IκB激酶ε抑制剂在治疗脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的功能和应用的制作方法

本发明属于基因的功能与应用领域，特别涉及一种IκB激酶ε抑制剂(suppressor of IKKε，SIKE)作为靶基因在制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中应用。

背景技术：

近年来，随着人口老龄化逐渐严重以及生活方式的改变，肥胖、糖尿病、非酒精性脂肪肝和代谢综合征等代谢异常人群急剧上升，成为严重的公共健康问题，给我国带来沉重的经济和社会负担。目前，市场上虽有许许多多各类降糖药物，但糖尿病的治疗现状仍不容乐观。据统计，2010年全球共有2.85亿糖尿病患者，而到2030年这一数据将增加到4.39亿，意味全球20-79岁成年人中7.7％将是糖尿病患者。研究表明，糖尿病是动脉粥样硬化、慢性肾脏病、冠心病、脑卒中等强烈的危险因素。因此，如何有效预防和控制糖尿病已显得刻不容缓。肝脏作为人体的生化工厂，是糖代谢最主要的器官之一。一方面，肝功能异常可导致葡萄糖代谢紊乱并加剧糖尿病。另一方面，高血糖可引起肝脏组织学和功能上的变化。因此，糖尿病与脂肪肝互为发生，相互作用，可能存在潜在的共同机制。

SIKE(suppressor of IKKε)是IκB激酶ε抑制剂,广泛分布于骨、脾脏、胰腺、淋巴等组织中。IκB激酶家族(IKKs)是NF-κβ信号通路激活过程中的一个关键酶，其结构除两个催化亚基IKKɑ/β和一个调节亚基IKKγ组成的复合物外，还有存在另外一种IκB激酶复合物IKKε。作为IKKs家族的最新成员，IKKε与IKKɑ/β/γ之间有高度的同源性，它们在N末端都含有一个特殊的激酶结构域，在C端则是一个螺旋-螺旋膜体结构。目前已有研究发现IκB激酶家族在先天性免疫、细胞增殖与分化、炎症及代谢性疾病中扮演着重要作用。我们最新研究也发现通过与TBK1直接结合抑制TBK1-AKT信号通路，从而发挥改善心肌肥厚的作用。不过，关于其在脂肪肝和Ⅱ型糖尿病中的作用仍不清楚，仍有待进一步研究。

参考文献：

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2.Marion JD,Roberts CF,Call RJ,et al.Mechanism of Endogenous Regulation of the Type IInterferon Response by Suppressor of IκB Kinase∈(SIKE),a Novel Substrate ofTANK-binding Kinase 1(TBK1).Journal of Biological Chemistry.2013Jun21；288(25):18612-23.

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技术实现要素：

为解决上述现有技术的缺陷和不足，本发明的目的在于提供一种SIKE基因的表达与脂肪肝、Ⅱ型糖尿病之间的相互关系，提供一个用于治疗脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的靶基因SIKE的新用途，进而把SIKE基因应用于脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的治疗。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

本发明以野生型C57小鼠与SIKE基因敲除小鼠为实验对象，通过高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型(diet induced obesity，DIO)研究SIKE基因的功能，结果发现与野生型WT小鼠对比，SIKE基因敲除小鼠表现出肥胖，并且SIKE基因敲除小鼠空腹血糖水平高于对照组WT小鼠，进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验发现SIKE基因敲除小鼠对葡萄糖的耐受能力明显减弱。从小鼠肝脏重量及肝脏/体重比以及脂质成分、糖原含量病理染色结果等均说明HFD组(High fatdiet，高脂饮食)的SIKE-KO小鼠脂肪肝病变明显严重，脂质蓄积显著增加。这表明SIKE基因敲除会加剧脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的发生，SIKE基因能够改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的发生。

本发明人的研究证明了：在高脂诱导的脂肪肝、Ⅱ型糖尿病模型中，SIKE具有抑制肥胖，降低血糖，减少肝脏脂质蓄积，保护肝功能，特别是改善脂肪肝、Ⅱ型糖尿病的作用。

针对SIKE的上述功能，提供SIKE作为药物靶标在筛选保护肝脏及糖代谢的药物中的应用。

针对SIKE的上述功能，提供SIKE作为药物靶标在筛选预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物中的应用。

以上药物是指能够促进SIKE基因表达的药物。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明发现SIKE基因的新功能，即SIKE基因具有能够保护脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病的作用。

(2)基于SIKE在保护脂肪肝、Ⅱ型糖尿病疾病中的作用，其可以用于制备预防、缓解和/或治疗脂肪肝和/或Ⅱ型糖尿病的药物。

附图说明

图1是WT和SIKE-KO小鼠的体重、空腹血糖结果图；

A为小鼠体重结果图，B为空腹血糖水平统计图(*：p＜0.05vs WT NC组，**：p＜0.01vs WT NC组，#：p＜0.05vs WT HFD组，##：p＜0.01vs WT HFD组)。

图2是WT和SIKE-KO小鼠通过腹腔注射葡萄糖耐量结果图；

A为通过腹腔注射葡萄糖后不同时间点小鼠血糖水平统计图，B为各组小鼠糖耐量曲线下面积(area under the curve，AUC)比较图(**：p＜0.01vs WT NC组，##：p＜0.01vs WT HFD组)。

图3是SIKE-KO和WT小鼠的肝脏重量、肝脏重量与小鼠本身体重比值统计柱状图(##：p＜0.01vs WT HFD组)。

图4是WT和SIKE-KO和WT小鼠的油红O染色和糖原染色结果图。

具体实施方式

通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。

实验用动物及饲养：

实验动物种属，性别，周龄及来源：C57BL/6(WT)小鼠和肝脏特异性SIKE基因敲除(SIKE-KO)小鼠，雄性，8周龄。C57BL/6小鼠购自北京华阜康生物科技有限公司；肝脏特异性SIKE基因敲除小鼠由SIKE-flox小鼠(由武汉大学李红良教授实验室构建，构建过程参考文献：Deng K Q,Wang A,Ji Y X,et al.Suppressor of IKKεis an essential negative regulator of pathological cardiachypertrophy[J].Nature communications,2016,7.)与肝细胞特异性表达的Cre转基因小鼠Albumin-Cre(购自The Jackson Laboratory，货号003574)杂交得到。

实验动物饲料配方：高脂饲料(HFD)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12942)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:20％；脂肪:60％，总的热量质量比:5.24kcal/g。低脂饲料(NC)(购自北京华阜康生物科技有限公司，货号D12450B)：热量百分比：蛋白质:20％；碳水化合物:70％；脂肪:10％，总的热量质量比:3.85kcal/g。

动物饲养及环境条件：所有的实验小鼠均饲养在武汉大学SPF级动物房(许可证号：SYXK(鄂)：2009-0053)。每12小时交替照明，温度24±2℃，湿度40％-70％，小鼠自由饮水进食。

【实施例1】小鼠脂肪肝、II型糖尿病模型(diet induced obesity，DIO)获得

(1)实验动物分组：选用8周龄，雄性，WT小鼠和SIKE-KO小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(High fat diet，HFD)和D12450B低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即WT NC组，KO NC组，WT HFD组，KO HFD组共4个组别。

(2)模型通过高脂饲料诱导操作流程：

采用WT和KO小鼠，建立DIO模型，进行表型相关分析，明确SIKE基因对脂肪肝、II型糖尿病发挥的作用。选用8周龄，雄性，WT小鼠和SIKE-KO(TG)小鼠，分别给与两种特殊饲料D12942高脂饲料(Highfat diet，HFD)和D12450B低脂饲料(Normal chow，NC)饲养，即WT NC组，KO NC组，WTHFD组，KO HFD组共4个组别。每周均详细记录小鼠摄食量，小鼠空腹体重和空腹血糖每隔2周检测1次。实验第11周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对葡萄糖耐受能力。第12周终末取材，取出小鼠肝脏拍照，然后一部分置于甲醛溶液中固定或O.C.T冰冻切片包埋剂(Tissue FreezingMedium)包埋作为病理分析用。

【实施例2】小鼠体重、血糖水平测定

(1)小鼠空腹体重检测

1)体重检测。

①禁食：上午8:00将待实验小鼠禁食(不禁水)，下午2:00开始实验操作。

②称重：分别在第0周、2周、4周、6周、8周、10周、12周称重，将一塑料小桶放在动态电子天平上，抓起小鼠，放入称量小桶中，测量体重记录数据。饲料量检测：待称体重操作完成后，给小鼠加饲料，并在动态电子天平上记录小鼠的饲料量。

(2)空腹血糖水平检测实验

将所有待实验的小鼠从上午8:00至下午2:00间禁食(不禁水)，即禁食6小时后开始实验操作。

①血糖仪准备：检查血糖仪(美国强生公司，ONETOUCH)电池，按右侧开关，将试纸正确放入左侧插槽，屏幕显示与血糖试纸条相应代码的数字，随后显示滴血图案，提示血糖仪进入待测状态。

②固定小鼠：右手抓鼠尾，左手持一块毛巾，将毛巾对折，用拇指和食指捏住毛巾对折处，将鼠头部和身体包入手掌内的毛巾，拇指和食指在将鼠尾根部固定。

③剪尾：眼科剪迅速在距鼠尾末端0.1-0.2cm处剪下鼠尾，待血滴自行流出。

④血糖检测：将血糖仪试纸边缘轻触血滴，血液浸入试纸，血糖仪倒计时5秒显示读数。

II型糖尿病损伤严重程度的评估指标主要包括体重、血糖等水平，体重、血糖变化结果如图1所示，WT小鼠在给与HFD饲料饲养后，从第2周开始体重明显高于其NC饲料组，给与SIKE-KO小鼠12周的HFD饲料和NC饲料饲养后，HFD组的SIKE-KO小鼠体重在第2周和12周高于HFD组的WT小鼠(见图1A)；经空腹血糖检测发现在HFD组的小鼠从第2周开始，空腹血糖水平明显较相应NC对照组升高，HFD组的SIKE-KO小鼠空腹血糖水平也明显高于WT组小鼠空腹血糖水平(见图1B)。表明SIKE基因敲除后显著影响了小鼠在HFD饲养状态下的糖代谢稳态，SIKE基因能显著提高小鼠的糖代谢能力，表明SIKE基因可抑制高脂诱导引起的II型糖尿病的发生。

【实施例3】葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerance test，IPGTT)

实验第11周，进行腹腔注射葡萄糖实验(IPGTT)，以评价小鼠机体对糖耐受能力。

(1)在测血糖之前，先测量小鼠的空腹体重，根据10μL/g计算葡萄糖的注射体积。

(2)先检测葡糖糖注射前即0分钟时空腹血糖，在检测完毕后迅速经腹腔注射葡萄糖液。

(3)腹腔注射操作方法：①固定小鼠；抓起小鼠，左手的小指和无名指抓小鼠的尾巴，另三手指抓住小鼠的颈部，使小鼠的头部向下，将小鼠腹部充分暴露。②进针定位及注射：从腹部一侧进针右手持注射器，将尖端与小鼠腹部成45°的夹角，进针，回抽，注射时针头在腹部皮下穿行一小段距离，穿过腹中线后在腹部另一侧进入腹腔，注射完药物后，缓缓拔出针头，并轻微旋转针头，防止漏液。

(4)分别于腹腔注射后15分、30分、60分、120分钟时间点剪尾测小鼠血糖值，并记录血糖数值和检测时间。

进一步通过腹腔注射葡萄糖耐量实验(intraperitoneal glucose tolerancetests，IPGTT)来评估各组小鼠对葡萄糖的处理能力，在实验第11周，通过注射1.0g/kg体重的葡萄糖后，HFD组的WT小鼠和SIKE-KO小鼠血糖水平在15分钟时间点剧增达到峰值，随着时间推移至注射后60分钟，两组小鼠血糖水平稍微下降，但仍处于高于空腹血糖水平(0分钟时血糖)，在2小时时恢复至空腹血糖水平，且SIKE-KO小鼠血糖水平从0分钟至2小时一直处于高于WT小鼠的血糖水平(图2A)。比较各组小鼠血糖曲线下面积(area under the curve，AUC)，发现WT小鼠HFD组的AUC显著高于NC组，SIKE-KO HFD组的AUC显著大于WT HFD组的AUC(图2B)，表明SIKE可促进糖代谢稳态。

【实施例4】肝脏大体外观及肝脏油红O、糖原染色

(1)终末肝脏组织取材

1)小鼠称重后，迅速脱颈处死。仰卧固定小鼠，用蒸馏水将小鼠胸部，腹部毛发润湿。

2)用一镊子钳夹小鼠腹部正中皮肤，沿腹部正中向头部剪开皮肤至剑突下，向尾端剪开皮肤，逐层暴露皮下筋膜，肌肉等，打开腹腔，充分暴露各脏器。

3)迅速找到并取下小鼠的肝脏，将取下的肝脏标本置于灭菌纱布上，拭干肝脏表面上残留血液，将肝脏置于无菌培养皿中，迅速称重。

4)石蜡标本：切取部分肝脏置于10％中性福尔马林中固定。冰冻标本：切取部分肝脏，置于有OCT的锡纸模具中包埋，放在干冰上冰冻固定。

2.肝脏组织处理及病理染色相关实验

1)肝脏脱水，透明，浸蜡

切取10％中性福尔马林中固定好的部分肝叶组织于标记的包埋框内，在小流量流水冲洗30分钟以上。按照以下流程在机器上设置以下程序，①脱水：75％酒精(45分钟)→75％酒精(45分钟)→85％酒精(45分钟)→85％酒精(45分钟)→95％酒精(45分钟)→95％酒精(45分钟)→无水酒精(1小时)→无水酒精(1小时)；②透明：二甲苯(1小时)→二甲苯(1小时)；③浸腊(65℃)：石蜡(1小时)→石蜡(1小时)。待组织冲洗完毕后，将包含组织的包埋框装进机器篮筐内，启动上述程序。上述程序完成后，取出组织包埋框送病理室包埋组织，同时清洗机器备用。

2)肝脏组织切片

使用切片机切片(切片厚度5μm)。

3)肝脏组织糖原染色

将肝脏组织石蜡切片放入65℃烘箱(30分钟)→二甲苯中(5分钟×3次)→100％酒精(1分钟)→90％酒精(1分钟)→70％酒精(1分钟)→蒸馏水洗→高碘酸(10分钟)→自来水洗去切片上的浮色→雪夫试剂浸染(10-15分钟)→自来水洗数下→苏木素(1分钟)→蒸馏水洗去切片上的浮色→70％酒精一下→90％酒精一下→100％酒精(30秒×3次)→二甲苯(2分钟×3次)→在二甲苯未干时封片，拍照。

4)肝脏组织油红O染色

①将冰冻肝脏组织切片在通风橱中风干30分钟，4％多聚甲醛固定10分钟。置于双蒸水中稍洗10分钟，以除去组织表明的多聚甲醛。

②以60％异丙醇处理1分钟。

③用油红O(公司sigma，货号O0625，浓度0.5克/100mL 100％异丙醇)染色30分钟。

④之后以60％异丙醇漂洗1分钟×3次，直至背景干净。

⑤用Mayer’s苏木素染液(5滴)淡染细胞核。

⑥水漂洗，稀碳酸锂水溶液中促蓝，充分水洗，水洗至细胞核蓝化。

⑦用甘油明胶封片，拍照。

肝脏重量及肝重体重比结果见图3所示，HFD组的SIKE-KO小鼠无论肝脏重量还是肝脏重量与小鼠本身体重比值均较HFD组的WT小鼠高(如图3)。进一步通过组织切片进行油O和糖原染色，显微镜下观察各组小鼠肝脏组织在高脂饮食饲养条件下发生了显著的病理改变。通过肝脏油红O染色来检测肝组织中脂质，可以观察到在HFD饲养条件下，WT小鼠和SIKE-KO小鼠肝脏组织均有脂肪沉积，可以看到HFD组WT小鼠的肝细胞发生脂肪变性、空泡化且融合连成片状，肝脏细胞形态已几乎完全破坏，而SIKE-KO组小鼠的肝细胞形态变化更为严重，空泡化更明显(如图4上)，通过肝脏糖原染色来检测肝脏损伤程度，可以发现在HFD组的SIKE-KO小鼠肝糖原的含量相比于WT组小鼠明显减少(如图4下)。这些结果说明SIKE基因敲除小鼠的脂肪肝明显恶化。

上述结果显示SIKE-KO小鼠在HFD的诱导下发生的II型糖尿病和脂肪肝病变显著加重。这些结果表明SIKE基因对改善II型糖尿病和脂肪肝具有显著的作用。本发明结果说明SIKE基因在脂肪肝、II型糖尿病疾病模型中有着重要的保护作用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。