专利名称：重组腺病毒载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及重组腺病毒载体及其应用。
背景技术：
目前恶性肿瘤是我国第一位的致死因素，严重危害人民健康。尽管近年来医学诊 疗技术水平有了明显提高，包括放射治疗和化学治疗手段都取得了长足进步，但是多数实 体瘤仍预后不良，恶性肿瘤患者五年生存率仍非常低，如胰腺癌(4%)、肝癌(7%)、肺癌 (15% )，迫切需要新的治疗手段解除患者痛苦，提高预后(Cross，D. and J. K. Burmester, Gene therapy for cancer treatment :past, present andfuture. Clin Med Res, 2006.4(3) :p. 218-27. )0近三十年来对恶性肿瘤的发生发展有了较为深入的认识，目前 多数学者认为癌变是在外界因素和遗传因素的综合作用下多阶段发生的过程，包括多个癌 基因的激活和抑癌基因的失活(Vogelstein, B. and K. ff. Kinzler, Cancer genes and the pathways they control. Nat Med, 2004. 10(8) :p. 789-99.)，基于此认识，通过一定手段恢 复抑癌基因的表达是目前恶性肿瘤基因治疗最热门的领域，已有多个针对抑癌基因的临床 实验取得了鼓舞人心的结果，包括 p53、PTEN、FHIT(Moon，C. , Y. Oh, and J. A. Roth, Current status of gene therapy for lung cancer and head and neck cancer. Clin Cancer Res, 2003. 9(14) :p. 5055-67.)等。基因治疗生物载体中，复制缺陷型腺病毒载体具有高感染效率、复制期和静息细 胞均可感染、不整合入宿主细胞基因组、安全性较其他生物载体高的优点，因此成为了目前 多白勺L (Shirakawa, T.，The current status ofadenovirus-based cancer gene therapy. Mo 1 Cells, 2008. 25(4) :p. 462-6.)。尤值得一提的是中国深圳赛百诺生 物技术公司的P53的重组腺病毒载体已经批准上市(商品名称今又生)，是世界上第一 个肿瘤基因治疗药物，应用P53重组腺病毒治疗组的中位生存期及五年生存率明显优于对 照组，目前已经有非常多的肿瘤患者受益(Peng，Z.，Current status of gendicine in China-recombinant humanAd_p53 agent for treatment of cancers. Hum Gene Ther, 2005. 16(9) :p. 1016-27. ) (Kim, S. , Z. Peng, and Y. Kane da, Current status of gene therapin Asia. Mol Ther, 2008. 16(2) :p. 237—43.)。DENND2D是2006年发明人所在实验室从肺鳞癌差异表达cDNA文库中克隆的肺癌 相关新基因，其位于染色体lpl3. 1，编码468个残基组成的氨基酸，生物信息预测其具有保 守的DENN结构域，无明显信号肽及跨膜域(郑宏伟，新的候选抑癌基因DENND2D的鉴定和 功能研究 博士学位论文，2006. p. 20-26)。
发明内容
本发明的目的是提供重组腺病毒载体及其应用。本发明提供的重组腺病毒载体质粒，是在pAdxsi质粒(图2)的多克隆位点插入 如下(a)或(b)所述DNA片段得到的重组质粒
(a)自上游至下游依次含有CMV启动子和DENND2D蛋白的编码基因的DNA片段；(b)上游至下游依次含有四环素反应因子(TRE)、启动子和DENND2D蛋白的编码基 因的DNA片段。所述DENND2D蛋白可为如下1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质； 2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添 加且具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。所述DENND2D蛋白的编码基因可为如下3)或4)或5)的DNA分子3)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；4)在严格条件下与3)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA分子；5)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白 质的DNA分子；所述DNA片段(b)中，所述四环素反应因子(TRE)可为如下6)或7)或8)的DNA 分子6)其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；7)在严格条件下与6)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；8)与序列表中序列3限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。所述DNA片段(b)中，所述启动子可为如下9)或10)或11)的DNA分子9)其核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子；10)在严格条件下与9)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；11)与序列表中序列4限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的 DNA分子。本发明还保护用所述重组腺病毒载体质粒制备得到的重组腺病毒。所述重组腺病 毒可通过用所述重组腺病毒载体转染哺乳动物细胞得到。其中，用携带(b)所述DNA片段 的pAdxsi质粒转染哺乳动物细胞得到的重组腺病毒中，所述DENND2D蛋白的编码基因可以 诱导表达。本发明还保护一种重组腺病毒诱导表达系统，包括Ad-teton质粒和所述重组腺 病毒载体质粒；所述重组腺病毒载体质粒是携带(b)所述DNA片段的pAdxsi质粒。用 所述重组腺病毒诱导表达系统共同转染哺乳动物细胞，可以通过四环素或强力霉素诱导 DENND2D蛋白的编码基因的表达。所述哺乳动物细胞具体可为人胚肾细胞系HEK293细胞。所述重组腺病毒载体质粒、所述重组腺病毒、所述重组腺病毒表达系统均可应用 于制备治疗肿瘤和/或抑制肿瘤细胞增殖和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物。本发明还保护一种治疗肿瘤和/或抑制肿瘤细胞增殖和/或诱导肿瘤细胞凋亡的 药物，它的活性成分为如下物质中的至少一种所述重组腺病毒载体质粒、所述重组腺病毒 和所述重组腺病毒表达系统。所述肿瘤可为常见实体瘤，如鳞癌，腺癌等常见病理分型。所述鳞癌具体可为肺鳞 癌。所述腺癌具体可为肺腺癌。
所述肿瘤细胞具体可为H1299细胞、H520细胞或A549细胞。本发明构建了 DENND2D的两种重组腺病毒载体。两种重组腺病毒在体内外对多种 肿瘤细胞系均表现出抑制作用，具有一定的基因治疗价值。
图1为pShuttle-CMV穿梭载体的结构示意图。图2为pAdxsi腺病毒骨架载体的结构示意图。图3为pAdxsi_DENND2D的酶切鉴定结果。图4为Ad_DENND2D感染细胞48小时总蛋白的Western blot检测。图5为Ad_DENND2D的凋亡诱导作用检测结果。图6为实施例3中各处理组裸鼠的大体形态。图7为实施例3中各处理组的肿瘤生长曲线。图8为实施例4中各处理组动物的主要脏器HE切片观察。图9为pShuttle-TRE-T穿梭载体的结构示意图。图 10 为 pAdxsi-TRET-DENND2D 的酶切鉴定结果。图11为实施例5中，Ad-TRET-DENND2D感染细胞72小时总蛋白的Western blot 检测。图12为实施例6中，48小时后H1299细胞的表型变化。
图13为实施例6中，Western blot检测结果。
图14为实施例6中流式细胞术检测细胞凋亡结果(48小时)。
图15为实施例6中流式细胞术检测细胞凋亡结果(72小时)。
图16为实施例6中，诱导凋亡的时间剂量依赖效应。
图17为实施例6中，流式细胞术检测H520细胞凋亡结果(48小‘时)。
图18为实施例6中，流式细胞术检测A549细胞凋亡结果(48小‘时)。
图19为实施例6中，Western blot检测3种细胞系内源性表达DENND2D的结果
具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验 方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自 常规生化试剂商店购买得到的。实施例1、Ad_DENND2D重组腺病毒的制备pShuttle-CMV穿梭载体(见图1)诺赛基因公司。pAdxsi腺病毒骨架载体(见图2)诺赛基因公司。一、pAdxsi-DENND2D 重组质粒的构建1、DENND2D重组穿梭载体的构建设计带有Sfil限制性内切酶位点的DENND2D基因的引物如下DENND2D Sfi I up :5’ -AAAAAAGGCCGCTGCGGCCCACTCCAGGGGCCATGGATG-3’ ；DENND2D Sfi I dw 5’ -AAAAAAGGCCTGTTTGGCCGTCATTCTTATTCACCACAGCTC-3，。①以上述引物从人肺组织cDNA文库(购自Clontech公司)中PCR获得目的DENND2D基因的全长编码区，经测序正确后，用限制性内切酶Sfil (NEB公司)37°C酶切PCR 产物3-4小时。回收1.4kb的片段。②用限制性内切酶Sfil 37°C酶切pShuttle-CMV穿梭载体3_4小时，然后用牛小 肠碱性磷酸酶(CIP，Promega公司)去磷酸化处理载体0. 5小时。回收3. 4kb的片段。③将步骤①回收的1. 4kb片段和步骤②回收的3. 4kb片段用T4DNA连接酶连接。④将步骤③的连接产物转化大肠杆菌DH5 a感受态，涂卡那霉素固体培养基平板 (pShuttle-CMV穿梭载体携带有卡那霉素抗性基因)。⑤挑选阳性克隆进行重组质粒扩增纯化，得到重组质粒I(DENND2D重组穿梭载 体)。2、pAdxsi_DENND2D 的构建①利用限制性内切酶I-Ceul和I-Scel (NEB公司)双酶切重组质粒I，回收2. 5kb 的片段。②利用限制性内切酶I-Ceul和I-Scel (NEB公司)双酶切pAdxsi腺病毒骨架载 体，回收30kb的片段。③将步骤①回收的2. 5kb片段和步骤②回收的30kb片段用T4DNA连接酶连接。④将步骤③的连接产物转化DH5a感受态，涂氨苄青霉素固体培养基平板 (pAdxsi腺病毒骨架载体携有氨苄青霉素抗性基因)。⑤挑选阳性克隆扩增纯化。对阳性克隆进行酶切鉴定。目的重组质粒Xhol酶切后应有以下大小片段14kb、 11. 8kb、2. 66kb、2. 47kb、2. 4kb、l. 45kb、0. 6kb。阳性克隆的酶切鉴定的结果见图3。图3 中，M :Marker(lkb DNA ladder)，由上至下依次为:8kb、7kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1. 6kb、 lkb、517bp、396bp、230bp ； 1-4 阳性克隆。其中，14kb和11. 8kb片段太大，电泳不易区分， 2. 47kb和2. 4kb片段大小过于接近也不易区分。结果表明获得了目的重组质粒，将其命名 为 pAdxsi-DENND2D。pAdxsi-DENND2D为CMV启动子启动的重组复制缺陷型Ad5载体，将 pAdxsi-DENND2D进行大量扩增和纯化。二、Ad_DENND2D重组腺病毒的制备1、病毒包装选择人胚肾细胞系HEK293细胞(含有腺病毒复制所需E1区基因)(购自ATCC) 作为包装细胞系。取5iig pAdxsi_DENND2D，经PacI限制性内切酶线性化后，禾丨」用 Lipofectamine2000 脂质体转染试剂(Invitrogen 公司)转染约 40 X 104HEK293 细胞(35mm 平皿)；6小时后换液；试验设置两个重复。每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显 噬斑，此为细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。待细胞大部分病变并从底部脱落时 进行收毒。收集两个平皿的细胞及培养液放入-80°C冰箱。细胞产物经干冰酒精和37°C 水浴反复冻融三次，破碎细胞，释放病毒。3000rpm离心5分钟，收集含病毒的上清液，即为 Ad-DENND2D重组腺病毒的第一代毒种(P1)。2、病毒扩增
取2ml PI代病毒上清，感染一个75cm2培养瓶的HEK293细胞(细胞密度>90%)， 待所有细胞脱落底面(约48小时后)即可进行收毒，收集细胞及培养基，2000rpm离心5分 钟弃掉上清。加入lml ST buffer (完全培养基+2.5%甘油)，混勻后存于-80°C冰箱。冻 融三次，离心取上清进行下一代扩增或于-80°C保存，此为Ad-DENND2D重组腺病毒的第二 代毒种(P2)。剩余50 u 1保存，取剩下的全部P2代病毒上清感染6个75cm2培养瓶的细胞，约 48小时后细胞脱落，收集细胞，加入6ml ST buffer (完全培养基+2. 5%甘油)，混勻后收毒 (过程同上)。将此批收集的病毒上清，感染40个75cm2培养瓶的细胞，收毒方法同上。3、病毒纯化采用氯化铯(CsCl)密度梯度离心纯化病毒，具体步骤如下(1)不连续密度梯度离心去除细胞污染物取8ml CsCl 1.4 溶液(53g CsCl 溶于 87ml PH8. 010mmol/L Tris-Cl，过滤除菌) 加入离心管中，轻柔缓慢加入10ml CsCl 1.2溶液(26. 8g CsCl溶于92ml PH8. 010mmol/L Tris-Cl，过滤除菌)，上部缓慢加入约20ml的步骤2得到的病毒溶液(10mMTriS-Cl补齐)。 100000g 4°C离心90分钟。离心结束后，可见蓝白色雾状条带，穿刺吸出病毒溶液，以10mM Tris-Cl溶液稀释至8ml。(2)连续密度梯度离心区分感染病毒和缺陷病毒取12ml CsCl 1. 4溶液加入离心管中，轻柔缓慢加入14ml CsCl 1.2溶液，其上部 非常缓慢的加入约8ml步骤(1)得到的病毒溶液、100000g 4°C离心16-20小时。离心结束 后穿刺吸出蓝白病毒条带。(3)透析去除 CsCl将步骤⑵所得病毒液用透析卡(购自Pierce公司)4°C透析16小时，间隔换液 3 次，透析 buffer 为10mM PH8. 0Tris_Hcl、2mM Mgcl2,4% Sucrose。将得到的病毒液作为 病毒原液。4、病毒滴度测定紫外分光光度测定步骤3得到的病毒液的0D260/0D280，该比值反应病毒的纯度， 比值为1. 24，在正常范围1. 2-1. 3之间。取病毒原液设8个10倍稀释梯度，分别感染96孔 板中培养的HEK293细胞，观察细胞病变效应。以出现100%病变效应的病毒稀释度，带入公 式得到病毒感染滴度。病毒滴度(pfu/ml)=(接种细胞数X稀释度X 10)/加入的病毒体积(mL)，公式 中假定在病毒感染48小时后每个细胞中有10个病毒可导致细胞出现完全病变。最终测得Ad_DENND2D 的滴度为 4 X 10npfu/ml。三、对照病毒I(Adv)的制备1、空载体对照质粒I的制备①利用限制性内切酶I-Ceul和I-Scel (NEB公司)双酶切pShuttle-CMV穿梭载 体，回收1. lkb的片段。②利用限制性内切酶I-Ceul和I-Scel (NEB公司)双酶切pAdxsi腺病毒骨架载 体，回收30kb的片段。③将步骤①回收的1. lkb片段和步骤②回收的30kb片段用T4DNA连接酶连接。
④将步骤③的连接产物转化DH5CI感受态，涂氨苄青霉素固体培养基平板 (pAdxsi腺病毒骨架载体携有氨苄青霉素抗性基因)。⑤挑选阳性克隆扩增纯化。得到空载体对照质粒I。2、对照病毒I的制备用空载体对照质粒I代替pAdXsi-DENND2D质粒，其它同步骤二，进行对照病毒的 包装、扩增、纯化和滴度测定。四、Ad-DENND2D重组腺病毒的鉴定设3个Ad-DENND2D病毒感染浓度(Moi 值(multiplicity of infection)分别为 moi50、moil00、moi200)，将 Ad-DENND2D (或 moilOO 的 Adv)感染人肺癌细胞系 H1299 细胞， 48小时后提取细胞系总蛋白进行Western blot检测。取40 μ g总蛋白，SDS-PAGE电泳后 转膜，以DENND2D特异的抗体(用DENND2D免疫新西兰兔得到的兔源多克隆抗体，1 1000) 检测DENND2D的表达情况。结果见图4。结果显示，感染Adv的细胞本底没有表达，感染 Ad-DENND2D的细胞48小时后检测到DENND2D的表达，并且随moi值的增加，DENND2D的表 达增强。实施例2、Ad-DENND2D重组腺病毒的体外诱导凋亡作用将Ad-DENND2D (或Adv)按照moi 100的剂量或moi 200的剂量分别感染人肺癌 细胞系H1299细胞，48小时后收集细胞进行Armexin V-FITC和PI双染，流式细胞术检测细
胞凋亡发生情况。试验设置三次重复，结果取平均值。结果见图5(图中所示为其中一次实验的结果)。用moilOO的剂量感染后， Ad-DENND2D 组细胞凋亡率为 17. 09士3. 22%，显著高于 Adv 组 11. 36士 1. 25 (P < 0. 05)。 用moi200的剂量感染后，Ad-DENND2D组细胞凋亡率为21. 76士 1. 99 %，显著高于Adv组 14. 06 (P < 0. 05)。对于感染Ad-DENND2D的细胞，moi200剂量组的细胞凋亡率高于moilOO 剂量组，具有统计学差异(P < 0. 05)，提示Ad-DENND2D的诱导凋亡作用存在正相的量效关 系。实施例3、Ad-DENND2D重组腺病毒的体内抑瘤作用1、选择3 4周龄的雌性BALB/c裸鼠(购自维通利华公司)24只；收集对数生长 期的H1299细胞(购自ATCC)，调整细胞浓度为2.5X107/ml。2、取200 μ 1细胞悬液接种于裸鼠右腋后皮下，10天左右待肿瘤生长至5X 5mm大 小时分成四组，每组6只，分别进行如下处理生理盐水注射组(NS)注射生理盐水，每三天瘤内多点注射一次，每次50μ1，共三次。Adv病毒组(Adv)调整Adv病毒滴度为2 X 101Qpfu/ml，每三天瘤内多点注射一 次，每次50 μ 1，共三次，累计病毒注射量为3 X IO9Pfu。ρ53病毒组(Ad_p53)调整Ad_p53病毒(购自诺赛基因组有限公司)滴度 为ZXliTpfu/ml，每三天瘤内多点注射一次，每次50μ1，共三次，累计病毒注射量为 3 X 109ρ fu。Ad-DENND2D 病毒组(Ad_DENND2D)调整 Ad_DENND2D 病毒滴度为 2X 101Qpfu/ml， 每三天瘤内多点注射一次，每次50μ1，共三次，累计病毒注射量为3X109pfu。
从第一次瘤内注射开始，隔天测量移植瘤一次，记录肿瘤长径(a)和短径(b)，参 照公式肿瘤体积V = aXb2/2，计算肿瘤大小，绘制移植瘤生长曲线。从第一次瘤内注射开 始，自第一次注射(2009年2月26日)24天后，结束实验，各组裸鼠的形态见图6。各组裸 鼠的肿瘤生长曲线见图7。从生长曲线可以看出Ad-p53组和Ad-DENND2D组裸鼠的肿瘤生 长落后于NS组和Adv组。4周后处死裸鼠，取皮下移植瘤，称重，计算注射病毒的抑瘤率，计算公式为(NS组 平均瘤重_实验组平均瘤重)/NS组平均瘤重。Ad-DENND2D组平均瘤重为0. 20 士0. 14g，抑 瘤率约为52. 76%，与Ad-p53组(平均瘤重为0. 19士0. 13g，抑瘤率约为55. 91 % )无统计 学差异(P > 0. 05)。而Ad-p53已经作为基因治疗药物在临床上推广应用，提示Ad-DENND2D 重组腺病毒具有良好的应用前景。实施例4、Ad-DENND2D重组腺病毒的体内安全性评价取6只4周龄雌性BALB/c裸鼠(购自维通利华)，分为两组，每组3只。生理盐水组(NS)每只经尾静脉注射生理盐水100 μ 1 ；Ad-DENND2D组(Ad_DENND2D)将病毒滴度调整为5 X 1010pfu/ml，经尾静脉每只注 射100 μ 1重组Ad-DENND2D (每只的注射剂量为5 X 109pfu)。每天观察动物反应。7天后结束实验，取全身主要器官包埋固定，制HE切片，病理 分析，结果见图8。病毒注射后动物生长未见明显异常，全身主要脏器未发现明显坏死、炎性浸润等 病理变化；提示Ad-DENND2D具有一定的生物安全性。实施例5、Ad-TRET-DENND2D 的构建四环素诱导表达系统(tet-on)由两部分组成四环素反应元件TRE控制的目的基 因表达和反义四环素激活元件rtTA。当四环素或其衍生物(强力霉素，Dox)存在时，rtTA 激活结合至TRE元件，启动下游基因转录。带有四环素反应元件TRE的pShuttle-TRE-T穿梭载体(见图9)诺赛基因公司。表达反义四环素激活元件rtTA的Ad-teton重组腺病毒质粒诺赛基因公司。一、pAdxsi-TRET_DENND2D 重组质粒的构建1、DENND2D重组pShuttle-TRE-T穿梭载体(重组质粒II)的构建①设计上游带有Kpn I下游带有Xba I内切酶位点的引物如下，以购自Clontech 公司的正常肺组织cDNA文库为模板，PCR扩增获得目的DENND2D片段，经测序正确后，用限 制性内切酶Kpn I和Xba I双酶切37°C、4小时，回收1. 4kb的片段。DENND2D Kpn I up :5，CGGGGTACCCACTCCAGGGGCCATGGATG ；DENND2D Xba I dw 5' TGCTCTAGAGTCATTCTTATTCACCACAGCTC。②用限制性内切酶KpnI和XbaI双酶切pShuttle-TRE-T穿梭载体(37°C、4小时)。 回收2. 9kb的片段。③将步骤①回收的1. 4kb片段和步骤②回收的2. 9kb片段用T4DNA连接酶连接。④将步骤③的连接产物转化大肠杆菌DH5 α感受态，涂卡那霉素固体培养基平板 (pShuttle-TRET载体携带有卡那霉素抗性基因)。⑤挑选阳性克隆进行重组质粒扩增纯化，得到重组质粒II (DENND2D重组 pShuttIe-TRET 穿梭载体)。
2、pAdxsi-TRET_DENND2D 的构建①利用限制性内切酶I-CeuI和I-SceI (NEB公司)双酶切重组质粒II，回收2kb 的片段。②利用限制性内切酶I-CeuI和I-Scel (NEB公司)双酶切pAdxsi腺病毒骨架载 体，回收30kb的片段。③将步骤①回收的2kb片段和步骤②回收的30kb片段用T4DNA连接酶连接。④将步骤③的连接产物转化DH5ci感受态，涂氨苄青霉素固体培养基平板 (pAdxsi腺病毒骨架载体携有氨苄青霉素抗性基因)。⑤挑选阳性克隆扩增纯化。对阳性克隆进行酶切鉴定。目的重组质粒XhoI酶切后应有以下大小片段14kb、 11. 8kb、2. 5kb、2. 47kb、l. 9kb、l. 45kb、0. 6kb。阳性克隆的酶切鉴定的结果见图10。图10 中，M :Marker(lkb DNA ladder)，由上至下依次为:8kb、7kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1. 6kb、 lkb、517bp、396bp、230bp ； 1-4 阳性克隆。其中，14kb和11. 8kb片段太大，电泳不易区分， 2. 5kb和2. 47kb片段大小过于接近也不易区分。4个阳性克隆为目的重组质粒，将其命名 为 pAdxsi-TRET-DENND2D。pAdxsi-TRET-DENND2D即为四环素诱导表达的重组复制缺陷型Ad5载体，将 pAdxsi-TRET-DENND2D进行大量扩增和纯化。二、Ad-TRET_DENND2D重组腺病毒的制备1、病毒包装选择人胚肾细胞系HEK293细胞(含有腺病毒复制所需El区基因)作为包装细胞 系。取5 μ g pAdxsi-TRET-DENND2D质粒，经PacI限制性内切酶线性化后，利用 Lipofectamine2000 脂质体转染试剂(Invitrogen 公司)转染约 40 X 104HEK293 细胞(35mm 平皿)；6小时后换液；试验设置两个重复。每天观察细胞出毒迹象。出毒现象为细胞变大变圆，呈葡萄状，并开始出现明显 噬斑，此为细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)。待细胞大部分病变并从底部脱落时 进行收毒。收集两个平皿的细胞及培养液放入-80°C冰箱。细胞产物经干冰酒精和37°C 水浴反复冻融三次，破碎细胞，释放病毒。3000rpm离心5分钟，收集含病毒的上清液，即为 Ad-TRET-DENND2D重组腺病毒的第一代毒种(Pl)。2、病毒扩增取2ml Pl代病毒上清，感染一个75cm2培养瓶的HEK293细胞(细胞密度>90%)， 待所有细胞脱落底面(约48小时后)即可进行收毒，收集细胞及培养基，2000rpm离心5分 钟弃掉上清。加入Iml ST buffer (完全培养基+2.5%甘油)，混勻后存于-80°C冰箱。冻 融三次，离心取上清进行下一代扩增或于-80°C保存，此为Ad-TRET-DENND2D重组腺病毒的 第二代毒种(P2)。剩余50 μ 1保存，取剩下的全部Ρ2代病毒上清感染6个75cm2培养瓶的细胞，约 48小时后细胞脱落，收集细胞，加入6ml ST buffer (完全培养基+2. 5%甘油)，混勻后收毒 (过程同上)。将得到的病毒液作为病毒原液。3、病毒滴度测定
紫外分光光度测定步骤3得到的病毒液的0D260/0D280，该比值反应病毒的纯度， 比值为1. 27，在正常范围1. 2-1. 3之间。取病毒原液设8个10倍稀释梯度，分别感染96孔 板中培养的HEK293细胞，观察细胞病变效应。以出现100%病变效应的病毒稀释度，带入公 式得到病毒感染滴度。病毒滴度(pfu/ml)=(接种细胞数X稀释度X 10)/加入的病毒体积(mL)。公式中假定在病毒感染48小时后每个细胞中有10个病毒可导致细胞出现完全病变。Ad-TRET-DENND2D 的滴度为 1. 5 X 10lclpfu/ml。三、对照病毒II的制备1、空载体对照质粒11的制备①利用限制性内切酶I-CeuI和I-Scel (NEB公司)双酶切pShuttle-TRE-T穿梭 载体，回收0. 6kb的片段。②利用限制性内切酶I-CeuI和I-SceI (NEB公司)双酶切pAdxsi腺病毒骨架载 体，回收30kb的片段。③将步骤①回收的0. 6kb片段和步骤②回收的30kb片段用T4DNA连接酶连接。④将步骤③的连接产物转化DH5CI感受态，涂氨苄青霉素固体培养基平板 (pAdxsi腺病毒骨架载体携有氨苄青霉素抗性基因)。⑤挑选阳性克隆扩增纯化。得到了空载体对照质粒II。2、对照病毒II的制备用空载体对照质粒II代替pAdxsi-TRET-DENND2D质粒，其它同步骤二，进行对照 病毒的包装、扩增和滴度测定。四、Ad-TRET_DENND2D重组腺病毒的鉴定四环素诱导表达腺病毒系统需同时感染两种病毒(Ad-teton和 Ad-TRET-DENND2D)，取两种病毒比例为1 1，设不同总感染剂量，将Ad-teton和 Ad-TRET-DENND2D 一起共感染人肺癌细胞系H1299细胞，4小时后培养基内添加Dox (购自 Sima公司，终浓度为lyg/ml)诱导表达，48小时后提取细胞系总蛋白进行Western blot 检测。取40 μ g总蛋白，SDS-PAGE电泳后转膜，以DENND2D特异的抗体(用DENND2D免疫 兔子得到的兔源多克隆抗体，1 1000)检测DENND2D的表达情况。结果见图11。图11中，1-5 没有添加DOX的处理；1 没有感染两种病毒的细胞； 2 感染两种病毒的细胞(总感染剂量为moilO) ；3 感染两种病毒的细胞(总感染剂量为 moi20) ；4 感染两种病毒的细胞(总感染剂量为moi50) ；5 感染两种病毒的细胞(总感染 剂量为moilOO) ；6-10 添加DOX的处理；6 没有感染两种病毒的细胞；7 感染两种病毒的 细胞(总感染剂量为moilO) ；8 感染两种病毒的细胞(总感染剂量为moi20) ；9 感染两种 病毒的细胞(总感染剂量为moi50) ；10 感染两种病毒的细胞(总感染剂量为moilOO)。结 果显示未加Dox的处理组，随感染病毒剂量增加出现非常低的渗漏表达；加入Dox的处理 组，感染病毒后DENND2D的表达明显增强，起到了开关调控的作用，并且其表达随病毒剂量 增加而升高。实施例6、Ad-TRET-DENND2D的诱导凋亡作用
一、对H1299细胞的诱导凋亡作用将Ad-teton和Ad-TRET_DENND2D (或对照病毒II)按照1 1比例共感染人肺 癌细胞系H1299细胞，总moi值为50，设由低至高的Dox作用浓度(0 1 μ g/ml)，48小 时后观察细胞变化，48小时后H1299细胞的表型变化见图12。图12中，A 没有进行任何 处理的H1299细胞；B 感染Ad-teton和对照病毒II的H1299细胞(Dox的浓度为1 μ g/ ml) ；C 感染 Ad-teton 和 Ad-TRET_DENND2D 的 H1299 细胞(Dox 的浓度为 O μ g/ml) ；D 感染 Ad-teton 和 Ad-TRET_DENND2D 的 H1299 细胞(Dox 的浓度为 0. 01 μ g/ml) ；E 感染 Ad-teton 和 Ad-TRET_DENND2D 的 H1299 细胞(Dox 的浓度为 0. 1 μ g/ml) ；F 感染 Achteton 和Ad-TRET-DENND2D的H1299细胞(Dox的浓度为1 μ g/ml)。结果表明伴随Dox作用浓 度增加H1299细胞出现变圆，脱落，以及细胞死亡比例升高，而对照病毒加高浓度Dox组没 有类似表型。Caspase3为细胞凋亡的关键执行分子。通常Caspase的非激活状态为全长的 酶原形式，发生凋亡时CaSpaSe3通过同源活化或异源活化被切割去除N端前肽，其活性 状态一般为两个大亚基(约20kD)和两个小亚基(约IOkD)组成，故全长蛋白比例的减 少一般表示Caspase由静息转为活化，CaSpaSe3活化后会剪切下游底物PARP，PARP由 116kD被剪切为85kD和29kD两个片段。提取感染重组病毒72小时后细胞系总蛋白， Western blot 检测 DENND2D、Caspase3 (1 1000，Cell Signaling 公司)和 PARP (Cell Signaling公司)。Western blot检测结果见图13。图13中，A 没有进行任何处理的 H1299细胞；B 感染Ad-teton和对照病毒II的H1299细胞(Dox的浓度为1 μ g/ml)； C 感染 Ad-teton 和 Ad-TRET-DENND2D 的 H1299 细胞(Dox 的浓度为 O μ g/ml) ；D 感染 Ad-teton 和 Ad-TRET-DENND2D 的 H1299 细胞(Dox 的浓度为 0. 01 μ g/ml) ；E 感染 Ad-teton 和 Ad-TRET-DENND2D 的 H1299 细胞(Dox 的浓度为 0. 1 μ g/ml) ；F 感染 Achteton 和 Ad-TRET-DENND2D的H1299细胞(Dox的浓度为1 μ g/ml)。结果表明DENND2D的蛋白表达 随Dox的诱导浓度升高而增强，而CaSpaSe3的全长蛋白表达减弱，同时PARP剪切作用随着 DENND2D的诱导表达而显著增强，提示凋亡关键执行分子CaSpaSe3的活化。加入Dox诱导后48小时和72小时收集细胞进行Annexin V-FITC和PI双染，流式 细胞术检测细胞凋亡发生情况。试验设置三次重复，结果取平均值。48小时的检测结果见图 14 (图中所示为其中一次实验的结果)。72小时的检测结果见图15 (图中所示为其中一次 实验的结果)。图14和图15中，A 没有进行任何处理的H1299细胞；B 感染Ad-teton和 对照病毒 II 的 H1299 细胞(Dox 的浓度为 1 μ g/ml) ；C 感染 Achteton 和 Ad-TRET_DENND2D 的 H1299 细胞(Dox 的浓度为 O μ g/ml) ；D 感染 Achteton 和 Ad-TRET_DENND2D 的 H1299 细胞(Dox 的浓度为 0. 01 μ g/ml) ；E 感染 Ad-teton 和 Ad-TRET_DENND2D 的 H1299 细胞 (Dox 的浓度为 0. 1 μ g/ml) ；F 感染 Achteton 和 Ad-TRET_DENND2D 的 H1299 细胞(Dox 的 浓度为1 μ g/ml)。结果表明转染病毒组H1299细胞凋亡率在48小时随Dox的诱导浓度 升高由3. 09士 1. 31%升至18. 78士 1. 74%,72小时细胞凋亡率随Dox的诱导浓度升高由 9. 89士 1.03%升至44. 91 士 1.73%，显著高于48小时凋亡发生率(P < 0. 05)。根据流式细胞术检测的结果，对不同处理的细胞凋亡率绘图，见图16。图16中，A 没有进行任何处理的H1299细胞；B 感染Ad-teton和对照病毒II的H1299细胞(Dox的浓 度为 1 μ g/ml) ；C 感染 Ad-teton 和 Ad-TRET_DENND2D 的 H1299 细胞(Dox 的浓度为 Oyg/
12ml) ；D 感染 Ad-teton 和 Ad-TRET_DENND2D 的 H1299 细胞(Dox 的浓度为 0. 01 μ g/ml)； E 感染 Ad-teton 和 Ad-TRET_DENND2D 的 H1299 细胞(Dox 的浓度为 0. 1 μ g/ml) ；F 感染 Ad-teton 和 Ad-TRET_DENND2D 的 H1299 细胞(Dox 的浓度为 1 μ g/ml)。结果表明DENND2D 诱导细胞凋亡，并且存在正相的时间剂量依赖效应。二、对其它细胞的诱导凋亡作用分别选择了肺鳞癌和肺腺癌细胞系H520细胞系(购自ATCC)和A549细胞系(购 自ATCC)，观察Ad-TRET-DENND2D的凋亡诱导作用，方法同步骤一。H520细胞系的结果见图17 (总moi 200)。图17中A 没有进行任何处理的H520 细胞；B 感染Ad-teton和对照病毒II的H520细胞(Dox的浓度为1 μ g/ml) ；C:感染 Ad-teton 和 Ad-TRET_DENND2D 的 H520 细胞(Dox 的浓度为 O μ g/ml) ；F 感染 Achteton 和 Ad-TRET-DENND2D的H520细胞(Dox的浓度为1 μ g/ml)。结果表明凋亡发生率由对照病 毒 II 的 9. 09士4. 11%升为诱导表达组(Dox 1 μ g/ml)的 46. 27士21. 99%。A549细胞系的结果见图18 (总moi 100)。图18中A 没有进行任何处理的A549 细胞；B 感染Ad-teton和对照病毒II的A549细胞(Dox的浓度为1 μ g/ml) ；C:感染 Ad-teton 和 Ad-TRET_DENND2D 的 A549 细胞(Dox 的浓度为 O μ g/ml) ；F 感染 Achteton 和 Ad-TRET-DENND2D的A549细胞(Dox的浓度为1 μ g/ml)。结果表明凋亡发生率由对照病 毒II的14. 80士5. 92%升为诱导表达组(Dox 1 μ g/ml)的29. 38士9. 93% ；均具有统计学 差异(P < 0. 05)。三、不同细胞中DENND2D表达的检测通过Western blot检测H1299细胞、H520细胞和A549细胞中是否DENND2D的表 达。同时以GAPDH抗体(1 5000，康成生物公司)检测内参GAPDH水平。结果见图19。结果表明H520细胞有DENND2D的表达，而H1299和A549细胞未检 测DENND2D的表达，提示Ad-TRET_DENND2D的调往诱导作用不受DENND2D本底表达情况的影响。以上结果均表明，Ad-TRET_DENND2D可以诱导多种实体瘤细胞系凋亡发生，具有候 选基因治疗药物价值。序列表<110>中国医学科学院肿瘤研究所北京诺赛基因组研究中心有限公司<120>重组腺病毒载体及其应用<130>CGGNARY92283<160>4<210>1<211>1407<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>1atggatgggc tcggccgccg ccttcgagcc agtctgagac tgaagcgcgg ccatggggga 60
65707580
AsnLeuLeuArgGlyGlnGlnGluGluGluGluArgLeuLeuLysAla
859095
IleProLeuPheCysPheProAspGlyAsnGluTrpAlaSerLeuThr
100105110
GluTyrProArgGluThrPheSerPheValLeuThrAsnValAspGly
115120125
SerArgLyslieGlyTyrCysArgArgLeuLeuProAlaGlyProGly
130135140
ProArgLeuProLysValTyrCyslielieSerCyslieGlyCysPhe
145150155160
GlyLeuPheSerLyslieLeuAspGluValGluLysArgHisGlnlie
165170175
SerMetAlaVallieHisProPheMetGlnGlyLeuArgGluAlaAla
180185190
PheProAlaProGlyLysThrValThrLeuLysSerPhelieProAsp
195200205
SerGlyThrGluPhelieSerLeuThrArgProLeuAspSerHisLeu
210215220
GluHisValAspPheSerSerLeuLeuHisCysLeuSerPheGluGln
225230235240
IleLeuGlnliePheAlaSerAlaValLeuGluArgLyslieliePhe
245250255
LeuAlaGluGlyLeuSerThrLeuSerGlnCyslieHisAlaAlaAla
260265270
AlaLeuLeuTyrProPheSerTrpAlaHisThrTyrlieProValVal
275280285
ProGluSerLeuLeuAlaThrValCysCysProThrProPheMetVal
290295300
GlyValGlnMetArgPheGlnGlnGluValMetAspSerProMetGlu
305310315320
GluValLeuLeuValAsnLeuCysGluGlyThrPheLeuMetSerVal
325330335
GlyAspGluLysAsplieLeuProProLysLeuGlnAspAsplieLeu
340345350
AspSerLeuGlyGlnGlylieAsnGluLeuLysThrAlaGluGlnlie
355360365
AsnGluHisValSerGlyProPheValGlnPhePheValLyslieVal
370375380
Gly 385 Phe
His Tyr Ala Ser
Tyr 390 Phe
Gln Glu Arg Ser 405
Lys Phe Val
lie Lys Arg Cys Lys Ala
Glu Ala Asn 395
Thr Ser
Arg Phe Val
Leu 410 Gln
Gly Gln Gly His 400
Lys Thr Asn Arg
Leu Phe Ser
Gln Glu Ala 435
Leu Glu Tyr Glu
Lys
lie 450 Thr
Lys Lys Phe Val Lys Thr 420425
Glu Lys Ser Lys Asn Pro Pro Ala Gly 440
Gln Lys Lys
Leu 430 Phe
Asn 415 Phe
lie
Gln Gln
Glu 455
Gln Lys 460
Tyr 445
Lys Pro Arg Glu
Val Lys
Lys 465
<210>3 <211>249 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223> <400>3 gagtttactc agaacgatgt atcagtgata agtttatccc aacgtatgt <210>4 <211>60 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223> <400>4
taggcgtgta cggtgggagg cctatataag cagagctcgt ttagtgaacc gtcagatcgc 60
cctatcagtg cgagtttact gagaacgtat tatcagtgat
atagagaacg ccctatcagt gtcgagttta agagaacgta
tatgtcgagt gatagagaac ctccctatca tgtcgagttt
ttactcccta gtatgtcgag gtgatagaga actccctatc
tcagtgatag tttactccct acgtatgtcg agtgatagag
60 120 180 240
249
权利要求
重组腺病毒载体质粒，是在pAdxsi质粒的多克隆位点插入如下(a)或(b)所述DNA片段得到的重组质粒(a)自上游至下游依次含有CMV启动子和DENND2D蛋白的编码基因的DNA片段；(b)上游至下游依次含有四环素反应因子、启动子和DENND2D蛋白的编码基因的DNA片段。
2.如权利要求1所述的重组腺病毒载体质粒，其特征在于所述DENND2D蛋白是如下 1)或2)的蛋白质1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；2)将序列2的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且 具有相同功能的由序列2衍生的蛋白质。
3.如权利要求2所述的重组腺病毒载体质粒，其特征在于所述DENND2D蛋白的编码 基因是如下3)或4)或5)的DNA分子3)其核苷酸序列是序列表中序列1所示的DNA分子；4)在严格条件下与3)限定的DNA序列杂交且编码相同功能蛋白质的DNA分子；5)与序列表中序列1限定的DNA序列具有90%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的 DNA分子。
4.如权利要求1至3中任一所述的重组腺病毒载体质粒，其特征在于所述DNA片段 (b)中，所述四环素反应因子是如下6)或7)或8)的DNA分子6)其核苷酸序列是序列表中序列3所示的DNA分子；7)在严格条件下与6)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；8)与序列表中序列3限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的DNA分子；所述启动子是如下9)或10)或11)的DNA分子9)其核苷酸序列是序列表中序列4所示的DNA分子；10)在严格条件下与9)限定的DNA序列杂交且具有相同功能的DNA分子；11)与序列表中序列4限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有相同功能的DNA 分子。
5.重组腺病毒诱导表达系统，包括权利要求1至4中任一所述的重组腺病毒载体质粒 和Ad-teton质粒；所述重组腺病毒载体质粒是携带(b)所述DNA片段的pAdxsi质粒。
6.应用权利要求1至4中任一所述的重组腺病毒载体质粒制备得到的重组腺病毒。
7.权利要求1至4中任一所述重组腺病毒载体质粒、权利要求5所述重组腺病毒表达 系统和权利要求6所述重组腺病毒中的至少一种在制备治疗肿瘤和/或抑制肿瘤细胞增殖 和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述肿瘤为实体瘤；所述肿瘤细胞为H1299 细胞、H520细胞或A549细胞。
9.一种治疗肿瘤和/或抑制肿瘤细胞增殖和/或诱导肿瘤细胞凋亡的药物，它的活性 成分为如下物质中的至少一种权利要求1至4中任一所述重组腺病毒载体质粒、权利要求 5所述重组腺病毒表达系统和权利要求6所述重组腺病毒。
10.如权利要求9所述的药物，其特征在于所述肿瘤为实体瘤；所述肿瘤细胞为 H1299细胞、H520细胞或A549细胞。
全文摘要
本发明公开了重组腺病毒载体及其应用。本发明提供的重组腺病毒载体质粒，是携带有如下(a)或(b)所述DNA片段的pAdxsi质粒(a)自上游至下游依次含有CMV启动子和DENND2D蛋白的编码基因的DNA片段；(b)上游至下游依次含有四环素反应因子、启动子和DENND2D蛋白的编码基因的DNA片段。两种重组腺病毒在体内外对多种肿瘤细胞系均表现出抑制作用，具有一定的基因治疗价值。
文档编号A61K48/00GK101892261SQ20091008457
公开日2010年11月24日 申请日期2009年5月18日 优先权日2009年5月18日
发明者付国斌, 石太平, 程书钧, 郑宏伟, 郭金海, 马大龙, 高燕宁 申请人:中国医学科学院肿瘤研究所;北京诺赛基因组研究中心有限公司