的组合物的对象的方法。可使用本发明的组合物治疗的示例性病症包括 但不限于自身免疫性疾病(例如狼疮)、炎症性肠病(IBD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、关节 炎(例如风湿性关节炎)、多发性硬化、移植排异反应、中枢神经系统损伤、Thl介导的肠内 疾病(例如克罗恩氏病)、牛皮癣、白血病或淋巴瘤(例如，慢性淋巴细胞白血病(CLL))、动 脉粥样硬化、肺癌和结肠癌。在一些实施方式中，所述抗原结合多肽特异性地结合至TLlA并且包括(a)人 源化抗体重链可变区，该重链可变区包含(1)包含氨基酸序列({L，S，N}Y{G, A}MN)的 CDR-Hl ； (2)包含氨基酸序列(WINT{Y，N}TG{Ε, N}PTYA{D, Q} {D, G}F{K, T}G)的 CDR-H2 和(3)包含氨基酸序列(D{T，Y} {A, G} {Μ, K} {D，Y} {Y，G} {A, D} {M，Y} {A, Y} {Y，A}MDY)的 CDR-H3 ；和(b)人源化抗体轻链可变区，该轻链可变区包含(1)包含氨基酸序列({K，R} SSQ {N，S} {I, L} V {H, Y} S {D, N} GNTYL {E, N, D})的 CDR-Ll ； (2)包含氨基酸序列(KVSNR{F，D} S)的 CDR-L2 和(3)包含氨基酸序列({F，M}QG{S，T}H{V，-} {P,-} {L，-} {Τ,-})的 CDR-L3。在某些实施方式中，所述抗原结合多肽特异性地结合至TLlA并且包括人源 化抗体重链可变区，该重链可变区包含(1)⑶R-H1，所述⑶R-Hl包含下述氨基酸序列、 基本上由下述氨基酸序列组成或由下述氨基酸序列组成TSNMGVV ;(2)CDR-H2，所述 CDR-H2包含下述氨基酸序列、基本上由下述氨基酸序列组成或由下述氨基酸序列组成 HILffDDREYSNPALKS ；和(3) CDR-H3，所述CDR-H3包含下述氨基酸序列、基本上由下述氨基酸 序列组成或由下述氨基酸序列组成MSRNYYGSSYVMDY。在一些实施方式中，所述抗原结合多肽包含人源化抗体重链可变区，所述重链可 变区包含下述氨基酸序列、基本上由下述氨基酸序列组成或由下述氨基酸序列组成QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSNMGVVfflRQPPGKALEffLAHILffDDREYSNPALKSRL TISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARMSRNYYGSSYVMDYWGQGTLVTVSS。在所述多肽的一些实施方式中，(I)CDR-Hl由氨基酸序列(LYGMN)或(NYGMN) 构成；(2) CDR-H2由氨基酸序列(WINTYTGEPTYADDFKG)构成；(3) CDR-H3由氨基酸序列 (DTAMDYAMAY)或 DYGKYGDYYAMDY 构成；(4)CDR-Ll 由氨基酸序列(KSSQNIVHSDGNTYLE)或 (RSSQSIVHSNGNTYLD)构成；(5)CDR_L2 由氨基酸序列(KVSNRFS)构成；并且(6)CDR_L3 由氨 基酸序列(FQGSHVPLT)构成。在一些实施方式中，所述多肽包含以下人源化抗体重链可变区(Q{V，1} QLVQSG{S, P}ELKKPG{Α, Ε} {S, Τ}VK{V, 1}SCKASGYTFT{L, S, N} YlG, A}MNffV{R, K}QAPG{Q, K}GL{Ε, KlffMGffINTlY, N}TG{Ε, N}PTYA{P, Ql{P, GlF{K, TlGRF{V, A}FSL{D, Ε}TS{V, A} STAYLQI {S，N} {S, Τ} LK {A, N} ED {Τ, Μ} A {V, Τ} Y {Y, F} CARD {Τ, Y} {A, G} {Μ, K} {D, Y} {Y, G} {Α, D} {Μ, Y} {Α, Y} {Y，A}MDY) WGQGT{L, SjVTVSS)。例如，所述多肽可包含以下人源化抗体重链 可变区(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTLYGMNffVRQAPGQGLEWMGfflNTYTGEPTYADDFKGRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDTAMDYAMAYffGQGTLVTVSS)或
(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTLYGMNWVKQAPGKGLKWMGWINTYTGEPTYADDFKGRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDTAMDYAMAYWGQGTLVTVSS)。可选地，所述多肽可包含以下人源化抗体重链可变区(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNffVRQAPGQGLEWMGfflNTYTGEPTYADDFKGRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDYGKYGDYYAMDYffGQGTLVTVSSS)或(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNffVRQAPGKGLKWMGfflNTYTGEPTYADDFKGRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDYGKYGDYYAMDYffGQGTLVTVSS)。在一些实施方式中，所述多肽包含以下人源化抗体轻链可变区(DVVMTQ{T，S} PLSLPV{Τ, S} {P, L}G{E, D, Q} {P, Q} ASISC{K, RiSSQIN, Si U, L iViH, Yi SDGNTYL IE, Ni W{Y, F} {L, Q}Q{K, R} PGQSP {Q, K, R} {L, V, Ri LIYKVSNRiF, Di SGVPDRFSGSGSGTDFTLKI IS, N} RVEAED{L, V}GVY{Y, FlC{F, MlQG{S, TlHiV, ~1 {P, ~1 {L, ~1 {T, ~1 {F, ff}G{G, S, Q}GTK{V, L} EIKR)。例如，所述多肽可包含以下人源化抗体轻链可变区 (DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIKR)或(DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIKR)。在另一个实施方式中，所述多肽可包 含以下人源化抗体轻链可变区(DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKVEIKR)。本发明还公开人源化抗体重链可变区。所述人源化抗体重链可变区可包含(1) 包含氨基酸序列({L，S，N}Y{G，A}MN)的CDR-Hl ； (2)包含氨基酸序列(WINT {Y，N} TG {E，N} PTYA {D，Q} {D，G}F{K，T}G)的 CDR-H2 ；禾口 (3)包含氨基酸序列(DTAMDYAMAY)的 CDR-H3。例 如，所述人源化抗体重链可变区可包含以下氨基酸序列(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTLYGMNffVRQAPGQGLEWMGfflNTYTGEPTYADDFKGRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDTAMDYAMAYffGQGTLVTVSS)。可选地，所述多肽可包含以下 人源化抗体重链可变区(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTLYGMNffVKQAPGKGLKWMGfflNTYTGEPTYADDFKGRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDTAMDYAMAYffGQGTLVTVSS)。在另一个实施方式中，人源化抗体重链可变区包含(1)包含氨基酸序列(NYGMN) 的CDR-Hl ； (2)包含氨基酸序列(WINTYTGEPTYADDFKG)的CDR-H2 ；和(3)包含氨基酸序列 (DYGKYGDYYAMDY)的CDR-H3。例如，该人源化抗体重链可变区可包含以下氨基酸序列(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNffVRQAPGQGLEWMGfflNTYTGEPTYADDFKGRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDYGKYGDYYAMDYWGQGTLVTVSS)。可选地，所述多肽可包含 以下序列的人源化抗体重链可变区(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNffVKQAPGKGLKWMGfflNTYTGEPTYADDFKGRF VFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDYGKYGDYYAMDYWGQGTLVTVSS)。在另一个实施方式中，人源化抗体重链可变区包含(1)包含氨基酸序列(NYAMS) 的CDR-Hl ； (2)包含氨基酸序列(TIYSGGGYTFYLDSLKG)的CDR-H2 ；和(3)包含氨基酸序列 (HSYPMTTVITYAPYYFYY)的CDR-H3。例如，所述人源化抗体重链可变区可包含以下氨基酸序列(QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYAMSWVKQAPGKGLKWMGTIYSGGGYTFYLDSLKGRF VFSLDTSVSTAYLQSSLKAEDTAVYFCARHSYPMTTVITYAPYYFYYWGQGTLVTVSS)。本发明还公开人源化抗体轻链可变区。所述人源化抗体轻链可变区可包含.(1) 包含氨基酸序列({K，R} SSQ {N，S} {I，L} V {H，Y} S {D，N} GNTYL {E，N，D})的 CDR-Ll ； (2)包含 氨基酸序列(KVSNR{F，D}S)的 CDR-L2 ；和(3)包含氨基酸序列({F，M}QG{S，T}H{V，-} {P,-} {L，-} {Τ, -})的 CDR-L3。在其他实施方式中，抗原结合多肽特异性的结合至TLlA并且包括人源化抗体轻 链可变区，所述轻链可变区包含(1)⑶R-L1，所述⑶R-Ll包含下述氨基酸序列、基本上由 下述氨基酸序列组成或由下述氨基酸序列组成SASSSVNYMH ； (2)⑶R-L2，所述⑶R-L2包 含下述氨基酸序列、基本上由下述氨基酸序列组成或由下述氨基酸序列组成STSNLAS ；和 (3)CDR-L3，所述CDR-L3包含下述氨基酸序列、基本上由下述氨基酸序列组成或由下述氨 基酸序列组成HQWNNYGT。在一些实施方式中，抗原结合多肽包含人源化抗体轻链可变区，所述轻链可变区 包含下述氨基酸序列、基本上由下述氨基酸序列组成或由下述氨基酸序列组成DIQLTQSPSFLSASV⑶RVTTTCSASSSVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTE FTLTISSLQPEDFATYYCHQffNNYGTFGQGTKVEIKR。例如，人源化抗体轻链可变区可包含以下氨基酸序列DVVMTQSPLSLPVTLGQPASIS CKSSQNIVHSDGNTYLEffFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVP LTFGGGTKVEIKR)。在另一个实施方式中，所述多肽可包含以下序列的人源化抗体轻链可变 区(DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKVEIKR)。可选地，所述多肽可包含以下序列的 人源化抗体轻链可变区 DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffYLQKPGQSPQLLIYKVS NRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIKR，或DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSG SGSGTDFTLKINRVEAEDVGVYFCFQGSHVPLTFGGGTKLEIKRo人源化抗体轻链可变区还可包含(1)包含氨基酸序列(RSSQSIVHSNGNTYLD)的 CDR-Ll ； (2)包含氨基酸序列(KVSNRFS)的CDR-L2 ；和(3)包含氨基酸序列(FQGSHVPLT)的 CDR-L3。例如，人源化抗体轻链可变区可包含以下氨基酸序列(DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLDffFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIKRo 可选地，所述多肽可包含以下序列的 人源化抗体轻链可变区(DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCRSSQSIVHSNGNTYLDffFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKVEIKR))。在另一个实施方式中，人源化抗体轻链可变区包含⑴包含氨基酸序列 (RSSQSIVHSNGNTYLD)的 CDR-L 1 ； (2)包含氨基酸序列(KVSNRFS)的 CDR-L2 ；和(3)包含氨 基酸序列(FQGSHVPLT)的⑶R-L3。例如，人源化抗体轻链可变区可包含以下氨基酸序列(DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCRSSQSIVHSNGNTYLDffYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIKR))，或(DWMTQTPLSLPVSL ⑶ QASISCRSSQSIVHSNGNTYLDWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFS GSGSGTDFTLKINRVEAEDLGVYFCFQGSHVPLTFGGGTKLEIKR))。前述人源化重链和人源化轻链可存在于特异性地结合至TLlA的抗原结合多肽中。抗原结合多肽可选自抗体分子、Fab片段、Fab，片段、F(ab' )2片段和scFv分子。 在一些实施方式中，所述多肽是抗体分子。抗体分子可包括嵌合抗体，该嵌合抗体包括人重 链恒定区和人轻链恒定区。例如，当多肽包括IgG分子的重链恒定区和轻链恒定区时，抗体 分子可为IgG分子(例如，IgGl或IgG4分子)。多肽可为scFv分子。例如，scFv的分子式 可选自NH2-L-VH-X-VK-C00H和NH2-L-VK-X-VH-C00H ；其中L是前导序列；VH是人源化抗体 重链可变区；X是连接多肽；并且VK是人源化抗体轻链可变区。所述多肽可为Fab HSA融合 分子。例如，Fab HSA融合物的分子式选自结合有NH2-VK-CK-CooH的NH2-VH-CH1-HSA-C00H ； 其中VH-CHl-HSA是人源化抗体重链可变区(VH)和人重链恒定区1 (CHl)与人血清白蛋白 (HSA)形成的融合蛋白，该融合蛋白随后与其同源的人源化抗体轻链可变区(VK)和人κ恒 定区(CK)混合(fold)以形成Fab HSA融合蛋白。抗原结合多肽还可共轭或融合至治疗试剂或诊断试剂。例如，治疗试剂可选自细 胞毒素试剂、放射性标记、免疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光敏治疗剂或它们的组合。诊断 试剂的例子可包括放射性标记、光敏诊断剂、超声增强剂或非放射性标记。抗原结合多肽可为TLlA的拮抗剂。通常，所述多肽不是TLlA的激动剂。抗原结合多肽以特异性和高亲和性结合至TLlA受体。通常，所述多肽以至少约 IO6M4 (优选至少约lOl1，更优选至少约108Μ_\更优选至少约10 的亲和常数结合至 TLlA0本发明还公开了包含前述抗原结合多肽以及载体(例如，稀释剂或赋形剂)的药 物组合物。所述药物组合物可进一步包含额外的如本文所公开的治疗试剂或诊断试剂。本发明还公开了治疗或诊断疾病或病症的方法，所述方法包括给有需要的患者服 用所公开的药物组合物。例如，药物组合物可被服用以治疗或诊断炎症性的、免疫性的和/ 或癌症的疾病或病症。疾病和病症的例子可包括自身免疫疾病(例如，狼疮)、炎症性肠病 (IBD)、慢性阻塞性肺病(C0PD)、关节炎(例如，风湿性关节炎)、多发性硬化、移植排异反 应、中枢神经系统损伤、克罗恩氏病、牛皮癣、I型糖尿病、肺癌和结肠癌、以及白血病或淋巴 瘤(例如，慢性淋巴细胞白血病(CLL))。本发明还公开了编码前述多肽的多核苷酸。该多核苷酸可被可操作地连接至用于 在适当宿主细胞中表达所编码的多肽的启动子。这样，生产由重组多核苷酸编码的多肽的 方法包括a)培养用重组多核苷酸转化的细胞以表达所编码的多肽；和b)回收以这种方式 表达的多肽。之前的一般性描述以及以下


和详细描述都是示例性和说明性的，并且旨 在提供对所要求保护的发明的进一步解释。从以下本发明的详细描述，本领域技术人员可 容易看出本发明的其他目的、优点和新的特征。

图1图示小鼠和仓鼠抗TLlA抗体对在TF-I细胞上的人TLlA (huTLlA)-诱导的胱天蛋白酶活性的抑制。Ab#l-19E06 ；Ab#2-12D01 ；Ab#3-15E09 ；Ab#4-16H02 ；Ab#5_14A03 ； Ab#6-04H08A ；Ab#7-12F11 ；Ab#8_12D08。图2图示小鼠抗TLlA 16H02的VH区与最接近的人类种系基因IGHV7-4-1-02的 比对。比对被用作模板以产生人源化的16H02VH的两种不同版本，在图中被标记为新人 16H02VH#1 和新人 16H02VH#2。图3图示两种不同版本的人源化抗TLlA VH的小鼠与人之间的突变的数目以及人 源化百分率。图4图示小鼠抗TLlA 16H02的VK区与最接近的人类种系基因A17的比对。该比 对被用作模板以产生人源化的16H02VH的两种不同版本，在图中被标记为新人16H02VK#1 和新人 16H02VH#2。图5图示两种不同版本的人源化抗TLlA 16H02VK的小鼠与人的突变的数目以及 人源化百分率。图6图示用人16H02抗TLlA VH#1和VH#2和人16H02 VH#1和VK#2瞬时转染293F 细胞以产生全长人源化抗体分子的结果。图7通过显示与小鼠抗TLlA抗体对照相比人源化抗体对TF-I细胞中TLlA诱导的 胱天蛋白酶活性的抑制而图示了一轮人源化过程后16H02 TLlA单克隆抗体的活性。12D01 =小鼠抗TLlA阴性对照；16H02 =小鼠抗TLlA阳性对照；19E06 =仓鼠抗TLlA对照；3009 =人源化的抗TLlA 16H02VH#1+VK#1 ；3010 =人源化的抗 TLlA 16H02 VH#2+VK#1 ；3011 =人源化的抗 TLlA 16H02 VH#1+VK#2 ;3012 =人源化的抗 TLlA 16H02 VH#2+VK#2。图8图示16H02 VK构架的完全人源化所需要的最终突变。为产生完全人源化的 16H02轻链，将新人16H02 VK#2(见图4)起始序列与A17种系序列比对，3个独特的区域或 区段被标记出来(实心圆圈)用于进一步的诱变。构建了合成的轻链，该轻链含有在这3 个区域或区段的每一个内的非突变的野生型VK#2序列( = W)或A17人类种系序列( = M) 的所有可能的组合。图9图示最终版本的人源化的16H02VK的瞬时转染ID和LDC#。生成了合成的轻 链，该轻链含有图8的新人16H02 VK#2的3个独特区域或区段内的野生型(W)或突变(M) 序列的所有可能的组合。随后用图2的新人16H02VH#1共转染合成的轻链，所产生的抗体 被用于测试对huTLlA诱导的胱天蛋白酶活性的抑制。图10图示图9的一组不同人源化抗TLlA抗体对TF-I细胞上人TLlA(huTLlA)诱 导的胱天蛋白酶活性的抑制。被标记为3038的完全人源化的16H02TL1A抗体的活性被与 原始小鼠抗TLlA抗体16H02的活性比较。图11图示五种首要(lead)候选小鼠抗TLlA抗体的VH区的序列比对1B4、25B9、 11D8、27A8 和 38D6。图12图示五种首要候选小鼠抗TLlA抗体的VK区的序列比对1B4、25B9、11D8、 27A8 和 38D6。图13图示人源化的1B4VH区(人1B4VH AA)与原始小鼠VH区(1B4VHAA)和最接 近匹配的人类种系VH区(VH2-70-10)的序列比对。图14图示人源化的1B4VK区(人1B4VK AA)与原始小鼠VK区(1B4VKAA)和最接近匹配的人类种系VK区(VK-L8)的序列比对。图15图示与小鼠11D8抗体相比，人源化的TLlA抗体(1B4、11D8、25B9)对哺乳动 物来源的TLlA诱导的胱天蛋白酶活性的抑制。
具体实施例方式定义如本文所描述的，抗体是指全长(即，天然的或由通常的免疫球蛋白基因片段重 组过程形成的)免疫球蛋白分子(例如，IgG抗体)或免疫球蛋白分子的免疫学活性(即， 特异性结合)部分，例如抗体片段。抗体片段是抗体的一部分，例如F(ab' )2、F(ab)2、Fab'、Fab、Fv、scFv等。无论 结构如何，抗体片段与完整抗体所识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”包括适配体、镜 像体(speigelmer)和双抗体。术语“抗体片段”还包括通过结合至特异性抗原形成复合物 而像抗体一样的合成的或基因工程化的蛋白质。例如，抗体片段包括由可变区构成的分离 的片段，例如由重链可变区和轻链可变区构成的“Fv”片段；重组单链多肽分子，其中轻链 可变区和重链可变区通过肽接头(“scFv蛋白”)连接；Fab HSA融合多肽，其中VH-CHl与 HSA被生产为融合蛋白，该融合蛋白随后与其同源的VK-CK轻链混合以形成Fab ；以及由类 似高变区的氨基酸残基构成的最小识别单元。人源化抗体是一种重组蛋白，其中来自一个物种的抗体(例如，啮齿动物抗体)的 CDR被从啮齿动物抗体的重链可变区和轻链可变区转移至人重链可变区和轻链可变区，或 转移至已被诱变成包括至少一部分的人重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列的重链可 变区和轻链可变区(被表示为“人源化百分率”)。抗体分子的恒定区可来源于人抗体的恒 定区。如本文所使用的，“人源化百分率”是通过以下方法计算的确定人源化区域和种 系区域之间的构架氨基酸差异(即，非CDR差异)的数目，从氨基酸的总数中减去该数目， 再除以氨基酸的总数并乘以100。如本文所使用的，“CDR”是指存在于抗体重链的可变区(VH)或抗体轻链的可变区 (VL或VK)的“互补决定区”。每个可变区包括三个⑶R，对于存在于重链可变区的⑶R，它们 被命名为⑶R-H1、⑶R-H2和⑶R-H3，对于存在于轻链可变区的⑶R，它们被命名为⑶R-L1、 CDR-L2和CDR-L3。本文使用了 Kabat编号系统。这样，CDR-Hl开始于约氨基酸31 (即， 第一个半胱氨酸残基后约9个残基)，包括约5-7个氨基酸，并结束于下一个色氨酸残基。 ⑶R-H2开始于⑶R-Hl结束后的第十五个残基，包括约16-19个氨基酸，并结束于下一个精 氨酸或赖氨酸残基。CDR-H3开始于CDR-H2结束后的约第三十三个氨基酸残基，包括3_25 个氨基酸，并以W-G-X-G结束，其中X是任何氨基酸。CDR-Ll开始于约残基24 (即，在半胱 氨酸残基之后)，包括约10-17个残基，并结束于下一个色氨酸残基。⑶R-L2开始于⑶R-Ll 结束后的约第十六个残基，并包括约7个残基。CDR-L3开始于CDR-L2结束后的约第三十三 个残基(即，在半胱氨酸之后)，包括约7-11个残基，并以序列F或W-G-X-G结束，其中X是 任何氨基酸。共轭至治疗试剂或诊断试剂本文公开的抗原结合多肽可被共轭或融合至治疗试剂，所述治疗试剂可包括放射性标记、免疫调节剂、激素、光敏治疗剂、细胞毒素试剂(可为药物或毒素)和它们的组合。 药物可包括具有药物性质的那些药物，药物可选自抗有丝分裂剂、抗激酶剂、烷基化剂、抗 代谢剂、抗菌剂、生物碱、抗血管生成剂、凋亡剂和它们的组合。更具体地，这些药物选自氮 芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲、三氮烯、叶酸类似物、C0X-2抑制剂、嘧啶类似 物、嘌呤类似物、抗生素、酶、表鬼白毒素、钼类金属配位复合物、长春碱类、取代脲、甲基胼 衍生物、肾上腺皮质激素抑制剂、拮抗剂、内皮抑素、紫杉醇、喜树碱、蒽环类、紫杉烷、它们 的类似物和它们的组合。本发明的毒素可选自蓖麻毒素、相思豆毒素、α毒素、肥皂草毒蛋 白、核糖核酸酶(RNase)，例如抗肿瘤核糖核酸酶(onconase)、DNaseI、葡萄球菌肠毒素Α、 美洲商陆抗病毒蛋白、多花白树毒蛋白、白喉毒素、假单胞菌外毒素和假单胞菌内毒素。免疫调节剂可选自细胞因子、干细胞生长因子、淋巴毒素、造血因子、集落刺激因 子(CSF)、干扰素(IFN)、促红细胞生成素、血小板生成素和它们的组合。特别有用的是淋巴 毒素(例如肿瘤坏死因子(TNF))、造血因子(例如白介素(IL))、集落刺激因子(例如粒细 胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF))、干扰素(例如干扰 素_ α、干扰素_ β或干扰素_ Y )和干细胞生长因子(例如所命名的“Si因子”)。更具体地， 免疫调节剂可包括 IL-I、IL-2、IL-3、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18、IL-21、干扰素-y TNF- α 或它们的组合。本文公开的抗原结合多肽可被共轭或融合至诊断试剂。诊断试剂可包括光敏诊断 剂或能量为60至4000keV的放射性标记，或非放射性标记。放射性标记优选为Y射同位 素、β发射同位素和正电子发射同位素，且选自125I、131I、123I、124I、86y、186Re、188Re、62CU、64CU、 mid^Ga^TdCF^C^N^O^Br和它们的组合。诊断试剂可包括造影剂，例如 猛、铁或利用杂交瘤技术制造抗TLlA抗体的示例性方法BALB/c小鼠可用重组TLlA蛋白(细胞外结构域)免疫。在通常的程序中，皮下注 射在50ml的弗氏完全佐剂(Sigma)中的IOmg蛋白。可给予两至四次额外的注射(使用在 弗氏不完全佐剂中的蛋白)，注射每隔2周进行一次，随后为最终的加强免疫(使用在PBS 中的蛋白)。可选地，可在脚肉垫中给予注射。三天后可处死小鼠，可收集它们的脾或胭淋 巴结，并可分离淋巴细胞用于融合。可利用PEG/DMSO(Sigma)作为融合剂以5 1的比率 将淋巴细胞与P3X63Ag8. 653浆细胞瘤细胞融合。融合后，细胞可被重悬在选择性HAT培养 基中并以IO6个细胞/孔接种于96孔平板中。经受住HAT选择的杂交瘤的上清液可通过 直接结合ELISA来筛选，以确定TLlA结合抗体的存在。可识别出分泌TLlA结合抗体的杂 交瘤，并且它们的上清液可通过抑制结合ELISA而被进一步筛选，以筛选出抑制TLlA结合 至其受体DR3的抗体。被识别为对TLlA结合的抑制呈阳性的杂交瘤随后可被筛选，筛选对 象为在TF-I细胞中的TLlA诱导的胱天蛋白酶活性的抑制，以识别出TLlA拮抗克隆。示例性抗体人源化策略人源化抗TLlA抗体的一个目的在于获得保留90%至100 %的原始结合亲和性和 特异性的70%至100%的人源化的VH区和VK区。VH和VK的单个高风险位置的位点定向 诱变可被用来进一步人源化抗体，同时维持结合亲和性和特异性。人源化可通过⑶R移植和基于结构的分析以及可变区表面再造(resurfacing) 而进行。(参见 Jones 等，NATURE (1986) 5 月 29 日-6 月 4 ；321 (6069) :522_5 ； Roguska等，PROTEIN ENGINEERING,1996,9(10) :895_904 ；和 Studnicka 等，Humanizing Mouse Antibody Frameworks While Preserving3-D Structure. PROTEIN ENGINEERING,1994,H 7卷，第805页。)抗体一级序列和3-D结构数据可被用来识别维持结合亲和性和特异性所 需的关键构架残基。由NCBI赞助的“Blast for Ig sequences”网站可被用来识别与用在 本研究中的小鼠VH区和VK区的最接近匹配。人类种系VH基因和VK基因可被选择作为与 小鼠VH序列和VK序列的最佳匹配。可选地，来自天然表达的人抗体谱的序列可被单独用 作或与最接近匹配的人类种系基因一起用作人源化的模板。将小鼠抗TLlA VH和VK与最接近的人类种系或表达的基因谱 (expressed!·印ertoire of gene)的比对后，在每个位置的氨基酸都可被评价对结合和免 疫原性的潜在影响。该信息可被用来为每个位置的突变分配低、中等或高危值。在一个实 施方式中，只有低和中等危险位置被突变，而避免突变高危位置。如果需要，可通过在VH、 VK或两者的CDR的每个位置加入酪氨酸配对而进行亲和性成熟策略。来自杂夺瘤细胞』系的鼠禾斗云M勿杭TLlA VH K和VK K的劍列t牛克降和测丨序杂交瘤细胞可被富集、用PBS洗涤3次，并根据生产商实验方案利用Trizol试 剂(Invitrogen，目录号15596-026)提取RNA。可根据生产商实验方案利用5' RACE试剂 盒(Rapid Amplification of cDNA Ends, Invitrogen,目录号 18374-058)将总 RNA 转换 为cDNA。简言之，RNA可被连接至随机六聚体引物(Random N6)，并且第一链cDNA可利用 superscript II RNAase H阴性逆转录酶来产生。可利用与该试剂盒一起提供的GlassMax 自旋筒(spin cartridge)纯化cDNA，并且将cDNA与TdT (末端脱氧核糖核酸转移酶)在 存在dCTP的情况下反应以在5，端将C碱基对添加至cDNA。带dC尾巴的cDNA可利用对 dC尾巴特异的锚定引物以及基因特异引物而被PCR扩增，所述基因特异引物杂交至小鼠的 VH重链恒定区(CHl)和VK恒定κ区(CK)中的高度保守的DNA序列。所产生的PCR产 物可通过凝胶电泳分析对应于完整VH或VK区的正确尺寸，随后根据生产商实验方案纯化 和连接进Τ0Ρ0 TA载体(Invitrogen目录号K4575-01)中。转化进细菌后，DNA可从含有 正确尺寸插入物的克隆中制备，DNA序列可利用Big Dye终止剂测序反应混合器(Applied Biosystems，部件号4336699)和3700ABI/Prism DNA分析仪根据生产商实验方案来测定。示例性人源化鼠科动物抗TLlA抗体鼠科动物抗TLlA抗体可基于如上所产生的结合数据和序列数据而被识别。可利 用当前可获得的公共数据库(即，NCBI的IgG的Blast以及MRC的V-base)将这些抗体的 VH区和VK区的氨基酸序列与人类种系VH区和VK区比对。在构架中，在小鼠序列与人类种 系不同的那些位置处，迭代过程可被用来转换或突变小鼠构架，因而小鼠构架匹配相应的 人类种系构架。另外或可选地，VH和VK的某些CDR氨基酸残基可通过用酪氨酸(即，亲和 性成熟的酪氨酸)替换而被突变，从而潜在地帮助弥补因构建残基变化导致亲和性的任何 损失。亲和性成熟的且人源化的小鼠VH区和VK区可利用一组重叠的合成DNA寡核苷酸通 过聚合酶链反应过程产生。作为合成基因设计过程的一部分，可使用密码子优化策略，就是 说哺乳动物细胞为基因表达而优先使用的每个氨基酸的三联密码子可被加入在每个位置。 合成的VH区和VK区可被克隆进专门的哺乳动物表达载体中，该表达载体允许相应的区在 完全是人的IgGl、G4或κ抗体骨架(antibody backbone)中表达。人源化抗体的小规模 生产可通过以下方法实现按照生产商实验方案，利用脂质转染胺(Invitrogen)将IgGl或G4构建体与κ构建体共转染进239F细胞中。来自瞬时转染的上清液可通过蛋白质A或G 树脂，IgG可被纯化至同质以用于基于细胞的分析中测试。以下实施例用来说明本发明。但应当理解，本发明不限于这些实施例中描述的特 定条件或细节。本文描述的所有公布文献和/或公众可获得的文件都通过引用明确合并至 本文中。实施例1如本文所述制备的小鼠和仓鼠抗TLlA单克隆抗体的VH和VK区的氨基酸序列如 下所示。可变区的CDR区域以下划线表示。12D08VK DVLMTQTPLS LPVSL⑶QAS ISCRSSQSIV HSNGNTYLDff YLQKPGQSPN LLIYKVSNRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP LTFGAGTKLE LKR16H02VK DVLMTQTPLS LPVSL⑶QAS ISCKSSQNIV HSDGNTYLEff YLQKPGQSPK LLIYKVSNRFSGVPDRFSGS GSGTDFTLKI SRVEAEDLGV YYCFQGSHVP LTFGSGTKLE IKR15E09VK ETTVTQSPAS LSMAIGEKVT IRCITSTDID DDMNWYQQKP GEPPKLLISE GNTLRPGVPSRFSSSGYGTD FVFTIEWLS EDVADYYCLQ SDNLPLTFGA GTKLELKR19E06VK DIVMTQSPSS LAVSTGGTVT LTCLSSQSLF SSDTNKNYLN WYLQKPGQSP KLLVYHASTRLTGVPDRFIG SGSGTDFTLT INSVQAEDLG DYYCQQHFRP PFTFGRGTKL EIKRIB4VK AAQIVLTQSPAIMSASLGAEITLTCSASSSVNYMHWYQQRSGTSPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTFYSLTISSVEAEDAADYYCHQffNNYGTFGGGTKLEIKR25B9VK AAENVLTQSPAILAASLGQKVTMTCSASSSVSSGYLHWYQQKSGASPKPLIHRTSNLASGVPPRFSGSGSGTSYSLSISSYEAEDDATYYCQQffSGFPFTFGSGTKLEIKR27A8VK AADIVLTQSPASLTVSLGQRATISCRASQNVSTSSYSHMHWSQQKPGQPPKLLIKYASNLDSGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDIATYYCQHSffEIPYTFGGGTKLEIKR11D8VK AADIVMTQSPASLTVSLGQRATISCRASQSVSTSSYSHMHWYQQKPGQPPKLLIRYASNLESGVPARFSGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTAIYYCQHSffELPYTFGGGTKLEIKR38D6VK AADIVLTQFPASLPVSLGQRATISCRASQSVSTSSYSHMHWYQQKPGQPPKLLITYASNLDSGVPARISGSGSGTDFTLNIHPVEEEDTATYYCHHSffELPYTFGGGTKLEIKR12D08VH QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT NYGMNWVKQA PGKGLKWMGff INTYTGEPTYADDFKGRFAF SLETSASTAY LQINNLKNED MATYFCAKDY GKYGDYYAMD YffGQGTSVTVSS
16H02VH QIQLVQSGPE LKKPGETVKI SCKASGYTFT LYGMNWVKQA PGKGLKWMGff INTYTGEPTYADDFKGRFAF SLETSASTAY LQINTLKNED MATYFCARDT AMDYAMAYffG QGTSVTVSS15E09VH EVKLVDSGGG LVQPGDSLRL SCATSGFTFS DFYMEffVRQP PGKRLEffIAA SGNKANDYTTEYSASVKGRF IVSRDTSQSI LYLQMNDLRA EDTAIYYCVR DAGYGYffYFD VffGAGTTVTVSS19E06VH QIQLQESGPS LVKPSQSLSL TCSVTGYSIT SDSYffNWIRQ FPGKNLVWMG YISYRGSTNYNPSLKSRISI TRDTSRNQFF LQLNSVTTED TATYYCARYS GYSFffYFDFff GQGTQVTVSS1B4VHa. QVTLKESGPGILQPSQTLSLTCSFSGFSLTTSNMGVVfflRQPSGKGLEffLLHILffDDREYSNPALKSRLTISKDPFNNQVFLKIANVDTADTATYYCARMSRNYYGSSYVMDYffGQGTSVTVSS25B9VHEVQLQQSGPELVKPGASVKMSCKASGYTFTSYVMHWVKQKTGQGLEfflGYINSNNDGTKYNEKFKGKATLTSDKSSSTAYMELSSLTSEDSAVYYCATGDYYGGTSYffYFDVffGAGTTVTVSS11D8VHEVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYNMNVKQSNGKSLEfflGNIDPYFGDTNNYNQNFKGRATLTVDKSSNTAYMQLMSLTSEDSAVYYCAREGAARAKNYFDYffGQGTTLTVSS27A8VHEVQLQQSGPELETPGASVKISCKASGYSFTGYNMNVVKQTNGKSLEfflGNIDPYFGDANYNRKFKGKATLTVDKSSSTAYMQLRSLTSEDSAVYYCAKEGAARAKNYFDYffGQGTTLTVSS38D6VH AAEVQLQQSGPELEKPGASVKISCKASGYSFTGYNMNVVRQTNGKSLEfflGHIDPYYGDATYRQKFKGKATLTVDKSSNTAYMQLKSLTSEDSAVYFCAREGAARARNYFDYffGQGTTLTVSS实施例2本实施例描述了测量TF-I细胞上TLlA诱导的胱天蛋白酶活性的抑制的分析方案。为测定抗TLlA抗体的中和活性，测定了它们对在TF-I细胞中的TLlA诱导的胱天 蛋白酶活性的作用。见图1。在含有胎牛血清的RPMI培养基中，在带透明底的黑色96 孔平板中，以75000个细胞/孔接种TF-I细胞。在不存在或存在各种浓度的小鼠或仓鼠亲 本TLlA抗体的情况下，在37°C用10yg/mL环己酰胺和100ng/mL TLlA处理细胞6小时。 通过Apo-One均质胱天蛋白酶-3/7分析试剂盒(Promega)测量胱天蛋白酶活性。含有胱 天蛋白酶底物(Z-DEVD-Rhodamine)的等体积的Ap0-One均质胱天蛋白酶_3/7分析缓冲液 被添加至每个含有细胞的孔中。温育过夜后，通过具有485nm的激发滤片和535nm的发射 滤片的Wallac Victor2荧光分析仪来测量荧光。图1所示的结果显示，与胱天蛋白酶活性相关联的荧光水平随着四种(4)不同抗 TLlA 抗体的浓度的增加而降低Ab#l-19E06 ；Ab#3-15E09 ；Ab#4-16H02 ；和 Ab#8_12D08。对于本领域技术人员明显的是，可对本发明的方法和组合物作出各种修改和改变而不违背本发明的精神或范围。因此，如果这些修改或改变属于所附权利要求的范围内，本 发明意在涵盖本发明的这些修改和改变以及它们的等同物。
权利要求
一种特异性结合至TL1A的分离的抗原结合多肽，所述多肽包含(a)人源化抗体重链可变区，所述重链可变区包含(1)包含氨基酸序列({L，S，N}Y{G，A}MN)的CDR H1；(2)包含氨基酸序列(WINT{Y，N}TG{E，N}PTYA{D，Q}{D，G}F{K，T}G)的CDR H2；和(3)包含氨基酸序列(D{T，Y}{A，G}{M，K}{D，Y}{Y，G}{A，D}{M，Y}{A，Y}{Y，A}MDY))的CDR H3；以及(b)人源化抗体轻链可变区，所述轻链可变区包含(1)包含氨基酸序列({K，R}SSQ{N，S}{I，L}V{H，Y}S{D，N}GNTYL{E，N，D})的CDR L1；(2)包含氨基酸序列(KVSNR{F，D}S)的CDR L2；和(3)包含氨基酸序列({F，M}QG{S，T}H{V， }{P， }{L， }{T， })的CDR L3。
2.如权利要求1所述的多肽，其中(a)CDR-Hl包含氨基酸序列(LYGMN)或(NYGMN)；(b)CDR-H2 包含氨基酸序列(WINTYTGEPTYADDi7KG)或(WINTNTGNPTYAQGFTQ)；并且(c)CDR-H3 包含氨基酸序列(DTAMDYAMAY)或(DYGKYGDYYAMDY)。
3.如权利要求1所述的多肽，其中(a)CDR-Ll 包含氨基酸序列(KSSQNIVHSDGNTYLE)或(RSSQSIVHSNGNTYLD)；(b)CDR-L2包含氨基酸序列(KVSNRFS)；并且(c)CDR-L3包含氨基酸序列(FQGSHVPLT)。
4.如权利要求1-3任何一项所述的多肽，其中(1)CDR-Hl由氨基酸序列(LYGMN)构成；(2)CDR-H2 由氨基酸序列(WINTYTGEPTYADDi7KG)构成；(3)CDR-H3由氨基酸序列(DTAMDYAMAY)构成；(4)CDR-Ll 由氨基酸序列(KSSQNIVHSDGNTYLE)构成；(5)⑶R-L2由氨基酸序列(KVSNRFS)构成；并且 ⑶R-L3由氨基酸序列(FQGSHVPLT)构成。
5.如权利要求1-3的任何一项所述的多肽，其中(1)CDR-Hl由氨基酸序列(NYGMN)构成；(2)CDR-H2 由氨基酸序列(WINTYTGEPTYADDi7KG)构成；(3)CDR-H3 由氨基酸序列(DYGKYGDYYAMDY)构成；(4)CDR-Ll 由氨基酸序列(RSSQSIVHSNGNTYLD)构成；(5)⑶R-L2由氨基酸序列(KVSNRFS)构成；并且(6)CDR-L3由氨基酸序列(FQGSHVPLT)构成。
6.一种特异性结合至TLlA的分离的抗原结合多肽，所述多肽包含人源化抗体重链可 变区，所述重链可变区包含(1)包含氨基酸序列TSNMGVV的CDR-Hl；(2)包含氨基酸序列HILWDDREYSNPALKS 的 CDR-H2 ；(3)包含氨基酸序列MSRNYYGSSYVMDY的CDR-H3。
7.一种特异性结合至TLlA的分离的抗原结合多肽，所述多肽包含人源化抗体轻链可变区，所述轻链可变区包含(1)包含氨基酸序列SASSSVNYMH的CDR-Ll；(2)包含氨基酸序列STSNLAS的⑶R-L2；和(3)包含氨基酸序列HQWNNYGT的CDR-L3。
8.如权利要求6所述的多肽，所述多肽进一步包含人源化抗体轻链可变区，所述轻链 可变区包含(1)包含氨基酸序列SASSSVNYMH的CDR-Ll；(2)包含氨基酸序列STSNLAS的⑶R-L2；和(3)包含氨基酸序列HQWNNYGT的CDR-L3。
9.如权利要求1-5的任何一项所述的多肽，其中所述人源化抗体重链可变区包含下述氨基酸序列(Q {V, 1} QLVQSG {S, P} ELKKPG {A, E} {S, T} VK {V, 1} SCKASGYTFTIL, S, Ni Y |G, AiMNffV {R, K} QAPG {Q, K} GL {E, K} WMGffINT IY, Ni TGIE, Ni PTYA ID, Qi ID, GiFiK, Ti GRF {V, A} FSL {D, Ε} TS {V, A} STAYLQI {S, N} {S, Τ} LK {A, N} ED {Τ, Μ} A {V, Τ} Y {Y, F} CARD {Τ, Y} {A, G} {Μ, K} {D, Y} {Y, G} {A, D} {M, Y} {A, Y} {Y, A}MDY)WGQGT{L, S} VTVSS)。
10.如权利要求9所述的多肽，其中所述人源化抗体重链可变区包含下述氨基酸序列 (QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTLYGMNffVRQAPGQGLEffMGfflNTYTGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDTAMDYAMAYffGQGTLVTVSS)。
11.如权利要求9所述的多肽，其中所述人源化抗体重链可变区包含下述氨基酸序列 (QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTLYGMNffVKQAPGKGLKWMGfflNTYTGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDTAMDYAMAYffGQGTLVTVSS)。
12.如权利要求9所述的多肽，其中所述人源化抗体重链可变区包含下述氨基酸序列 QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNffVRQAPGQGLEffMGfflNTYTGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYYCARDYGKYGDYYAMDYffGQGTLVTVSS)。
13.如权利要求6所述的多肽，其中所述人源化抗体重链可变区包含下述氨基酸序列 QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSNMGVVfflRQPPGKALEffLAHILffDDREYSNPALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARMSRNYYGS SYVMDYffGQGTLVTVS S。
14.如权利要求1-13的任何一项所述的多肽，其中所述人源化抗体轻链可变区包含下 述氨基酸序列(DVVMTQ{T, S}PLSLPV{Τ, S} {P, L}G{E, D, Q} {P, Q} ASISC {K, Rl SSQ{N, Sj {I, U V{H, Y}S{P, N}GNTYL IE, N, DlfflY, F}{L, Q}Q{K, R}PGQSP{Q, K, R}{L, V, R} LIYKVSNR{F, D} SGVPDRFSGSGSGTDFTLKI {S, N}RVEAED{L, V}GVY{Y, F}C{F, Ml QG{S, TlH{V, -}{P, -}{L, -} IT, -} {F, ff}G{G, S, Q} GTK {V, L}EIKR)。
15.如权利要求14所述的多肽，其中所述人源化抗体轻链可变区包含下述氨基酸序列(DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIKR)。
16.如权利要求14所述的多肽，其中所述人源化抗体轻链可变区包含下述氨基酸序列(DVVMTQSPLSLPVTLGQPASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffFQQRPGQSPRRLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDVGVYYCFQGSHVPLTFGQGTKVEIKR)。
17.如权利要求14所述的多肽，其中所述人源化抗体轻链可变区包含下述氨基酸序列(DVVMTQTPLSLPVTPGEPASISCKSSQNIVHSDGNTYLEffYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIKR)。
18.如权利要求14所述的多肽，其中所述人源化抗体轻链可变区包含下述氨基酸序列(DWMTQTPLSLPVSL⑶QASISCKSSQNIVHSDGNTYLEWYLQKPGQSPKVLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGS GTDFTLKISRVEAEDLGVYYCFQGSHVPLTFGGGTKVEIKR)。
19.如权利要求7所述的多肽，其中所述人源化抗体轻链可变区包含下述氨基酸序列 DIQLTQSPSFLSASV⑶RVTITCSASSSVNYMHWYQQKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQffNNYGTFGQGTKVEIKR。
20.一种特异性结合至TLlA的抗原结合多肽，所述多肽包含权利要求10、11、12、13中 的一项的人源化重链和权利要求15、16、17、18或19中的一项的人源化轻链。
21.如权利要求1-20的任何一项所述的多肽，其中所述多肽选自抗体分子、Fab片段、 Fab，片段、F(ab' )2片段和scFv分子。
22.如权利要求21所述的多肽，其中所述分子是抗体分子。
23.如权利要求22所述的抗体，其特异性地结合至TL1A，并且具有(a)轻链可变区，所述轻链可变区的序列为DIQLTQSPSFLSASVGDRVTITCSASSSVNYMHWYQ QKPGKAPKLLIYSTSNLASGVPSRFSGSGSGTEFTLTISSLQPEDFATYYCHQffNNYGTFGQGTKVEIKR ；禾口(b)重链可变区，所述重链可变区的序列为QVTLKESGPALVKPTQTLTLTCTFSGFSLSTSNMGV VffIRQPPGKALEffLAHILffDDREYSNPALKSRLTISKDTSKNQVVLTMTNMDPVDTATYYCARMSRNYYGSSYVMDY WGQGTLVTVSS。
24.如权利要求22所述的多肽，其中所述抗体是嵌合抗体，所述嵌合抗体包含人重链 恒定区和人轻链恒定区。
25.如权利要求22至23的任何一项所述的多肽，其中所述抗体是IgG分子(例如IgGl 分子或IgG4分子)。
26.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是scFv分子。
27.如权利要求26所述的多肽，其中所述scFv的分子式选自NH2-L-VH-X-VK-COOH和 NH2-L-VK-X-VH-COOH ；其中L是前导序列；VH是人源化抗体重链可变区；X是连接多肽；且 VK是人源化抗体轻链可变区。
28.如权利要求1所述的多肽，其中所述多肽是FabHSA融合分子。
29.如权利要求28所述的多肽，其中FabHSA融合分子的分子式选自与 NH2-VK-CK-COOH 结合的 NH2-VH-CH1-HSA-C00H 或 NH2-HSA-CH1-VH-C00H ；其中 VH-CHl-HSA 或HSA-CHl-VH是人源化抗体重链可变区(VH)和人重链恒定区1 (CHl)与人血清白蛋白 (HSA) 一起形成的融合蛋白，该融合蛋白随后与其同源的人源化抗体轻链可变区(VK)和人 k恒定区(CK)混合以形成Fab-HSA或HSA-Fab融合蛋白。
30.如权利要求1-29的任何一项所述的多肽，所述多肽被共轭至治疗试剂或诊断试剂。
31.如权利要求30所述的多肽，其中所述治疗试剂选自细胞毒素试剂、放射性标记、免 疫调节剂、激素、酶、寡核苷酸、光敏治疗剂或它们的组合。
32.如权利要求31所述的多肽，其中所述诊断试剂选自放射性标记、光敏诊断剂、超声 增强剂或非放射性标记。
33.如权利要求1-32的任何一项所述的多肽，其中所述多肽是TLlA的拮抗剂。
34.如权利要求1-33的任何一项所述的多肽，其中所述多肽不是TLlA的激动剂。
35.如权利要求1-34的任何一项所述的多肽，其中所述多肽以至少约IO6M4(优选至少 约lOl1，更优选至少约IO8Mi更优选至少约10 的亲和常数结合至TL1A。
36.一种药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1-35的任何一项的多肽和载体。
37.如权利要求36所述的药物组合物，所述药物组合物还包含额外的治疗试剂或诊断 试齐LU
38.一种治疗或诊断炎症性疾病或病症的方法，所述方法包含给有需要的患者服用权 利要求36或37的任何一项的组合物。
39.一种治疗或诊断免疫疾病或病症的方法，所述方法包含给有需要的患者服用权利 要求36或37的任何一项的组合物。
40.一种治疗或诊断癌症的疾病或病症的方法，所述方法包含给有需要的患者服用权 利要求36或37的任何一项的组合物。
41.如权利要求38-40的任何一项所述的方法，其中所述疾病或病症选自自身免疫疾 病(例如，狼疮)、炎症性肠病(IBD)、慢性阻塞性肺病(COPD)、关节炎(例如，风湿性关节 炎)、多发性硬化、移植排异反应、中枢神经系统损伤、Thl介导的肠病，例如克罗恩氏病、牛 皮癣、白血病或淋巴瘤(例如，慢性淋巴细胞白血病(CLL))、动脉硬化症、肺癌和结肠癌。
42.一种编码权利要求1-35的任何一项的多肽的多核苷酸。
43.一种重组多核苷酸，所述重组多核苷酸包含可操作地连接至权利要求42的任何一 个多核苷酸的启动子序列。
44.一种用权利要求43的多核苷酸转化的分离的细胞。
45.一种生产由权利要求42的重组多核苷酸编码的多肽的方法，所述方法包括a)培养用所述重组多核苷酸转化的细胞以表达所编码的多肽；和b)回收以这种方式表达的多肽。
46.如权利要求9所述的多肽，其中所述人源化抗体重链可变区包含以下氨基酸序列QVQLVQSGSELKKPGASVKVSCKASGYTFTNYGMNffVRQAPGKGLKffMGfflNTYTGEPTYADDFKGRFVFSLDTSVSTAYLQISSLKAEDTAVYFCARDYGKYGDYYAMDYffGQGTLVTVSS。
全文摘要
本发明公开了一种特异性结合至TNF超家族成员15(TNFSF 15)(也称为TL1A)的人源化抗体。本发明也描述了制造和使用抗TL1A抗体的方法。所述人源化抗体可为拮抗剂并且可被用来治疗或诊断与TL1A功能相关的病症。
文档编号A61P35/00GK101903402SQ200880120578
公开日2010年12月1日 申请日期2008年11月13日 优先权日2007年11月13日
发明者克雷格·罗森, 布里奇特·A·库克西, 帕拉尼萨姆伊·卡纳卡拉杰, 维克托·罗施克, 罗杰·史密斯 申请人:泰华生物制药美国公司