含有经修饰腺病毒载体的流感疫苗的制作方法

含有经修饰腺病毒载体的流感疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明提供了通用流感疫苗，该疫苗可提供长达数年的保护，提供抵抗循环流感株的经改善保护，所述毒株无法精确预测以用于每年的疫苗生产，并提供保护抵御可能带来全球性大流行的新出现流感病毒株。
【专利说明】含有经修饰腺病毒载体的流感疫苗
[0001]本申请要求2011年5月23日提交的序列号61/488，904的权益，并通过引用将其纳入。
[0002]该申请通过引用纳入2012年5月21日创建并命名为“00048600038sequenceIisting, txt的” 8.67kb文本文件的内容，其为用于本申请的序列表。
[0003]本发明引用的每个参考文献通过引用全文纳入本文。
[0004]发明背景
[0005]甲型流感病毒每年导致全球3~5百万人患严重疾病并与250，000~500，000例死亡相关。两个流感疫苗原型-用于肌内注射的三价灭活疫苗(TIV)和用于鼻内应用的减毒病毒(如FLUM1ST?)可用于儿童和最高至49岁成年人的疫苗接种。只有TIV被批准用于50岁和更年长的个体。虽然对易感人群例如儿童和老年人强烈推荐流感疫苗，但流感疫苗仅提供有限的保护，如疫苗试验的统计分析所示。病毒表面蛋白是中和抗体的靶标和疫苗诱导保护的主要关联物，所述蛋白快速突变并在主要循环毒株间错配，且疫苗组分还会降低疫苗功效。不同毒株间的基因重配(re-assortment)可导致新毒株的出现，而且如果它们持续在人之间传播， 会进而导致全球性大流行。这种大流行在极端情况下可导致上百万人死亡。对流感病毒的遗传修饰或重配病毒的选择在技术上是可行的，能开发潜在的高毒力病毒以用作生物武器。一旦分离并鉴定一种新流感病毒，可在约6~8个月内开发出基于所批准原型的疫苗。由于新流感病毒株在少于3个月的时间内就能从局部爆发传播到各地，这种新高毒力流感病毒大流行情况中的延迟会使上百万人丧失生命。
[0006]因此，仍然需要通用流感疫苗来提供基线保护抵御多种流感病毒，包括新出现毒株。
[0007]附图简要说明
[0008]图1.图中显示初次接种两周后抗M2e的抗体水平。C57BL/6小鼠(n=10，6_8周龄)用IOiciVP (病毒颗粒)的AdC68-3M2eNP (本图中的名称，在序列号61/488，904中称为AdC68M2e (3) NP)初次免疫。与异源加强载体组合，用IOLD5tl的流感A/PR/8刺激后该方案提供80-90%存活率。平行注射相同剂量的具有和不具有转基因的衣壳修饰载体，产生显著提闻的抗体应答。
[0009]图2.六邻体修饰的载体的构建物。流程图显示六邻体Rl或R4修饰、缺失El的AdC68载体的克隆。图上方显示缺失El的AdC68分子克隆的完整序列，其包含用于切除六邻体编码基因的Mlu I位点。图下方从左到右显示了含有病毒六邻体的pcDNA3.1克隆，该六邻体包含用于向Rl或R4插入M2e序列的位点；M2e的插入位点；以及六邻体修饰的分子克隆。
[0010]图3.在非还原的条件下从HEK293细胞中分离蛋白，该细胞被携带天然(AdC68-rab.gp)、Rl-[AdC68_HxM2eS (Rl)]或 R4-[AdC68_HxM2eS (R4)]修饰六邻体的 AdC68载体感染，并用抗六邻体的单克隆抗体通过蛋白质印迹分析。抗β肌动蛋白的单克隆抗体用作加样对照。[0011]图4A-C.M2e的表达。用IO2或103vp载体/细胞感染HeLa细胞。24小时后，用M2e抗体(灰点)或阴性对照抗体(黑点)对细胞染色，然后用PE标记的二抗染色并用流式细胞术分析。直方图显示随着事件数的M2e表达水平。图4A，AdC68-HxM2eS(Rl);图4B, AdC68-HxM2eS (R4)；图 4C, AdC68-rab.gp。
[0012]图4D.用不同量的表达3M2eNP融合蛋白(作为转基因产物的)的载体感染细胞，并用抗M2e的单克隆抗体通过蛋白质印迹分析融合蛋白的表达。抗β肌动蛋白的抗体用作加样对照。
[0013]图4Ε用纯化的AdC68载体包被板，该载体携带天然六邻体或在Rl或R4中含有M2e的六邻体。封闭平板，用抗M2e的单克隆抗体处理，然后用碱性磷酸酶偶联抗体和底物孵育。用ELISA酶标仪测定颜色变化。图显示孔中底物的平均吸光度(土SD)，该孔中加入了不同稀释度的抗M2e的单克隆抗体。 [0014]图5.用在六邻体Rl或R4中携带M2e的载体或具有天然六邻体的载体(AdC68-rab.gp)免疫小鼠。测试血清中具有原初六邻体的AdC68载体的中和情况，该六邻体表达增强的绿色荧光蛋白(EGFP)。图中通过六邻体修饰载体诱导的抗体显示了具有天然六邻体的AdC68的中和效价倒数。
[0015]图6A-B显示针对M2e的体液应答。图6A，使用M2e肽ELISA以测定ICR小鼠(n=10)血清中M2e特异性抗体效价。初次免疫5周后(黑色柱)或加强免疫5周后(白色柱)收集血清。图6B，使用细胞ELISA以测定接种疫苗的C57B1/6小鼠(n=5)中的抗体。初次免疫2周后收集血清。图显示就单克隆M2e特异性抗体归一化的平均效价土SD。*P〈0.05。
[0016]图7.初次免疫5周后或加强免疫5周后，通过四聚体染色评价血液中NP特异性⑶8+T细胞频率。图中显示单独小鼠的NP特异性⑶8+T细胞平均频率土SD。*P〈0.05。
[0017]图8A-D显示测试抵抗A/PR8/34攻击的保护实验结果。C57B1/6小鼠(n=5，图8A和图B)或ICR小鼠(n=10,图8C和图8D)用不同载体免疫两次。经AdC68_3M2eNP初次免疫的小鼠用AdC6-3M2eNP加强免疫。用AdC68_rab.gp免疫的对照小鼠用AdC6_rab.gp加强免疫。其它组的小鼠用与初次免疫相同的载体加强免疫。加强免疫2个月后用IOLD5tl的A/PR8/34病毒攻击小鼠。图8A和图8C，图中显示攻击后的平均下降体重。图8B和8D，图中显示攻击后的存活率。
[0018]发明详述
[0019]本发明描述了抵抗流感病毒的强效通用疫苗，其提供了以下优点:用提供长达数年保护的疫苗取代每年的流感疫苗。另外，所述疫苗可提供抵抗循环流感毒株的经改善保护，该毒株无法精确预测以用于每年的疫苗生产。所述通用流感疫苗还可提供保护抵御可能会带来全球性大流行的新出现流感病毒株。
[0020]所述疫苗组合物基于衍生自黑猩猩的腺病毒(Ad)载体，例如AdC68 (也称为Sad-V25)。人体中仅发现抗这些病毒的预存在中和抗体具有低效价。所述AdC载体在载体颗粒主要外壳蛋白即六邻体(其在AdC病毒表面上以740个拷贝存在)的易接近环上表达线性和保守的B细胞表位，优选基质蛋白胞外域表位(M2e)。B细胞最优选由在颗粒上重复表达并以有序方式表达的抗原所诱导。以该形式排列的抗原与B细胞受体交联，从而启动B细胞活化并能引发强效的抗体应答。可溶性抗原可活化B细胞，但认为这需要较高浓度的抗原并且所得抗体应答在其特异性和结合强度方面可能质量较低。[0021]M2e可衍生自任何甲型流感毒株，包括但不限于:H1N1 (如A/PuertoRico/8/1934;A/Fort Monmouth/1/1947)、 H5N1 (如 A/Hong Kong/483/1997)、 H7N2(如 A/Duck/Tasmania/277/2007)、H1N2 (如 A/Swine/Korea/CY02/02)、H2N2 (如 A/Leningrad/134/17/57)、和 H3N2 (如 A/New York/392/2004) ?
[0022]在一些实施方式中，M2e插入六邻体蛋白。在一些实施方式中，M2e插入六邻体蛋白的高变区1(R1)。在一些实施方式中，示于SEQ ID N0:6的六邻体蛋白氨基酸142~144被删除，并在该位置插入M2e。在一些实施方式中，M2e插入六邻体蛋白的高变区4 (R4)。在一些实施方式中，M2e插入示于SEQ ID N0:6的六邻体蛋白氨基酸253和254之间。可用标准的重组DNA方法删除六邻体蛋白的编码序列并在该删除位置插入M2e的编码序列。参见下述特定实施例。
[0023]因为AdC衣壳只在相对较短时间内可接近直至病毒进入细胞，此时六邻体被降解，在一些实施方式中，Ad载体还编码融合蛋白，包括额外的M2e表位，优选衍生自多至三种不同的甲型流感病毒株，其由置于AdC载体中已删除El结构域内的表达盒以串联形式表达。表达盒的M2e抗原表达可有助于延长B细胞应答。抵抗甲型流感感染的保护水平可随CD8+T细胞针对流感病毒保守蛋白(例如腺病毒核蛋白(NP))的伴随活化而提高。因此，在一些实施方式中，AdC载体还编码NP，其表达为与M2e表位相连的融合蛋白。可使用标准重组核酸技术(例如下文实施例所述)来构建编码融合蛋白的核酸分子(核糖核酸或脱氧核糖核酸)。
[0024]在一些实施方式中，融合蛋白包括(I)来自第一甲型流感病毒株的第一基质蛋白胞外域(M2ei);和(2)来自第二甲型流感病毒株的核蛋白(NP)。在一些实施方式中，融合蛋白还包含来自第二甲型流感病毒株的第二基质蛋白胞外域(M2e2)。在包含两个基质蛋白胞外域和一个核蛋白的实施方式中，三个组分中至少两个来自不同的甲型流感病毒株。在其它实施方式中，所有三个组分来自不同的甲型流感病毒株。两个(或三个)组分可任意排序。在一些实施方式中，融合蛋白的M2e组分衍生自与插入六邻体蛋白的M2e相同的甲型流感病毒株。在一些实施方式中，融合蛋白的M2e组分衍生自与插入六邻体蛋白的M2e不同的甲型流感病毒株。
[0025]在一些实施方式中，融合蛋白包含四个组分，所述组分衍生自至少两个不同甲型流感病毒株:(I)来自第一甲型流感病毒株的第一基质蛋白胞外域(M2ei) ；(2)来自第二甲型流感病毒株的第二基质蛋白胞外域(M2e2) ；(3)来自第三甲型流感病毒株的第三基质蛋白胞外域(M2e3);以及(4)来自第四甲型流感病毒株的核蛋白(NP)。
[0026]可获得融合蛋白组分的合适甲型流感病毒包括:H1N1 (如A/PuertoRico/8/1934;A/Fort Monmouth/1/1947)、 H5N1 (如 A/Hong Kong/483/1997)、 H7N2(如 A/Duck/Tasmania/277/2007)、H1N2 (如 A/Swine/Korea/CY02/02)、H2N2 (如 A/Leningrad/134/17/57)、和 H3N2 (如 A/New York/392/2004) ?
[0027]在一些实施方式中，第一毒株是HlNl毒株。在一些这类实施方式中，HlNl毒株是A/Fort Monmouth/1/1947。在其它实施方式中，HlNl 毒株是 A/Puerto Rico/8/1934。
[0028]在一些实施方式中，第一毒株是H5N1毒株。在一些这类实施方式中,H5N1毒株是A/Hong Kong/483/1997。
[0029]在一些实施方式中,第一毒株是H7N2毒株。在一些这类实施方式中,H7N2毒株是A/Duck/Tasmania/277/2007。
[0030]在一些实施方式中，第四毒株是HlNl毒株。在一些实施方式中，第一和第四毒株是HlNl毒株且可以相同或不同。在一些这类实施方式中，第一 HlNl毒株是A/FortMonmouth/1/1947。在其它实施方式中，第一 HlNl 毒株是 A/Puerto Rico/8/1934。
[0031]在一些实施方式中，四个组分从N至C末端排序为:M2ei—M2e2—M2e3—NP。在一些实施方式中，NP 和 Μ2θι 来自 A/Puerto Rico/8/1934 ；Μ2θι 来自 A/HongKong/483/1997 ；且M2e3来自A/Duck/Tasmania/277/2007。在其它实施方式中，来自三个毒株的M2e组分按HlNl-H5N1—H7N2 排序。
[0032]在任何实施方式中，插入衣壳中的M2e可衍生自与第一毒株(例如H1N1, H7N2, H5N1,或H7N2)、第二毒株或第三毒株相同的毒株，或可从第四毒株获得。
[0033]在其它实施方式中，Ad载体编码融合蛋白但不包括修饰的六邻体蛋白。
[0034]已完善Ad载体的生成、纯化和质量控制方法(Tatsis和Ertl，MolTherlO:616-29, 2004)。Ad载体诱导先天免疫应答，缓解了添加佐剂的需求。它们也诱导极强的B细胞和CD8+T细胞应答，该应答由于载体低水平的持久性可显著维持(Tatsiset等，BloodllO: 1916-23 ，2007)。针对Ad病毒的普通人血清型(如血清型5)的预存在中和抗体会影响疫苗功效，这可通过使用来自其他物种例如黑猩猩的血清型(该血清型通常不在人类中传播，也不与人血清型交叉反应)容易地避免(Xiang等，Emerg InfectDisl2:1596-99, 2006)。在需要初免-加强方案来实现足够效力的免疫应答的情况中，可使用基于不同Ad血清型的载体(Tatsis和Ertl, 2004)。Ad病毒和Ad载体已广泛用于临床，其中所述病毒和载体良好耐受。它们可经多种途径施予，包括粘膜途径，如气道(Xiang等，J Virol77:10780-89，2003)或甚至在包封后口服，如美国军队使用的针对Ad病毒4和7的疫苗所示(Lyons 等，Vaccine26:2890-98，2008)。
[0035]可使用标准技术配制免疫原性组合物，除上述腺病毒载体以外，所述组合物还可包括药学上可接受的载剂例如磷酸盐缓冲液盐水(PBS)或其它缓冲液，以及其它组分例如抗细菌剂和抗真菌剂、等张剂和吸收延迟剂、佐剂等。在一些实施方式中，该组合物是疫苗组合物并可与一种或更多种其它疫苗联合给予，所述其它疫苗包括其它流感疫苗(例如季节性疫苗)。在一些实施方式中，其它流感疫苗是基于肽的通用流感疫苗(例如美国专利7，354，589 和美国专利 7，527，798)。
[0036]可将所述免疫原性组合物和疫苗给予需要的个体，包括人、猪、狗、雪貂和其它哺乳动物，从而诱导针对衍生所述组分的毒株以外的甲型流感病毒株的免疫应答。在一些实施方式中，根据“初免一加强”方案给予，其中至少第二剂量(“加强”)疫苗在第一剂量的一段时间后(例如第一剂量后1、2、3、4、5、6、7、8、9或10周或更久，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更久)提供。可用相同剂量或不同剂量加强免疫。在任何这些实施方式中，可给予相同的免疫原性组合物或不同的免疫原性组合物。例如，融合蛋白或修饰的六邻体蛋白可用于初次和加强免疫。在其它实施方式中，融合蛋白用于初次免疫，修饰的六邻体蛋白用于加强免疫。在其它实施方式中，修饰的六邻体蛋白用于初次免疫，融合蛋白用于加强免疫。在一些实施方式中，用修饰的六邻体蛋白和融合蛋白实施初次免疫，用修饰的六邻体蛋白或融合蛋白或两者实施加强免疫。
[0037]在一些实施方式中，给予包含经修饰六邻体蛋白和/或融合蛋白的Ad载体。所给予的一般病毒剂量范围为IO7~IO11病毒颗粒(如107、5xl07、108、5xl08、109、5xl09、101Q、δχΙΟ'ΙΟ11)。在一些实施方式中，给予融合蛋白或编码该融合蛋白的核酸分子。
[0038]给予方法包括但不限于:粘膜(例如鼻内)、腹膜内、肌内、静脉内和口服给予。免疫应答可用本领域已知的合适方法评估，包括下述具体实施例中教导的那些。
[0039]本领域的技术人员应理解，对上述实施方式的许多变化和变换在所附权利要求的范围之内。
[0040]实施例1
[0041]载体的构建和体外筛选
[0042]1.1.载体的构建和质量控制
[0043]可用标准技术制备在病毒六邻体中携带M2e序列的AdC6和AdC68载体。用标准克隆方法和序列鉴定完成Ad六邻体的修饰，随后在El中插入表达盒并用Southern印迹方法或测序确认。通过该分子可用的晶体结构引导将M2e表位置于AdC68六邻体中。AdC6属于相同血清型，但对于可变区，与AdC68具有较高程度的序列同源性，这能鉴定下文所示的Rl (序列号 61/488，904 中称为“VR1”)，比较了 AdC6 和 AdC68 的 Rl (序列号 61/488，904 称为“VR1”)六邻体序列和其侧翼区域。Rl (序列号61/488，904中称为“Vrl”)用粗体表示，AdC68六邻体中的插入位点用下划线表示。
[0044]AdC68 (SEQ ID NO:1)
[0045]YNSLAPKGAPNTCQWTYKADGETATEKTYTYGNAPVQGINITKDGIQLG TD
[0046]AdC6 (SEQ ID NO:2)
[0047]YNSLAPKGAPNSSQWEQAKTGNGGTMETHTYGVAPMGGENITKDGLQI GTD
[0048]该分子病毒克隆可在HEK293细胞上拯救。一旦可观察到病毒空斑(一般5~14天后)，收集细胞并通过冻融释放病毒。然后病毒可在HEK293细胞中增殖数代。产生大规模母液后(40~50个T75烧瓶)，病毒可纯化、滴定并进行质量控制。
[0049]1.1.2.纯化
[0050]Ad载体可通过两轮CsCl梯度的浮力密度超离心进行纯化，随后进行柱纯化(Bio-Gel P-6DG)，之后用补充有10%甘油的PBS稀释并在_80oC下保存。
[0051]1.1.3.滴定
[0052]病毒颗粒(vp)含量可通过分光光度计在260nm和280nm检测，后者检测制品的纯度。病毒滴度(vp/ml)可用以下公式测定=OD26tlX稀释度xl.1xlO120 FDA要求根据测定载体毒性的vp给予腺病毒载体。另一方面载体免疫原性取决于能感染细胞并转录转基因产物的病毒颗粒数。通常，通过采用琼脂糖涂覆的空斑试验或终点稀释试验(测定细胞病变效应)测定感染性病毒颗粒数。两种实验都能在反式提供El的细胞系中实施。空斑形成取决于病毒因子数而不能可靠地反映细胞系和缺失El的AdC载体间的相互关系。
[0053]可采用两个替代性实验来测定腺病毒批次的感染性。用标准空斑实验检测实验有效性，两个实验都显示出相同的敏感性。该实验的一种形式中，通过以下方式测定感染性病毒颗粒含量:用转基因或Ad (六邻体)特异性引物对分离自HEK293细胞的RNA进行嵌套式RT-PCR，该细胞用连续稀释的载体感染5~7天。纳入控制实验的标准。该实验针对所有AdC载体。
[0054]在第二个实验中，用不同浓度的载体对HEK293细胞感染7天，然后用抗六邻体保守区域的抗体染色，并用经碱性磷酸酶标记的二抗复染。该实验用于检测具有未修饰六邻体的Ad载体。不适于检测具有Rl (序列号61/488，904中称为“VR1”)修饰六邻体的Ad载体。
[0055]在其它实施方式中，用抗M2e的单克隆抗体染色以检测M2e修饰载体的六邻体。用不同浓度的M2e六邻体修饰载体感染HEK293细胞。根据上文所示完成实验，但用抗M2e的单克隆抗体取代抗六邻体的抗体。
[0056]1.1.4.常规质量控制(QC)
[0057]载体可在就动物试验进行释放前接受一系列质量控制。可在A549细胞上检测载体批次的复制型Ad (RCA)0由于HEK293细胞和载体间的重叠病毒序列发生重组，复制型腺病毒(RCA)会在HEK293细胞中El缺失复制缺陷型Ad载体的创建及增殖期间出现。根据载体制备中的RCA水平，其会显著影响体内实验的载体性能、宿主免疫应答和毒性概况。因此，对于Ad载体的基因转移和基于病毒的疫苗应用而言，鉴定载体制备是否存在高水平RCA污染尤其重要。
[0058]简而言之，用2xl09、2xl01Q和2χ10ηνρ的载体处理6孔板中的细胞。对照孔用10或50空斑形成单位(pfu)的相应野生型Ad病毒感染。第三组孔中，加入具有感染病毒(1，10，和IOOpfu)的复制缺陷型载体(2X10nvp)以确保形成不受到所用载体空斑剂量的抑制。细胞可用琼脂糖覆盖。4天和8天后读板。RCA通常污染在ΗΕΚ293细胞中生长的缺失El的人血清型5Ad(AdHu5)载体， 但由于El侧翼区域的序列差异，用AdHu5的El反式补充的El缺失AdC载体没有检测到。
[0059]可测试批次以检测和定量测定测试物中的革兰氏阴性菌内毒素水平。例如，可使用鲎变形细胞裂解物(LAL)凝胶法和市售试剂盒进行。可设置用于大型动物实验的载体批次释放标准，例如〈5内毒素单元(EU)/kg动物体重,其为FDA的人设置参数。
[0060]也可评价载体无菌性。该实验目的是通过接种/扩增和平板接种方法测试Ad载体制品的无菌性。简而言之，先接种对照和测试制品，并在LB培养基中过夜搅拌培养。然后将培养物接种于LV琼脂平板上孵育48小时以检测细菌克隆的形成和真菌生长。对照可以是连续稀释并在相同条件下培养的菌株DH5ci。
[0061]大规模载体批次的遗传完整性和和特性可通过病毒DNA分离评估。用一组限制性酶(与分子克隆平行)消化重组DNA并用凝胶电泳分析。因为所述载体通过构建分子克隆并在HEK293细胞中拯救/扩增而产生，用于产生分子克隆的原始分子克隆和穿梭质粒可在有提取自载体制剂的病毒DNA的并行限制性消化中使用从而通过溴化乙啶染色琼脂糖凝胶电泳来比较标签带型。另外，分析可包括不含转基因盒的载体骨架的分子克隆。通常选择至少两组限制性酶用于分析。一组聚焦于检测转基因盒的存在和完整性；另一组重点在载体骨架。载体遗传稳定性可在HEK293细胞中连续传代12~15代后通过Southern印迹测试。
[0062]可在用1，000和10，OOOvp/细胞的新载体感染CHO细胞后通过蛋白质印迹或免疫沉淀测试转基因产物的表达，所述CHO细胞稳定转染从而表达柯萨奇腺病毒受体(CH0-CAR)。用相同剂量的表达不相关转基因产物的Ad载体感染对照细胞。用抗M2e的单克隆抗体通过纯化病毒的蛋白质印迹测定修饰的六邻体表达。可建立早期传代主病毒库(40瓶各0.5ml+10瓶0.1ml)，并从该库获得载体。该主病毒库耗尽后，可从分子克隆中重新获得感染性Ad载体来建立新的主病毒库。遗传稳定性可通过连续扩增(15)载体然后Southern印迹测试以确保载体未经重组。
[0063]1.1.5.释放标准
[0064]大规模载体制备的产率通常 > 每批次IO13Vp (约IO8个HEK细胞)。AdC载体的Vp与感染单位之比通常高于人血清型Ad载体，通常范围为1:20~1:200，但最高>1:400。
[0065]实施例2
[0066]载体在幼鼠中的免疫原性和效力
[0067]在年幼(6~8周龄)的C57B1/6小鼠组(组规模:每组8只小鼠)中评价免疫原性。不具有六邻体修饰的原型AdC68-3M2eNP和AdC6_3M2eNP载体(序列号61/488，904中分别称为“AdC68M2e (3) NP和AdC6M2e (3) NP载体”)已被广泛测试并用于比较。 [0068]2.1.原初小鼠中的免疫原性
[0069]在剂量递增实验中测试4种载体，即有和没有六邻体修饰的AdC68_3M2eNP和AdC6-3M2eNP (序列号 61/488，904 中分别称为 “AdC68M2e (3) NP 和 AdC6M2e(3)NP 载体)，其中对8只幼鼠经肌内注射IO8UO9或IOltVp的载体。表达不相关抗原(即狂犬病病毒糖蛋白)的载体用作阴性对照。小鼠在免疫后2、4、8周取血。
[0070]分离外周血单核细胞(PBMC)并采用对NP免疫优势表位特异的I类MHC四聚体染色来测试NP-特异性CD8+T细胞的频率。免疫接种三个月后对小鼠实施安乐死。通过以下方法就NP特异性T细胞频率测试从血液、脾脏和肺中分离的淋巴细胞群:在布雷菲德菌素存在下用携带免疫优势I类MHC结合表位的NP肽刺激细胞，然后进行胞内细胞因子染色。具体地，测试细胞中IFN-Y、IL-2、TNF-a、MIP-1a和穿孔蛋白的产生。胞内染色前，对细胞表面染色0)3、0)8、0)4、0)44和0)62匕染色细胞用BD稳定固定剂(BD StabilizingFixative) (BD生物科技公司(BD Biosciences),加利福尼亚州圣何塞)固定，并通过FACS用LSRII台式流式细胞仪(BD生物科技公司，加利福尼亚州圣何塞)和FACSDIVA?软件分析。在至少100，000事件中进行样品的流式细胞术采集和分析。用FlowJo (树星公司(TreeStar),俄勒R州艾士兰)做采集后分析。有BD?CompBeads抗小鼠Ig κ (BD生物科技公司，加利福尼亚州圣何塞)的单色控制用做补偿。
[0071]通过在包被有M2e肽的平板和包被有经全长M2转染细胞或假转染细胞的平板上进行ELISA来测试血浆中抗M2e的抗体。为进一步定量分析B细胞应答，测试分离自脾脏和骨髓的细胞中的抗体分泌细胞(ASC)。96孔板(丨MMOB丨1^^1膜；MAIPN4510;密理博(Millipore),马塞诸塞州比尔瑞卡)用溶于磷酸盐缓冲盐水的10 μ g/ml浓度M2e肽在4°C包被过夜，以检测M2e特异性ASC，或用溶于PBS的4 μ g/ml浓度的亲和纯化羊抗人免疫球蛋白A (IgA)加gG和IgM (H+L;KP公司(Kirkegaard&Perry),马里兰州盖瑟斯堡)包被以测定ASC的总频率。用PBS包被的平板作为阴性对照。平板在4°C下孵育过夜，并用补充有10%胎牛血清的RPMI1640培养基37°C封闭2小时。在补充有10%FBS和0.5 μ g/ml磷酸盐偶联羊抗人IgG (H+L)抗体的RPMI培养基中重悬PBMC。以2xl05细胞/孔向平板加入细胞。在37°C下孵育过夜。次日清洗平板并用碱性磷酸酶底物处理。通过自动ELISpot读板仪计数斑点来测定每孔的ASC数。数据按每IO6个细胞的斑点记录。M2e特异性ASC记录为分泌抗任一甲型流感病毒株的抗体的细胞相对分泌Ig的细胞的百分数。
[0072]根据Crotty等(17)所述进行ELISpot实验来测试记忆B细胞。将PBMC以5X IO5细胞/孔接种在补充有伴刀豆球蛋白提取物、6 μ g/ml CpG寡核苷酸0DN-2006 (英维杰公司(Invivogen),加利福尼亚州圣地亚哥)和1/10，000稀释的固定金黄色葡萄球菌Cowan(西格玛公司(Sigma))的培养基内。对照孔不加入促分裂原。细胞培养5天，然后根据上文所述用ELISpot实验测试分泌IgG的B细胞和M2e特异性、分泌IgG的B细胞。从促分裂原刺激的孔的斑点中减去含对照细胞的孔的斑点。根据上文所述记录其它数据并做质量控制。在实施安乐死时收集血浆，再用肽ELISA测试抗M2e的抗体。测定抗体的同种型。通过BIACOREli亲和测试分析抗体质量。测试血浆中针对野生型Ad载体和六邻体修饰Ad载体的中和抗体。
[0073]2.2初免加强方案的免疫原性
[0074]为选择两组载体(即具有或不具有六邻体修饰)中更强的免疫原性，通过以下方式进行初免加强方案:用AdC68初次免疫然后AdC6加强免疫以及AdC6初次免疫然后AdC68加强免疫的相反方案。表达狂犬病糖蛋白的AdC载体作用阴性对照。用IO8~IOltVp的载体经肌内对小鼠初次免疫；两个月后用异源载体对它们进行加强免疫。根据2.1所述评价免疫应答。
[0075]2.3经历过流感病毒的小鼠的免疫原性
[0076]在多数成人中，流感疫苗接种引发大量针对更保守抗原的B细胞和T细胞回忆应答，其由之前的感染或疫苗接种所诱导。由于次级应答相比初始应答遵循不同规则且一般能由较低剂量抗原引发，根据上述方法(只使用其中一个方案，即先用AdC68再用AdC6或其相反方案)在小鼠中进行初免加强，该小鼠在6周龄时接受105TCID50的流感病毒A/X31(—种小鼠减毒H3N2株，只引起上呼吸道感染因此不会导致疾病)免疫接种。两个月后用AdC疫苗对它们进行初次免疫，随后用异源AdC载体进行加强免疫。根据2.2的结果选择载体剂量以及初次和加强免疫的间隔。根据2.1所述监控免疫应答。
[0077]2.4幼鼠中的疫苗效力
[0078]单一剂量疫苗的保护。在以下两个鼠品系中进行这些测试:C57Bl/6小鼠，能测试T和B细胞应答；和ICR小鼠，经杂交后不能测试CD8+T细胞应答但提供更实际的人用模型。小鼠经肌内免疫接种。在原初小鼠和用A/X31预感染的小鼠中测试单次免疫方案，并测定保护持续时间。攻击使用异源HlNl病毒-甲型流感病毒Mammoth Fort Worth，(A/FM)，其已在小鼠中滴定测定了平均致死剂量。攻击病毒的量可变。在初始实验中以IOLD5tl使用病毒。若得到针对该剂量的保护，可将攻击剂量提高至1000LD5tl以测定保护的稳健性。通过测量体重下降和伦理性(一旦减少其原始体重的30%就对幼仔实施安乐死)以及氧饱和度在攻击后3、5和7天评价保护。攻击后4天和7天测定肺病毒滴度。同时评价肺叶组织学情况以测定病理程度。
[0079]初免一加强的保护。用不同浓度的所选AdC载体以2个月间隔对小鼠经肌内免疫接种。后续实验中该间隔变为4~6个月。一组在接种疫苗2个月后用IOLD5tl流感病毒A/FM攻击；另一组在接种疫苗8个月后攻击。接种疫苗后，测定抗M2e的抗体效价和NP特异性⑶8+T细胞的频率。检测重量下降和伦理性。若保护到达两个时间点(即至少80%接种过疫苗的小鼠存活，同时至`少80%对照小鼠死亡)，以接种疫苗8个月后进行攻击的方式重复测试。
[0080]攻击后第4和7天对小鼠实施安乐死，并通过以下方式测定肺病毒滴度:在MDCK细胞中滴定肺匀浆上清液，然后根据Rowe等，J Clin Microbiol.37:937-43，1999所述进行血凝实验。一个肺切片用于组化分析。用PBS灌注肺并用200μ L的10%福尔马林溶液通过30g针头使其温和膨胀。将一个膨胀的肺叶在10%福尔马林中4°C浸没24小时以用于固定组织。经福尔马林固定的肺样品用石蜡包埋并以4 μ m切片以安装在显微镜载玻片上。用H&E对切片染色，检测每个肺的两个切片。由对样品来源不知情的研究人员检测组织病理学变化。按照下述方法对肺病理学情况打分:1 -无病变；2 -血管周围浸润；3 -影响< 20%肺叶的血管周围和间质浸润；4 -影响< 20-50%肺叶的血管周围和间质浸润；5 -影响> 50%肺叶的血管周围和间质浸润。在年幼ICR小鼠中测试诱导C57B1/6小鼠内保护的方案(与阳性和阴性对照载体一起)以确保能在杂交小鼠中实现保护。
[0081 ] A/X31预接触小鼠的保护
[0082]由于先前的感染/疫苗接种，多数人有用流感病毒的免疫经历。为评价预接触A/X31对疫苗功效的影响，用1000TCID50的该病毒鼻内感染ICR小鼠；然后用包括对照载体的单次剂量方案对其免疫接种，并用高剂量A/FM病毒攻击小鼠。通过测量体重下降、存活率和氧饱和度评价保护。
[0083]年老 小鼠中的免疫原性和功效。流感在年长者中的致死性不均一，这缘于其免疫系统的总体损伤不能产生足够的应答。不幸的是，可用的流感疫苗也在年长者中显示功效有限。在19~21月龄的年老C57B1/6小鼠中测试疫苗方案。为模拟人体中活流感病毒的预接触，用低剂量(1000TCID50)的A/X31(H3N2)病毒感染8~9月龄的C57B1/6小鼠。在一些实施方式中，在19月龄时对小鼠初次免疫，在21月龄时加强免疫，在23或25月龄时攻击小鼠。如上所述对每组10只小鼠进行免疫原性研究，刺激实验用每组20只小鼠。用低剂量A/FM攻击病毒(3LD5CI)进行初始测试。在一些实施方式中逐渐递增攻击病毒剂量(10，100，1000LD50)。
[0084]实施例3
[0085]大型动物中的疫苗效力
[0086]雪貂对人流感毒株高度易感，并被视为合适的流感病毒感染预临床模型。其它模型是非人的灵长类攻击模型。使用当代HlNl病毒的雪貂实验以生物安全水平2使用；用于攻击非人类灵长类的病毒是高度致病性H5N1病毒，以生物安全水平3+进行，所述生物安全水平经⑶C和USDA批准。
[0087]3.1.雪貂模型
[0088]根据上述方式对年幼雪貂(n=6)接种疫苗。对另外6只对照动物接种表达狂犬病毒糖蛋白的AdC载体。以IOicVp1.m给予疫苗。初免一加强方案的情况中，对动物进行初次和加强免疫。根据小鼠实验的结果确定初次和加强免疫之间的时间。以2周的间隔监控血清中抗M2e的抗体。作为阳性对照，在初次免疫其它动物同时，对额外6只雪貂接种1/10人剂量的季节性流感疫苗(TIV)。给予最终AdC疫苗剂量2个月后，用2009H1N1病毒攻击雪貂，这会在该种类中引起疾病但不致死。攻击后，监控雪貂疾病情况(发热，体重下降)。在攻击后第5和7天从支气管灌洗液中测定病毒滴度，用血清测定对M2e和攻击病毒的抗体应答。
[0089]3.2非人类灵长类模型
[0090]先对印度来源的猕猴(每组6只)测试抗疫苗载体的中和抗体。只有缺乏该抗体的动物可纳入实验。用IO1Vp的AdC疫苗(表达流感病毒抗原或狂犬病毒糖蛋白)对动物接种。如果小鼠实验显示用异源载体可提高疫苗效力，则对它们进行加强免疫。根据小鼠实验的结果确定初次和加强免疫之间的时间。将另外6只动物纳入实验并在实验动物初次免疫同时接种人剂量的当代流感疫苗(TIV)。用A/Vietnam/1203/2004 (H5N1)株攻击所有动物，以浓度为1x10650%的蛋感染剂量气管内给予镇静动物。一天两次监控体重、温度和食物摄入，在第2、4、6和8天从气管灌洗液中测定病毒滴度。在动物发展出必需实施安乐死的症状时，从HE染色肺切片中评价组织病理学情况。
[0091]接种疫苗并在攻击后第5天和第10天如下评价免疫应答。在各疫苗剂量后第O、
7、21、42和84天采集血液。就抗M2e的抗体测试血清。通过微中和实验监控来自阳性对照动物的血清中抗相应毒株的抗体。通过ELISpot测试第O天和第7天收集的PBMC中的M2e特异性抗体分泌细胞。根据下文用ICS测试在其它时间点(接种疫苗前)所采集PBMC中针对NP的T细胞应答。用NP肽库刺激PBMC(以每毫升各2 μ g肽的浓度使用重叠10个氨基酸的15聚体肽)。对细胞初始冷冻，从而可平行进行各单独动物的实验。解冻冷冻细胞并立即用补充有2单位/ml DNase I的HBSS清洗，重悬于RPMI培养基并用抗⑶28 (克隆⑶28.2)、抗⑶49d(克隆9F10)和Brefeldin A.14刺激6小时。用紫色荧光活性染料太平洋蓝(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)、抗⑶14太平洋蓝(克隆M5E2)，、抗⑶16太平洋蓝(克隆 3G8)，、抗 CD8-APC-H7 (克隆 SKl)、抗 CD4_Alexa700 (克隆 0KT4)、抗 CD95_PE_Cy5 (克隆DX2)、和抗CD28-德克萨斯红(克隆CD28.2，贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)，加州富勒敦)在4°C下染色细 胞30分钟。另外，用抗CCR7-PE (克隆150503)对细胞染色(冷冻细胞)。
[0092]用CYTOFIX/CYTOPERM(BD生物科技公司，加州圣何塞)在4 °C固定并透化30分钟后，细胞用抗正^^-六卩(:(克隆827)、抗11^2411'(:(克隆1?1-17!112)、抗 TNF-a-PE_Cy7(克隆 MAbll,安迪生物(R&D System))和抗 CD3_PerCp-Cy5.5 (克隆SP34-2)在4°C染色30分钟。对细胞清洗两次，用BD稳定固定剂(BD生物科技公司，加州圣何塞)固定然后用LSR II台式流式细胞仪(BD生物科技公司，加州圣何塞)和FACSDIVA?软件通过FACS分析。在至少400，000事件中进行样品的流式细胞术采集和分析。用FlowJo (树星公司(TreeStar),俄勒冈州艾士兰)做采集后分析。病毒感染后第10天测试攻击后的血清中抗攻击病毒的中和抗体。
[0093]实施例4
[0094]实施例5~9的材料和方法
[0095]1.构建六邻体修饰的AdC6载体
[0096]如下生成表达六邻体中M2e肽的AdC68载体:从AdC68的El缺失病毒分子克隆中释放编码大部分六邻体序列并侧接有MluI的片段，克隆到pcDNA3.1载体(英杰公司，加利福尼亚州卡尔斯巴德)中。删除六邻体残基142~144(ETA)后，将编码LTEVETPIRNEWG(SEQID NO: 3)的A/PR8/34病毒的M2e序列部分克隆到六邻体的Rl中。为了产生R4修饰载体，在六邻体残基253和254之间插入相同的M2e序列。
[0097]通过测序鉴定编码碱基对的M2e的正确插入后，从pcDNA3.1载体切除六邻体序列并克隆回病毒分子克隆。对于相同载体，将含有上述3M2eNP序列(42)的表达盒在CMV早期启动子的控制下置入El中。使用重组病毒分子克隆在HEK293细胞中拯救病毒。病毒在HEK293细胞中扩增，通过氯化铯密度梯度离心纯化并用分光光度法在260nm测定病毒颗粒(vp)含量。用基于PCR的方法滴定载体从而测定感染单位(IU)。
[0098]表1列出了本说明书全文所用的新载体和名称以及相关生长特性例如每108HEK293细胞的产率及vp与IU之比。其它Ad载体例如C68_rab.gp载体，表达GFP的Ad载体或表达3M2eNP融合蛋白的AdC载体已在上文中描述(37，38)
[0099]或用上文所述克隆技术产生(43 )。
[0100]表1
[0101]
【权利要求】
1.一种经修饰的腺病毒六邻体蛋白，所述蛋白包含来自第一甲型流感病毒株的第一基质蛋白胞外域(M2ei)，所述M2ei插入所述六邻体蛋白的高变区中。
2.如权利要求1所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白，其特征在于，所述M2ei插入高变区I中。
3.如权利要求1所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白，其特征在于，所述M2ei取代高变区I中的三个连续氨基酸。
4.如权利要求1所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白，其特征在于，所述M2ei取代SEQIDNO:6所示六邻体蛋白中的氨基酸142~144。
5.如权利要求1所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白，其特征在于，所述M2ei插入高变区4中。
6.如权利要求1所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白，其特征在于，所述M2e插入SEQIDNO:6所示六邻体蛋白的氨基酸253和254之间。
7.如权利要求1~6中任一项所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白，其特征在于，所述第一流感病毒株选自HlNl株、H5N1株、H7N2株、H1N2株、H2N2株和H3N2株。
8.一种融合蛋白，所述蛋白包含: 来自第二甲型流感病毒株的第二基质蛋白胞外域(M2e2);和 来自第三甲型流感病毒株的第三基质蛋白胞外域(M2e3);和 来自第四甲型流感病毒株的第四基质蛋白胞外域(M2e4)； 其中所述第二、第三和第四毒株中至`少两个是不同的毒株。
9.如权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述蛋白还包含来自第五甲型流感病毒株的核蛋白(NP)。
10.如权利要求8所述的融合蛋白，其特征在于，所述述融合蛋白的组分从N至C末端排序为:M2e2—Μ2θ3—Μ2θ4—NP。
11.如权利要求8~10中任一项所述的融合蛋白，其特征在于，所述第二流感病毒株选自 HlNl 株、Η5Ν1 株、Η7Ν2 株、Η1Ν2 株、Η2Ν2 株和 Η3Ν2 株。
12.—种编码权利要求1~7中任一项所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白或权利要求8~11中任一项所述融合蛋白的核酸分子。
13.—种包含如权利要求1~7中任一项所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白的腺病毒。
14.一种包含如权利要求12所述核酸分子的腺病毒。
15.如权利要求14所述的腺病毒，其特征在于，所述腺病毒还包含如权利要求1~7中任一项所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白。
16.一种免疫原性组合物,所述组合物包含: 免疫原性组分；和 药学上可接受的载剂， 其中所述免疫原性组分选自权利要求1~7中任一项所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白；权利要求8~11中任一项所述的融合蛋白；权利要求12所述的核酸分子；和权利要求13~15中任一项所述的腺病毒。
17.一种诱导针对甲型流感病毒的免疫应答的方法，所述方法包括向需要所述组合物的个体首次给予权利要求16所述的免疫原性组合物。
18.如权利要求17所述的方法，其特征在于，所述方法还包括再次给予所述组合物。
19.如权利要求17或18所述的方法，其特征在于，所述首次给予或再次给予选自下组:粘膜、口服、肌内、静脉内和腹膜内给予。
20.如权利要求17~19中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫应答包括抗体形成。
21.如权利要求17~19中任一项所述的方法，其特征在于，所述免疫应答包括⑶8+T细胞活化。
22.权利要求16所述免疫原性组合物在针对甲型流感病毒的免疫接种中的应用。
23.权利要求16所述免疫原性组合物在治疗或预防疾病中的应用。
24.权利要求1~7中任一项所述的经修饰腺病毒六邻体蛋白；权利要求8~11中任一项所述的融合蛋白；权利要求12所述的核酸分子；或权利要求13~15中任一项所述的腺病毒在制造用于诱导 针对甲型流感病毒的免疫应答的药物中的应用。
【文档编号】A61K38/16GK103732249SQ201280024949
【公开日】2014年4月16日 申请日期:2012年5月23日 优先权日:2011年5月23日
【发明者】H·C·埃特尔, 周东明 申请人:威斯特解剖及生物研究所