技术领域本发明涉及生物抗体制备技术领域，具体涉及一种猪圆环病毒2型高免卵黄抗体的制备方法。
背景技术：
猪圆环病毒2型(PCV-2)为断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)的主要病原，于1991年在加拿大被首次发现并报道。目前PCV2的致病机制还不十分清楚，其对免疫系统的破坏被公认为是引起相关猪病的重要原因，猪由于免疫系统功能降低，在应激和病原感染时容易遭受病原侵袭，可能表现严重的症状。其临床症状主要表现为进行性消瘦，贫血和黄疸。近年来我国规模化猪场断奶仔猪也出现该病，给养猪生产造成较大的损失。到目前为止，国内尚无有效疫苗预防，也无有效药物治疗。目前，PCV2在我国及其他国家猪群中的感染率相当高，国内已从不同地区有或无PMWS症状猪分离鉴定了许多株PCV2，但关于不同地区流行的PCV2基因型、致病性及其毒力的分子基础等问题仍然不清楚。因此目前很难对PCV2的感染做出很好的防控。虽然高免卵黄具有价廉、速效、生产工艺简便等特点，但高免卵黄含有大量的脂类和杂蛋白，造成难于注射和吸收及产生过敏反应等问题。因此找出有效、经济、简单的提取卵黄抗体方法，是推广应用高免蛋的一个关键问题。
技术实现要素：
本发明目的是提供制备猪圆环病毒2型组织灭活苗，免疫鸡，收集高免卵后制备卵黄抗体，用于治疗发病猪。采用如下技术方案：一种猪圆环病毒2型高免卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤：第一步，自制疫苗：（1）先配制0.8％甲醛、0.1％叠氮钠和l000U/mL双抗液备用；（2）再将无菌采集发病猪的肺脏、肝脏和脑及淋巴结组织，用l000U/mL的双抗液冲洗表面；除掉筋膜，切成小块；（3）组织称重后按1：2的比例加入20％铝胶生理盐水，在高速匀浆机中匀浆2～3min，超声波裂解10min～15min，再以2000r／min匀浆4～5min，加入铝胶生理盐水，加入生理盐水的总量为组织重量的四倍；（4）在无菌室内，用灭菌纱布过滤、分装，最后进行灭活；（5）向匀浆后的组织液中加入等量的0.8％甲醛，O.l％叠氮钠，在冰箱冷冻室反复冻融3次以上，室温放置12h后，于4℃冷藏保存；（6）经无菌检查、安全试验、效力试验后，4℃冷藏保存；第二步，制备高免卵黄抗体：（1）基础免疫每羽蛋鸡肌注猪圆环病毒2型自家组织灭活疫苗0.2mL；（2）在基础免疫后l5天，每羽蛋鸡肌注猪圆环病毒2型自家组织灭活疫苗0.3mL,加强免疫；（3）在加强免疫后l5天，每羽蛋鸡肌注猪圆环病毒2型自家组织灭活疫苗0.4mL,强化免疫；（4）强化免疫后15天抽检卵黄，抗体效价最低达1:128，用于制作卵黄抗体；（5）采集强化免疫后第15～30天所产鸡蛋作为高免蛋,擦去鸡蛋表面脏物,浸泡于0.1％浓度的新洁尔灭溶液中30min后晾干；（6）用75％酒精棉球进行蛋壳表面消毒,无菌操作打开蛋壳,倒净蛋清,将蛋黄倒入消毒玻璃烧杯内备用；（7）将卵黄和灭菌生理盐水按1:4比例稀释,将卵黄和灭菌生理盐水按1:4比例稀释，调pH值至7.4，加入1.2%硫酸葡聚糖，静置，离心，取澄清液，进行硫酸铵分级得到卵黄抗体,除菌过滤，然后加入0.O1％硫柳汞,分装加塞,冰冻备用。对所述高免卵黄抗体的检验方法：（1）无菌检验：取高免卵黄分别接种于普通琼脂斜面培养基和厌氧肉汤培养基,37℃培养24～48h；（2）性状检验：将高免卵黄解冻后观察其颜色、气味、和均匀度以达标为准；（3）安全性检测：取小白鼠10只，每只皮下注射高免卵黄液2ml；另取15日龄仔猪10头,腹部部皮下注射lOml／头,观察3周；（4）效价检验：用琼脂扩散方法测定，效价高于1：32者用于临床。人工感染治疗试验方法：（1）选取保育猪20头,随机分为两组,每组10头,一组为试验组,一组为对照组；（2）取自然发病的猪脾脏和淋巴结,经组织匀浆处理后离心，取上清液。经预试验后每头猪注射含圆环病毒2型的上清液10mL；（3）待猪发病后，一组用高免卵黄（每公斤0.05mL/kg体重注射）+庆大霉素肌肉注射,另外一组用生理盐水（每公斤体重0.05mL注射）+庆大霉素肌肉注射,观察其治疗效果。以上方案具有如下效果：1、本实验是自治猪圆环病毒2型组织灭活苗，免疫鸡，收集高免卵后制备卵黄抗体，用于治疗发病猪，通过临床验证，效果良好。2、高免卵黄抗体检验结果。(1)无菌检验：普通琼脂斜面培养基上无菌落生长,厌氧肉汤培养基澄清透明，无细菌生长。(2)性状检验：高免卵黄液无味、均匀一致,呈黄色胶体溶液,不形成凝块。(3)安全性检测：10只小鼠和10头哺乳仔猪3周内均未发现任何异常，生长情况良好,证明该高免卵黄液安全可靠。(4)效价检验：经琼脂扩散实验,结果表明所取高免卵中,最低抗体效价1：64,最高抗体效价1:256。3、经攻毒试验后，对照组有明显临床症状。采取多头猪的血液进行病原检查，圆环病毒2型均为阳性。未出现明显症状可能与猪的免疫力强弱有关。具体实施方式实施例：一种猪圆环病毒2型高免卵黄抗体的制备方法，包括如下步骤和内容。材料与方法1.1试验动物清洁级昆明青年鼠28～30日龄，体重18～22g，雌雄各半，共10只，由郑州大学医学院提供；哺乳仔猪10头，保育猪20头，由郑州市荥阳某猪场提供；产蛋鸡100只，由河南农业大学种鸡场提供。自制疫苗先配制0.8％甲醛、0.1％叠氮钠、l000U/mL双抗液备用。再将无菌采集发病猪的肺脏、肝脏、脑及淋巴结组织，用l000U/mL的双抗液冲洗表面。除掉筋膜，切成小块。组织称重后加入按1：2的比例加入20％铝胶生理盐水，在高速匀浆机中匀浆2～3min，超声波裂解10min～15min，再以2000r／min匀浆4～5min，加入铝胶生理盐水（加入生理盐水的总量为组织重量的四倍）。在无菌室内，用四层灭菌纱布过滤、分装，最后进行灭活。向匀浆后的组织液中加入等量的0.8％甲醛，O.l％叠氮钠，在冰箱冷冻室反复冻融3次，室温放置12h后，于4℃冷藏保存。经无菌检查、安全试验、效力试验后，4℃冷藏保存。高免卵黄抗体制备基础免疫每羽蛋鸡肌注猪圆环病毒2型自家组织灭活疫苗0.2mL。在基础免疫后l5d，每羽肌注猪圆环病毒2型自家组织灭活疫苗0.3mL,加强免疫。在加强免疫后l5d，每鸡肌注猪圆环病毒2型自家组织灭活疫苗0.4mL,强化免疫。强化免疫后15d抽检卵黄，抗体效价最低达1:128，可用于制作卵黄抗体。采集强化免疫后第15～30d所产鸡蛋作为高免蛋,擦去鸡蛋表面脏物,浸泡于0.1％浓度的新洁尔灭溶液中30min后晾干。用75％酒精棉球进行蛋壳表面消毒,无菌操作打开蛋壳,倒净蛋清,将蛋黄倒入消毒玻璃烧杯内备用。将卵黄和灭菌生理盐水按1:4比例稀释,将卵黄和灭菌生理盐水按1:4比例稀释，调pH值至7.4，加入1.2%硫酸葡聚糖，静置，离心，取澄清液，进行硫酸铵分级得到卵黄抗体,除菌过滤，然后加入0.O1％硫柳汞,分装加塞,冰冻备用。高免卵黄抗体检验1.4.1无菌检验取高免卵黄分别接种于普通琼脂斜面培养基和厌氧肉汤培养基,37℃培养24～48h。性状检验将高免卵黄解冻后观察其颜色、气味、和均匀度。安全性检测取小白鼠10只，每只皮下注射高免卵黄液2ml；另取15日龄仔猪10头,腹部部皮下注射lOml／头,观察3周。效价检验用琼脂扩散方法测定，效价高于1：32者可用于临床。、人工感染治疗试验选取保育猪20头,随机分为两组,每组10头,一组为试验组,一组为对照组。取自然发病的猪脾脏和淋巴结,经组织匀浆处理后离心，取上清液。经预试验后每头猪注射含圆环病毒2型的上清液10mL。待猪发病后，一组用高免卵黄（每公斤0.05mL/kg体重注射）+庆大霉素肌肉注射,另外一组用生理盐水（每公斤体重0.05mL注射）+庆大霉素肌肉注射,观察其治疗效果。、临床试验郑州市荥阳某猪场保育猪感染断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，发病猪53头，用高免卵黄抗体按每公斤体重0.05mL配合庆大霉素颈部肌肉注射,每天一次,连用2d。试验结果2.1高免卵黄抗体检验结果(1)无菌检验普通琼脂斜面培养基上无菌落生长,厌氧肉汤培养基澄清透明，无细菌生长。(2)性状检验高免卵黄液无味、均匀一致,呈黄色胶体溶液,不形成凝块。(3)安全性检测10只小鼠和10头哺乳仔猪3周内均未发现任何异常，生长情况良好,证明该高免卵黄液安全可靠。(4)效价检验经琼脂扩散实验,结果表明所取高免卵中,最低抗体效价1：64,最高抗体效价1:256。人工感染治疗试验人工感染后，发病情况见表1.发病后试验组和对照组保育猪治疗情况见表2.表1.人工感染后保育猪的发病情况组别出现临床症状（头）未表现明显症状（头）试验组73对照组82由表1可以看出，经攻毒试验后，试验组有7头有临床症状，对照组8头有明显临床症状。采取20头猪的血液进行病原检查，圆环病毒2型均为阳性。未出现明显症状可能与猪的免疫力强弱有关。表2.发病后治疗效果组别完全痊愈死亡僵猪试验组7/70/70/7对照组2/84/82/8由表2可以看出，试验组发病7头猪，用高免卵黄治疗后，康复率有100%，无死亡猪和僵猪；对照组发病8头，只用庆大霉素治疗后仅2头康复，康复率25%，死亡4头，死亡率50%，僵猪2头，迁延不愈率25%。临床试验临床发病53头，治疗效果见表3.表3.发病后治疗效果发病猪（头）完全痊愈死亡僵猪535120由表3可以看出，经高免卵黄治疗后，发病猪53头，痊愈51头，康复率96%，治疗效果良好。