磷酸二酯酶4抑制剂ZL-n-91在制备抗肺癌增殖与转移药物中的应用的制作方法

本发明涉及一种磷酸二酯酶4抑制剂的应用，尤其涉及一种磷酸二酯酶4抑制剂zl-n-91的应用，属于肿瘤生物学领域。

背景技术：

癌症已经成为人类死亡的重要原因，其中肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。在全球男性最高发癌症中肺癌位于第二位，仅在2012年全球几乎有160万人死于肺癌，其中中国约占此类病例的1/3以上。肺癌是中国男性最高发癌症，其中80％-85％是非小细胞肺癌(non-smallcelllungcancer,nsclc)。肺癌的传统治疗方法包括局部治疗(包括手术治疗、放射治疗等)和全身性治疗(包括传统化疗、分子靶向药物治疗等)。尽管现代医学研究取得了巨大进步，肺癌在放疗、化疗、手术治疗方面取得了一定进展，但整体预后较差，5年生存率不足15％。因此寻找治疗肺癌的新方法，也成为了科学家们亟待解决的问题。

磷酸二酯酶(简称pdes)具有水解细胞内第二信使camp或cgmp的功能，从而影响这些第二信使所介导的信号通路，调节细胞功能。pdes共分为11个亚型，其中磷酸二酯酶4(pde4)特异性水解camp。pde4主要分布于各种炎性细胞内，包括肥大细胞、巨噬细胞淋巴细胞、上皮细胞等，参与了促进单核细胞与巨噬细胞活化、中性粒细胞浸润、血管平滑肌的增殖、血管扩张以及心肌收缩等相关生理病理过程，对中枢神经系统功能、心血管功能、炎症/免疫系统、细胞黏附等都有影响。研究显示，pde4抑制剂(pde4i)具有抗炎、抗过敏、抗血小板活化作用。其作用机制主要涉及：1)抑制多种炎症介质/细胞因子的释放，能够抑制il-4、il-5基因的表达；2)抑制白细胞的激活(如呼吸爆发)，抑制白细胞游走；3)抑制细胞粘附因子(cam)的表达或上调；4)诱导产生具有抑制活性的细胞子，如il-6；5)诱导细胞凋亡；6)刺激内源性激素和儿茶酚胺类物质的释放。

虽然已经开发或正在开发的pde4抑制剂针对的疾病主要是慢性阻塞性肺疾病(copd)、哮喘、炎症性肠疾病、关节炎等。但是，很多研究表明pde4抑制剂对于恶性肿瘤也有显著的抑制作用。patriciagoldhoff给裸鼠异种移植入人脑星形胶质母细胞瘤 细胞u87后，使用pde4抑制剂可以延长小鼠生存期。2006年motoshinarita发现pde4i可以抑制人黑色素瘤细胞的生长，petrosx.e.mouratidis发现在胰腺癌细胞中加入pde4抑制剂cc-8075和cc-8062后，可以使其细胞增殖降低和细胞凋亡增加。

现有的pde4i主要有咯利普兰(rolipram)、西洛司特(cilomilast)、罗氟司特(roflumilast)等。由于rolipram和cilomilast引发头晕、头痛和恶心、呕吐等胃肠道不良反应，影响了药物在临床中推广应用。导致胃肠道不良反应的可能原因之一是pde4抑制剂特异性差，从而中度选择性地抑制了整个pde家族。如cilomilast对pde4的ki＝92nm，仅是pde1、2、3、5的ki的500到1000倍。因此使用较高剂量cilomilast会与其他pde家族成员发生作用从而产生副作用。事实上，大多数pde4抑制剂，在高剂量时产生呕吐的副作用是普遍现象。roflumilast虽然已经通过美国fda批准上市用于治疗copd，降低肺部的炎症、抵抗氧化应激、有效的缓解肺部的纤维化、增强粘膜的清除能力以及气道的重塑等等。但是也有不良反应，主要表现为腹泻、体重下降、恶心、心房纤颤及精神方面疾病的加重(如失眠、焦虑、抑郁)等。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种磷酸二酯酶4抑制剂zl-n-91在制备抗肺癌增殖及转移药物中的应用。

为解决上述技术问题，采用的技术方案如下：

磷酸二酯酶4抑制剂zl-n-91在制备抗肺癌增殖药物中的应用在本发明的保护范围之内。

本发明利用c57bl6野生型小鼠尾静脉注射小鼠肺癌细胞llc为模型及a549皮下种植瘤模型，研究zl-n-91的病理生理学作用。实验证实：该抑制剂能够显著抑制肺癌细胞的增殖，为制备抗肺癌增殖药物的研究奠定了基础。

磷酸二酯酶4抑制剂zl-n-91在制备抗肺癌转移药物中的应用也在本发明的保护范围之内。

本发明利用小鼠肺癌细胞llc及人肺癌细胞a549，研究了zl-n-91的生物学作用，实验证实：该抑制剂能够显著抑制肺癌细胞的转移，为制备抗肺癌转移药物的研究奠定了基础。

磷酸二酯酶4抑制剂zl-n-91在制备抗肺癌增殖与转移药物中的应用也在本发明的 保护范围之内。

以上应用的给药方式优选为口服、注射或吸雾给药。

本发明所述的磷酸二酯酶4抑制剂zl-n-91可直接购买或者自行合成，例如可以参考文献[ruihongma,bin-yanyang,chang-youwu.aselectivephosphodiesterase4(pde4)inhibitorzl-n-91suppressesil-17productionbyhumanmemoryth17cells.internationalimmunopharmacology,2008,8(10):1408-1417.]自行合成制备。

为了更好的证明本发明所述化合物的作用效果，下面实施例结合小鼠的体内生存曲线实验与体外实验和结果，来进一步阐明本发明所述磷酸二酯酶抑制剂zl-n-91在抗肺癌增殖与转移中所具有的作用。

有益效果：本发明所述的选择性pde4抑制剂zl-n-91，可以显著抑制肺癌细胞的增殖和转移，预示该磷酸二酯酶4抑制剂zl-n-91有望成为抗肺癌增殖和转移研究的重要靶点，为制备抗肺癌增殖和转移药物提供了基础，具有良好的开发应用前景。zl-n-91对pde4d的抑制剂强度是其他pde家族成员的5000倍以上。相比其他pde4抑制剂，该化合物对pde4d具有更高的选择性，针对性强，产生的副作用小，能有效减弱甚至避免呕吐等不良反应。

附图说明

图1是小鼠肺癌细胞llc给予不同剂量zl-n-9124小时后细胞增殖结果图。

图2左图和右图分别是人肺癌细胞a549给予不同剂量zl-n-91后24小时及48小时细胞增殖结果图。

图3是小鼠肺癌细胞llc给予不同剂量zl-n-91后24小时细胞迁移结果图。

图4是给予数量为5×10⁵小鼠肺癌细胞llc后，给予不同剂量zl-n-91三周后各组小鼠肺组织的he染色病理切片。图a为正常组，图b为溶剂组，图c为高剂量组，图d为低剂量组。

图5是给予数量为5×10⁵小鼠肺癌细胞llc后，给予不同剂量zl-n-91的生存曲线图。

图6是人肺癌细胞a549皮下种植瘤裸鼠给予不同剂量zl-n-91后，肿瘤体积变化图和肿瘤大小图。

图7是人肺癌细胞a549皮下种植瘤裸鼠给予不同剂量zl-n-91后，肿瘤重量变化图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1：cck8法检测zl-n-91对肺癌细胞增殖的影响。

1)取对数生长期的细胞(分别为a549和llc)，制备单细胞悬液。按每孔100ul细胞悬液(含1×10⁴个细胞)接种于96孔板中，共分为5组，空白对照组，dmso组，10um，50um，100um，200um组，每组6个复孔，将细胞预培养24小时(在37℃，5％co2的条件下)；

2)更换新鲜培养基，各组分别加入不同浓度的zl-n-91，将细胞继续分别培养24小时和48小时(在37℃，5％co2的条件下)；

3)向每孔加入100ul含10％的cck-8溶液，避免产生气泡；

4)将细胞继续孵育1-2小时，分别在30min，60min，90min，将培养板取出，用酶标仪测定在450nm处的吸光度。

结果如图1和图2所示：随着zl-n-91浓度的升高，小鼠肺癌细胞llc和人肺癌细胞a549的增殖能力显著性降低。

实施例2：zl-n-91对小鼠肺癌细胞llc迁移能力的影响。

1)取对数生长期的细胞，用无血清dmem培养基制成悬液。按每孔100ul细胞悬液(含5×10⁴个细胞)接种于transwell小室中。分为3组：空白对照组，50um，100um组，每组设3个复孔，并给予不同浓度的药物处理；

2)将10％fbs的完全dmem培养基加入12孔板下室，然后放入小室；

3)24小时后，取出小室，置于冰甲醇中固定30min，室温下自然晾干；

4)在12孔板分别加入600ul含0.1％结晶紫溶液浸泡小室下表面15min，将细胞染成紫色；

5)加入pbs，5min后将pbs吸出，用干净棉签轻轻擦去小室内的细胞。pbs洗3遍。室温下自然晾干；

6)在12孔板内加入10％乙酸溶液300ul，将小室下表面浸泡10min，溶解细胞中的结晶紫颗粒；

7)各孔取100ul溶液置于96孔酶联板中，用酶标仪测定在570nm处的吸光度。

结果(图3)显示：当药物浓度为100um时，zl-n-91对小鼠肺癌细胞llc的迁移

有抑制作用。

实施例3：zl-n-91对肺癌小鼠的疗效。

1)取llc肺癌细胞，置于5％co2，37℃，饱和湿度的培养箱中培养，收集生长状态良好的并处于对数期的细胞，使用1×pbs稀释，调整浓度为1.67×10⁶/ml；

2)用1ml无菌注射器将制备好的细胞悬液尾静脉接种于野生型c57bl6小鼠0.3ml；

3)接种3天后给予小鼠药物治疗。

4)溶剂配制：将40％羟丙基-β-环糊精和6％聚乙醇硬脂酸酯15溶于生理盐水中；

5)分别取10mg、20mg、40mgzl-n-91溶于10ml上述溶剂中，涡旋混匀，制备5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg三个剂量；

6)分别取溶剂及上述三个浓度药物100ul给予各组小鼠每天灌胃，并观察记录小鼠生存情况，绘制小鼠生存曲线。

7)部分小鼠在给药3周后处死，取肺组织包埋、切片，进行病理学分析。

结果如图4所示，对照组小鼠的肺部出现大面积恶性肿瘤浸润，而随着给药剂量的增加，小鼠肿瘤细胞聚集情况减轻，高剂量小鼠肿瘤面积明显小于对照组。图5表明，肺癌小鼠在给予不同剂量zl-n-91治疗后，随着药物剂量的增加小鼠存活时间有显著延长，说明zl-n-91有显著延长肺癌小鼠存活作用。

实施例4：a549皮下种植瘤裸鼠的治疗。

1)取对数生长期的a549细胞，用无血清f-12k培养基制备单细胞悬液，按每管120ul细胞悬液(含2×10⁶个细胞)分装于1.5mlep管中；

2)用1ml无菌注射器吸取制备好的细胞悬液0.1ml接种于裸鼠皮下；

3)接种3天后给予小鼠药物治疗。

4)将裸鼠分为两组：溶剂对照组和给药组(10mg/kg)，每天灌胃药物治疗，并每周两次测量裸鼠皮下肿瘤体积；

5)当小鼠肿瘤体积达到1500mm³时，取出小鼠肿瘤，比较肿瘤大小，并记录肿瘤重量。

结果如图6、7所示，给予药物治疗后，肿瘤体积和重量量约为对照组的1/3，说明zl-n-91对于a549皮下种植瘤的生长有显著抑制作用。

以上实验表明，本发明所采用的磷酸二酯酶4抑制剂zl-n-91不仅能抑制癌细胞增殖，而且能抑制癌细胞转移扩散，具有良好的抗肿瘤效果。