专利名称：Ngr-vegi融合蛋白及其编码基因与表达纯化方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种NGR-VEGI融合蛋白及其编码基因与表达纯化方法。
背景技术：
众所周知血管形成是实体肿瘤生长的限速步骤，肿瘤生物治疗是近年来发展的继手术、放疗、化疗之后肿瘤治疗方法学中的又一重要手段。由于肿瘤的生长、局部浸润与转移均依赖于肿瘤新血管的形成，使得抗血管生成治疗成为了肿瘤生物治疗研究领域的热点之一。新生血管常高表达一些在正常血管低表达甚至无表达的分子标志，包括av3 3和a 5整合素、氨肽酶N、血管生长因子受体、基质金属蛋白酶(氨肽酶N属于基质金属蛋白酶)等。靶向分子的单克隆抗体具有高特异性，但其生产成本较高、长期使用有诱发产生抗抗体的风险。其它非抗体类制剂由于靶向性较差，使用剂量偏高，容易诱发毒副作用。虽然肿瘤血管祀向基序，包括RGD基序和NGR基序等，可以大幅度提闻非抗体类生物制剂的肿瘤靶向性和肿瘤控制率并可在一定程度上减少使用剂量，但其仍存在使用周期长、不具备直接肿瘤细胞杀伤作用等缺点。VEGI又称TNFSF-15，是肿瘤坏死因子家族成员，作为内皮细胞特异性基因，重组VEGI能有效抑制内皮细胞增生、血管形成和肿瘤生长。VEGI对内皮细胞的作用表现为可使生长刺激作用下的G0/G1细胞阻滞在Gl期，另外可以诱导增生的内皮细胞凋亡。人VEGI基因长约17kb，由4个外显子构成，可产生3个剪接变异体，分别为VEG1-174、VEG1-192和VEG1-251。资料表明VEGI可以通过高效抑制肿瘤血管形成，达到有效控制肿瘤演进并诱发肿瘤消退，因此VEGI可以作为一种新的抗血管生成制剂用于恶性肿瘤治疗，但是单纯VEGI在肿瘤部位富集性差。
发明内容
本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种NGR-VEGI融合蛋白基因。该基因将NGR基序的肿瘤血管靶向性和VEGI较强的抗肿瘤血管生成作用结合在一起，利用柔性接头连接肿瘤血管靶向基序NGR和VEGI，避免因空间阻碍影响两个功能域同时发挥作用，提高了 VEGI在肿瘤组织的富集浓度。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是:一种NGR-VEGI融合蛋白基因，其特征在于，其序列(SEQ ID N0.1)如下:
权利要求
1.一种NGR-VEGI融合蛋白基因，其特征在于，其序列如下:
2.—种NGR-VEGI融合蛋白，其特征在于，其由权利要求1所述NGR-VEGI融合蛋白基因编码。
3.—种表达纯化如权利要求2所述NGR-VEGI融合蛋白的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤: 步骤一、采用人工方法合成NGR-VEGI融合蛋白基因； 步骤二、构建融合蛋白原核表达载体:将步骤一中所述NGR-VEGI融合蛋白基因克隆至原核表达载体，构建得到融合蛋白原核表达载体； 步骤三、融合蛋白的诱导表达:将步骤二中所述融合蛋白原核表达载体转入大肠杆菌中进行融合蛋白的诱导表达； 步骤四、融合蛋白的分离纯化:将步骤三中经诱导表达融合蛋白的大肠杆菌裂解后离心，然后将离心后收集的上清液采用镍柱亲和层析进行分离纯化，得到NGR-VEGI融合蛋白。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤二中所述构建融合蛋白原核表达载体的方法为^fNGR-VEGI融合蛋白基因的5’端融合NdeI酶切位点，3’端融合XhoI酶切位点，进行双酶切，然后装入PET-28a载体，利用载体上的序列，N端融合His-Tag，构建得到融合蛋白原核表达载体。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤三中所述融合蛋白的诱导表达采用异丙基-P -D-硫代半乳糖苷作为诱导剂。
6.一种如权利要求2所述NGR-VEGI融合蛋白作为NGR靶向血管诊疗用药物的应用。
全文摘要
本发明公开了一种NGR-VEGI融合蛋白基因，其序列见SEQ ID NO.1，还公开了采用该基因编码的NGR-VEGI融合蛋白以及表达纯化NGR-VEGI融合蛋白的方法，该方法为一、合成NGR-VEGI融合蛋白基因；二、构建得到融合蛋白原核表达载体；三、将融合蛋白原核表达载体转入大肠杆菌中进行融合蛋白的诱导表达；四、采用镍柱亲和层析进行分离纯化，得到NGR-VEGI融合蛋白。本发明通过设计NGR-VEGI融合蛋白基因，将NGR基序的肿瘤血管靶向性和VEGI较强的抗肿瘤血管生成作用结合在一起，采用高浓度的蛋白诱导表达方法，成功合成了NGR-VEGI融合蛋白，提高了VEGI在肿瘤组织的富集浓度。
文档编号A61K47/48GK103160531SQ20131009314
公开日2013年6月19日 申请日期2013年3月20日 优先权日2013年3月20日
发明者汪静, 杨卫东, 马温惠, 邵亚辉, 王喆, 康飞, 马晓伟, 张英起, 薛晓畅 申请人:中国人民解放军第四军医大学