胰腺基质祖细胞的制作方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2015年5月11日提交的名称为“胰腺基质祖细胞(pancreasstromalprogenitors)”、代理人案号为064693-0322的美国临时专利申请号62/159,671的权益，所述临时专利申请的全部内容通过引用并入本文。

背景

本公开涉及胰腺基质祖细胞。本公开还涉及胰腺基质祖细胞的分离。本公开进一步涉及包含胰腺基质祖细胞的组合物和这种组合物的制备。本公开还涉及一种治疗，其包括施用包含胰腺基质祖细胞的组合物。本公开还涉及糖尿病的治疗，其包括施用包含胰腺基质祖细胞的组合物。

背景技术：

胰腺包含共同紧密混合在一个器官中的两个腺体。胰腺的主体由“外分泌”细胞组成，所述细胞产生酶以帮助消化食物。这些外分泌细胞将它们的酶释放到一系列逐渐变大的管(称为导管)中，所述管最终连接在一起以形成主胰管。所述主胰管贯穿胰腺的长度并将外分泌细胞产生的流体排入十二指肠，即小肠的第一部分。胰腺的第二功能性部件是“内分泌”胰腺。所述内分泌胰腺由称为朗格罕氏岛(isletsoflangerhans)的细胞小岛组成。这些内分泌细胞不会将其分泌物释放到胰管中，相反它们将激素如胰岛素和胰高血糖素释放到血流中，并且这些激素继而帮助控制血糖(葡萄糖)水平。

技术实现要素：

本公开涉及胰腺基质祖细胞。本公开还涉及胰腺基质祖细胞的分离。本公开进一步涉及包含胰腺基质祖细胞的组合物和这种组合物的制备。本公开还涉及一种治疗，其包括施用包含胰腺基质祖细胞的组合物。本公开还涉及糖尿病的治疗，其包括施用包含胰腺基质祖细胞的组合物。

本公开还涉及一种产品。所述产品可包含分离的胰腺基质祖细胞(psp)。所述产品可包含含有psp的制剂。psp可从胰腺分离。胰腺可以是人类或非人类动物的胰腺。

psp可具有以下特征。psp可显示出高il6(il6^高)。与骨髓间充质干细胞(bmsc)的il6水平相比，psp可显示出更高水平的il6。psp可对sca1、cd105、波形蛋白(vimentin)、cd44、cd29或其组合呈阳性。psp可对cd13、cd73、cd34、cd45或其组合呈阴性。psp可具有分化成成骨细胞、成脂细胞或其组合的能力。psp可具有非常有限的分化成脂肪细胞的能力。这可能表明，与间充质干细胞相比，psp可能是不同类型的细胞。

在一些方面，表达高水平il6(il6^高)的psp与bmsc相比在相同条件下可表达更高水平的il6。在其它方面，高水平的il6是与相同条件下的其它细胞相比较。例如，通过从细胞群体(例如，通过亚培养或其它合适的方法)分离在所需条件下以最高水平表达il6的那些细胞，可以获得表达高水平il6的psp。在一些实例中，表达高水平il6的psp可包含30％、20％、10％或5％的在相同条件下相对于其它细胞以最高水平表达il6的细胞。在其它实例中，表达高水平il6的psp可包含30％、20％、10％或5％的在相同条件下相对于其它细胞以最高水平表达il6的细胞。然而，在其它实例中，当在相同条件下分离psp和bmsc时，psp可以以比bmsc的il6表达水平高至少10％、25％、50％、70％或90％的水平表达il6。

psp的这些特征可用于帮助分离psp。实例如下。通过鉴定显示出高il6(il6^高)的细胞并且分离这些细胞，可以将psp与其它细胞分离。通过鉴定与骨髓干细胞相比显示出高il6(il6^高)的细胞并且分离这些细胞，可以将psp与其它细胞分离。通过鉴定对sca1、cd105、波形蛋白、cd44、cd29或其组合呈阳性的细胞并且将这些细胞与其它细胞分离，可以将psp与其它细胞分离。通过鉴定对cd13、cd73、cd34、cd45或其组合呈阴性的细胞并且将这些细胞与其它细胞分离，可以将psp与其它细胞分离。通过确定这些细胞是否具有分化成成骨细胞、成脂细胞或其组合的能力并且将这些细胞与其它细胞分离，可以将psp与其它细胞分离。

本公开还涉及治疗哺乳动物的方法。哺乳动物的治疗可包括向哺乳动物施用包含psp的组合物。这种治疗可保护链脲霉素诱导的β细胞免受损伤。这种治疗可增强β细胞介导的胰岛素产生。这种治疗可用于调节胰岛素产生。这种治疗可用于修复胰腺。这种治疗可用于治疗导致胰腺疾病的疾病。在一些实施方式中，哺乳动物可以是人类。

这种治疗也可用于治疗患有影响哺乳动物身体如何使用血糖的疾病的哺乳动物。这种疾病的实例可以是糖尿病。这种糖尿病可以是任何类型的糖尿病。例如，糖尿病可以是慢性的或非慢性的。慢性糖尿病病状可包括1型糖尿病和2型糖尿病。这种疾病的其它实例包括潜在可逆性糖尿病(其可包括糖尿病前期，此时血糖水平高于正常水平，但未高到足以分类为糖尿病)和妊娠糖尿病，妊娠糖尿病发生在妊娠期间，但在胎儿娩出后可能会消退。

这种治疗也可用于修复胰腺，胰腺组织再生，改善胰岛移植效率和/或用于胰岛细胞再生。

psp可以形成具有再生的朗格罕氏岛的胰腺组织。这种特征可用于分离psp。当psp被植入肾囊时，psp可以形成具有再生的朗格罕氏岛的胰腺组织。这种特征可用于分离psp。

本公开涉及一种组合物。所述组合物可包含胰腺基质祖细胞(psp)。所述组合物可包含有效治疗人类的量的psp，所述人类患有影响人体如何使用血糖的疾病。所述psp可包括人类psp。所述psp可包括人类psp，并且其中人类psp可从人类胰腺组织分离。

psp可表达高水平的il6(il6^高)。与人类的骨髓间充质干细胞(bmsc)的il6表达水平相比，psp可表达高水平的il6(il6^高)。

通过鉴定表达高水平的il6(il6^高)的细胞并且分离这些细胞，可以将psp与其它细胞分离。通过鉴定与人类的骨髓间充质干细胞(bmsc)相比表达高水平的il6(il6^高)的细胞并且分离这些细胞，可以将psp与其它细胞分离。psp可对sca1、cd105、波形蛋白、cd44、cd29或其任何组合呈阳性。psp可表达高水平的il6(il6^高)并且可对sca1、cd105、波形蛋白、cd44、cd29或其任何组合呈阳性。通过鉴定对sca1、cd105、波形蛋白、cd44、cd29或其任何组合呈阳性的细胞并且将这些细胞与其它细胞分离，可以将psp与其它细胞分离。通过鉴定表达高水平的il6(il6^高)并对sca1、cd105、波形蛋白、cd44、cd29或其任何组合呈阳性的细胞并且将这些细胞与其它细胞分离，可以将psp与其它细胞分离。

psp可对cd13、cd73、cd34、cd45或其任何组合呈阴性。psp可表达高水平的il6(il6^高)并且对cd13、cd73、cd34、cd45或其任何组合呈阴性。psp可表达高水平的il6(il6^高)；并且可对sca1、cd105、波形蛋白、cd44、cd29或其任何组合呈阳性；并且可对cd13、cd73、cd34、cd45或其任何组合呈阴性。通过鉴定对cd13、cd73、cd34、cd45或其任何组合呈阴性的细胞并且将这些细胞与其它细胞分离，可以将psp与其它细胞分离。通过鉴定表达高水平的il6(il6^高)并对sca1、cd105、波形蛋白、cd44、cd29或其任何组合呈阳性并对cd13、cd73、cd34、cd45或其任何组合呈阴性的细胞并且将这些细胞与其它细胞分离而将psp与其它细胞分离。

psp可具有分化成成骨细胞、成脂细胞或其组合的能力。通过鉴定具有分化成成骨细胞、成脂细胞或其组合的能力的细胞并且将这些细胞与其它细胞分离，可以将psp与其它细胞分离。

本公开还涉及治疗人类的方法。所述治疗方法可包括向人类施用有效量的包含psp的组合物。所述人类可以患有影响人体如何使用血糖的疾病。所述疾病可以是糖尿病。所述疾病可以是慢性糖尿病或非慢性糖尿病。所述疾病可以是1型糖尿病或2型糖尿病。所述疾病可以是潜在可逆性糖尿病或妊娠糖尿病。所述人类可以患有导致胰腺疾病的疾病。所述治疗可保护链脲霉素诱导的β细胞免受损伤。所述治疗可增强β细胞介导的胰岛素产生。所述治疗可调节胰岛素产生。所述治疗可修复胰腺。所述治疗可以帮助胰腺组织再生。所述治疗可改善胰岛移植效率，和/或使胰岛细胞再生。

上文公开的特征的任何组合都是可能的，并且因此在本公开的范围内。例如，上述产品(例如组合物)和方法(例如治疗方法)的任何组合都在本公开的范围内。

根据以下对说明性实施方式、附图和权利要求的详细描述的评阅，这些以及其它组件、步骤、特征、目的、益处和优点现在将变得显而易见。

附图说明

附图是说明性实施方式的附图。它们不说明所有实施方式。可以另外或代替性地使用其它实施方式。可能显而易见或不必要的细节可以省略，以节省空间或为了更有效的说明。一些实施方式可以在存在其它组件或步骤的情况下和/或在不存在所说明的所有组件或步骤的情况下被实践。当相同的数字出现在不同附图中时，它是指相同或相似的组件或步骤。

图1(a)分离的psp的显微镜图像。(b)在低密度下并培养约2周的psp的集落簇。

图2(a)免疫荧光染色显示，psp表达cd105、sca1、波形蛋白、cd29和cd44。(b)流式细胞分析显示，psp对cd13、cd34、cd45和73抗体染色呈阴性。

图3(a)细胞因子阵列显示，psp表达il6，但骨髓间充质干细胞(bmsc)不能表达il6。(b)qpcr证实psp表达il6，但bmsc不能表达il6。(c)免疫荧光染色显示，psp表达il6，但bmsc不能表达il6。

图4(a)茜素红染色显示，与骨髓间充质干细胞(bmsc)相比，psp具有升高的体外成骨分化能力。(b)油红o染色显示，与bmsc相比，psp显示出非常有限的分化成脂肪细胞的能力。

图5葡萄糖刺激的胰岛素分泌(gsis)显示，当与bmsc和未刺激的对照组相比时，psp可以刺激min6β细胞产生更多的胰岛素。

图6(a)h&e染色显示，肾囊(k)植入的pspc使胰腺样组织(pan)再生。(b)h&e染色显示，肾囊植入的pspc使胰腺样组织(pan)和朗格罕氏岛(箭头)再生。(c、d)免疫荧光染色显示，胰岛细胞表达胰岛素(c)和胰高血糖素(d)。

具体实施方式

现在讨论说明性实施方式。可以另外或代替性使用其它实施方式。对于本领域普通技术人员而言显而易见或不必要的某些细节可能已从本公开中省略，以提供清楚和简洁的公开内容。相反，一些实施方式可以在不存在公开的所有细节的情况下被实践。

在本公开中使用以下首字母缩略词和缩写词。

bmsc：骨髓来源的间充质干细胞。

psp：胰腺基质祖细胞。

il16：白介素16。

msc：间充质干细胞。

pbs：磷酸盐缓冲盐水。

dapi：4',6-二脒基-2-苯基吲哚。

本公开涉及胰腺基质祖细胞。本公开还涉及胰腺基质祖细胞的分离。本公开进一步涉及包含胰腺基质祖细胞的组合物和这种组合物的制备。本公开还涉及一种治疗，其包括施用包含胰腺基质祖细胞的组合物。本公开还涉及糖尿病的治疗，其包括施用包含胰腺基质祖细胞的组合物。

本文描述的治疗(方法)可以包括但不限于哺乳动物的疾病的诊断、治疗、治愈、愈合、缓解和/或预防，和/或哺乳动物的美容治疗。示例性的治疗(例如，施用本文公开的组合物)方法包括全身注射或输注，局部应用或注射，或其它合适的配制和递送手段。

本文所述的治疗可用于治疗动物，包括但不限于哺乳动物。所述哺乳动物可以是人类。所述哺乳动物可以是非人类动物。例如，所述哺乳动物可以是非人类灵长动物、马、绵羊、牛、猪、狗、猫或山羊。

本公开还涉及一种组合物。所述组合物可以是细胞培养物。所述组合物可以是药物或生物制剂。

适合于制备示例性组合物的胰腺基质祖细胞(psp)可以是任何哺乳动物的任何祖细胞。例如，psp可以是经受治疗的哺乳动物的祖细胞(即自体祖细胞治疗)。或者，psp可以是除经受治疗的哺乳动物之外的哺乳动物的祖细胞(即同种异体祖细胞治疗)。psp可以从哺乳动物的胰腺分离。psp可以从人类的胰腺分离。

本公开还涉及治疗的方法(“治疗方法”)。这种治疗方法可用于治疗患有影响人体如何使用血糖的疾病的人类。这种疾病的实例可以是糖尿病。这种糖尿病可以是任何类型的糖尿病。例如，糖尿病可以是慢性的或非慢性的。慢性糖尿病可包括1型糖尿病和2型糖尿病。这种疾病的其它实例是潜在可逆性糖尿病(其可包括糖尿病前期，此时血糖水平高于正常水平，但未高到足以分类为糖尿病)和妊娠糖尿病，妊娠糖尿病发生在妊娠期间，但在胎儿娩出后可能会消退。

这种治疗可用于治疗导致胰腺疾病的疾病。这种治疗可保护链脲霉素诱导的β细胞免受损伤。这种治疗可增强β细胞介导的胰岛素产生。这种治疗可用于调节胰岛素产生。这种治疗可用于修复胰腺。这种治疗也可用于胰腺组织再生，改善胰岛移植效率，和/或用于胰岛细胞再生。

本公开还涉及制备组合物的方法(“制备方法”)。所述制备方法的一个实例可包括获得胰腺组织，将所述胰腺组织分离成细胞，分离psp(例如通过分选，针对如本文所述的psp标志物或分化潜能进行选择)，以及制备包含psp的组合物。

所述胰腺组织可以是含有psp的任何胰腺组织。例如，所述组织可包含哺乳动物胰腺组织。所述哺乳动物可以是人类。所述哺乳动物也可以是非人类动物。例如，所述哺乳动物可以是非人类灵长动物、马、绵羊、牛、猪、狗、猫和山羊。

所述制备方法的另一个实例可包括获得多个胰腺组织，将这些组织分离成细胞，分离psp(例如通过分选，针对如本文所述的psp标志物或分化潜能进行选择)，以及使用psp制备组合物。在这个实例中，所述多个胰腺组织可包含从哺乳动物的胰腺的不同组织获得的组织。

胰腺组织可从经受治疗的哺乳动物获得。在这种方法中，治疗可以是自体psp细胞治疗。组织也可以从除经受治疗的哺乳动物之外的哺乳动物获得。在这种方法中，治疗可以是同种异体psp细胞治疗。也可以应用所述治疗方法的组合。例如，治疗可包括自体psp细胞治疗和同种异体psp细胞治疗。

可使用任何合适的方法将胰腺组织分离成细胞，例如机械方法、化学方法，或机械和化学方法的组合。

合适的机械方法的实例包括切碎、撕碎、过滤等。在其它实例中，胰腺组织可通过使用均化器、超声发生器、球磨机等分离成细胞。这些机械方法的组合也可以用于获得分离的细胞。

合适的化学方法的实例包括通过使用酸、碱和酶消化胰腺组织。例如，可使用胶原酶和分散酶来消化组织。所述胶原酶可以是i型胶原酶。所述分散酶可以是分散酶ii。例如，可通过使用含有胶原酶的磷酸盐缓冲溶液来消化胰腺组织。这些化学方法的组合也可用于获得分离的细胞。

所述制备方法还可包括通过使用机械方法从消化的组织制备细胞悬浮液。这种方法的实例可以是过滤消化的组织以获得细胞悬浮液。所述细胞悬浮液可以是单细胞悬浮液。例如，可通过使消化的胰腺组织穿过70微米过滤器来获得单细胞悬浮液。

培养分离的细胞可包括提供固体表面，将细胞接种在所述固体表面上，在合适的培养基中培养接种的细胞，并由此获得包含可能粘附到固体表面的细胞(“粘附细胞”)和可能不粘附到固体表面的细胞(“非粘附细胞”)的培养物。所述粘附细胞和/或非粘附细胞可用于制备组合物。

固体表面可以是适合于培养细胞的任何固体制品的表面。例如，它可以是培养容器的壁。培养容器可以是任何所需的培养容器。例如，培养容器可以是陪替氏培养皿(petridish)或细胞培养皿。固体制品也可以是珠粒或颗粒。固体制品可具有任何期望的尺寸。例如，它可以是纳米颗粒。

可以使用溶液接种细胞。所述溶液可包含适合于培养哺乳动物细胞的培养基。这种培养基的实例可以是由invitrogen(carlsbad,ca)制造的a-mem。所述溶液还可以包含胎牛血清(fbs)、l-谷氨酰胺、2-巯基乙醇、青霉素和链霉素。

所述制备方法还可包括从培养物中除去不粘附到固体表面的细胞。例如，可使用pbs或其它合适的缓冲液洗涤培养物，以从培养物中除去不粘附到固体表面的细胞。

粘附细胞可进一步在例如上文公开的相同条件下培养和/或用于制备根据本公开的细胞组合物。

所述制备方法还可包括从固体表面解离可能粘附于固体表面的细胞。粘附细胞可通过使用酶从固体表面解离。所述酶例如可以是胰蛋白酶。

所述制备方法还可包括扩增培养的细胞。例如，扩增培养的细胞可包括通过使用上文公开的制备方法将所述细胞反复地重新接种(传代)而使psp细胞倍增。

所述组合物可包含胰腺基质祖细胞(psp)。该组合物可包含有效治疗人类的量的psp，所述人类患有影响人体如何使用血糖的疾病。上文公开了这种疾病的实例。psp可包括人类psp。

治疗人类受试者的方法可包括向人类受试者施用有效量的包含psp的组合物，并由此治疗影响人体如何使用血糖的疾病。所述组合物可包含有效量的psp，使得组合物能有效治疗影响人体如何使用血糖的疾病。

本公开还涉及施用包含psp的组合物的方法(“施用方法”)。所述施用方法可包括适合于施用细胞或组织的任何方法。所述施用方法可包括适合于施用psp的任何方法。适合于治疗目的的包含psp的组合物可以以各种方式施用(或递送)。例如，它们可以被输注，注射在各个部位，或者手术植入。在一些实施方式中，所述方法可包括施用作为单一组合物的组分或作为单独的组合物的psp。当作为单独的组合物施用时，所述组合物被施用以提供psp的治疗活性的重叠。

所述组合物可以以有效治疗哺乳动物的量施用。组合物中psp的量(“剂量”)可以是有效治疗哺乳动物的量。可以选择组合物中psp的量和/或浓度以提供(所治疗的哺乳动物可接受的组合物的)量的方便施用。例如，含有高浓度psp的液体组合物适合于将相对小的体积注射到固体组织中，而含有较低浓度psp的液体组合物可能有利于通过静脉内输注施用。合适的液体组合物可含有例如约1×10¹个干细胞/ml至约1×10¹⁰个干细胞/ml，或约1×10⁵个干细胞/ml至约1×10⁷个干细胞/ml，或约1×10⁶个干细胞/ml至5×10⁶个干细胞/ml。聚集的或固体组合物可含有例如约1×10¹个干细胞/mg至约1×10¹⁰个干细胞/g。

所述组合物可包含1×10¹个干细胞/kg至1×10¹⁰个干细胞/kg、或1×10⁵个干细胞/kg至1×10⁷个干细胞/kg、或1×10⁶个干细胞/kg至5×10⁶个干细胞/kg的范围内的量的psp。

所述组合物还可包含每千克患者体重1×10¹个干细胞至每千克患者体重1×10¹⁰个干细胞；或每千克患者体重1×10⁵个干细胞至每千克患者体重1×10⁷个干细胞；或每千克患者体重1×10⁶个干细胞至每千克患者体重5×10⁶个干细胞的范围内的量的psp。

对于治疗目的，可将有效量的组合物施用于有需要的哺乳动物。“有效量”是在施用条件下产生期望效果的量。例如，治疗有效量可以是足以治疗糖尿病的量。待施用的psp的确切剂量可取决于多种因素，包括哺乳动物的年龄、体重和性别，所治疗的疾病，以及其程度和严重性。具有普通技术的临床医师可以基于这些和其它考虑来确定适当的剂量和施用方法。

合适的组合物可包括例如在液体(优选水性)介质中的psp悬浮液，或者具有或不具有固体支撑物或封装材料的聚集形式的psp。所述液体介质可以是药学上可接受的液体介质。所述液体介质也可适用于注射。合适的液体介质的一些实例通常是众所周知的，包括但不限于生理盐水(含或不含葡萄糖和/或钾)、林格氏溶液(ringer'ssolution)、乳酸化林格氏溶液和哈特曼溶液(hartmann'ssolution)。

所述组合物还可包含载体。所述载体可能适合承载psp。载体的实例可以是基质、组织、纤维、珠粒或其它材料的形式。

如本领域技术人员将理解的，也可以进行和遵循本文描述的包含psp的组合物、其制备方法以及其使用或施用方法的任何组合。

本公开的其它示例性实施方式如下。

实施例1.胰腺基质祖细胞。

我们已经开发了从小鼠胰腺中分离il6^高胰腺基质祖细胞(psp)的方法，并且表明，psp表达高水平的il6并能够形成集落簇。此外，psp对sca1、cd105、波形蛋白、cd44和cd29呈阳性，但对cd13、cd73、cd34和cd45呈阴性。psp表现出分化成成骨细胞和成脂细胞的能力。当在体外培养时，psp表现出保护链脲霉素诱导的β细胞免受损伤和增强β细胞介导的胰岛素产生的能力。当植入肾囊中时，psp可以形成具有再生的朗格罕氏岛的胰腺组织。

实施例2.il6^高胰腺基质祖细胞的分离和表征。

将小鼠胰腺组织切碎成小于1-3mm²的片段，并在约37℃下在含有约1mg/ml胶原酶i(worthingtonbiochemicalcorporation,lakewood,nj)和约2mg/ml分散酶(roche)的无菌磷酸盐缓冲溶液(pbs)中消化约1小时。将解离的细胞悬浮液通过70μm细胞过滤器(falcon,franklinlakes,nj)过滤，并在含有约20％胎牛血清(fbs：clontechlaboratories,inc.,mountainview,ca)、约100u/ml青霉素/链霉素(invitrogen)、约2mml-谷氨酰胺和约550μm2-巯基乙醇(2-me；sigma-aldrich)的最小必需培养基(mem：invitrogen)中铺板在未处理的10cm陪替氏培养皿(vwrscientificproducts,willard,oh)上。使用含有约1mmedta的约0.05％胰蛋白酶将细胞连续亚培养，并在约37℃下在约5％co2/95％空气中保持在加湿培养箱中(图1a)。

为了评估集落形成效率，用约4％多聚甲醛固定第10天培养物，然后用约0.1％甲苯胺蓝染色。将≥50个细胞的聚集体作为集落进行评分(图1b)。

免疫荧光染色：将约4％多聚甲醛固定的培养细胞用特异性第一抗体进行免疫标记，然后用alexa488和/或alexa568偶联的第二抗体(molecularprobes,inc.lifetechnologiescorporation)进行免疫标记。所述第一抗体包括cd105、sca1、波形蛋白、cd29和cd44。在用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)对细胞核进行复染后，在荧光显微镜下观察样品。使用同种型匹配的对照抗体(invitrogen)作为阴性对照。这些数据显示，psp表达cd105、sca1、波形蛋白、cd29和cd44(图2a)。

流式细胞分析。将大约5×10⁵个细胞与特异性针对人类cd13、cd34、cd45和73的pe或fitc偶联的小鼠单克隆抗体或同种型匹配的对照igg(bdbiosciences)进行温育，并使用beckmancoulter流式细胞仪和facscan程序(bdbiosciences,sanjose,ca)进行流式细胞分析。我们的数据显示，psp对cd13、cd34、cd45和73抗体染色呈阴性(图2b)。

细胞因子阵列(r&dsystems,inc.)分析显示，当与骨髓间充质干细胞相比时，psp表达升高水平的il6(图3a)。使用rneasymini试剂盒(qiagen)从培养细胞中分离总rna后，qpcr和免疫荧光染色证实，与bmsc相比，psp表达更高水平的il6(图3b、3c)。

将psp在培养基中以5×10⁵个细胞/孔铺板在6孔板中，使其粘附过夜，并更换为补充有地塞米松、l-谷氨酰胺、抗坏血酸和β-甘油磷酸酯的成骨诱导培养基(pt-3002，cambrex,charlescity,ia)。4～5周后，通过茜素红s(sigma-aldrich)染色测定体外矿化。我们的数据显示，psp具有成骨分化能力(图4a)。

将psp在补充有约10μm人类胰岛素、约1μm地塞米松、约200μm吲哚美辛和约0.5mm3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(sigma-aldrich,stlouis,mo)的成脂诱导培养基中进行铺板。进行油红o染色以检测脂肪细胞特征性的细胞内脂质空泡。我们的数据显示，psp具有非常有限的分化成脂肪细胞的能力(图4b)。

葡萄糖刺激的胰岛素分泌(gsis)。psp在约3.3mm或约11.1mm葡萄糖下培养过夜，将min-6细胞与约3.3mm或约16.7mm葡萄糖温育约1小时。收集培养基样品并测量胰岛素和甘油的水平。(图5)。

实施例3.肾囊植入物。

为了确定组织再生和发育，使用约35mg/kgbwip的氯胺酮、约5mg/kgbwip的甲苯噻嗪麻醉免疫受损的小鼠，并以其腹部置于无菌手术巾上。将背面的手术区域的皮肤剃毛(裸鼠未剃毛)，然后用必妥碘(betadine)和酒精的3组交替擦洗来清洁皮肤。沿着脊柱在尾部作一个小切口。将皮肤移到左边，并且用剪刀在肾脏上方的肋骨正后方作另一个切口。用5号镊子的细尖打开肾囊，并且将细胞或组织团块放置在肾囊下。使用5/0可吸收缝合线缝合腹腔。皮肤切口用4-0尼龙和dermabond封闭。将动物放置在带有观察卡的新笼子中的加热垫上。当动物从麻醉中开始恢复时，向它们给予丁丙诺啡(0.05-0.1mg/kg，皮下)，并在手术后密切观察约48小时。如上所述观察小鼠，并在收获肾囊移植产品的手术后28-48天安乐死。h&e染色显示，植入的psp产生的胰腺细胞和朗格罕氏岛结构(图6a、6b)。免疫荧光染色显示，胰岛细胞表达胰岛素和胰高血糖素(图6c、6d)。

也可以进行和遵循本文描述的产品如包含胰腺基质祖细胞的组合物、其制备方法以及其使用方法的任何组合。

所讨论的组件、步骤、特征、目的、益处和优点仅仅是说明性的。它们中的任一种以及与其相关的讨论都不旨在以任何方式限制保护范围。还设想了许多其它实施方式。它们包括具有较少、额外和/或不同的组件、步骤、特征、目的、益处和/或优点的实施方式。它们还包括其中组件和/或步骤被不同地排列和/或排序的实施方式。

除非另有说明，否则本公开中阐述的所有测量结果、数值、等级、位置、量值、尺寸和其它规格都是近似值，而不是精确值。它们旨在具有与其相关功能和其所属领域中的常规范围相一致的合理范围。

在本公开中引用的所有文章、专利、专利申请和其它出版物都通过引用并入本文。

在本公开中，不带具体数量的指称和短语“一个或多个”和“至少一个”是同义的并且是指“至少一个”。

诸如“第一”和“第二”等的关系术语可以仅用于将一个实体或动作与另一个实体或动作区分开，而不一定需要或暗示它们之间的任何实际关系或顺序。术语“包含”及其任何其它变体当与本说明书或权利要求书中的要素列表结合使用时，旨在表示该列表不是排他性的，并且可包括其它要素。类似地，不带具体数量的要素在没有进一步约束的情况下不排除存在相同类型的其它要素。

提供摘要以帮助读者快速确定技术公开的性质。对于摘要的提交，应理解，它不用于解释或限制权利要求的范围或含义。此外，上述详细描述中的各种特征被一起分组在各种实施方式中以简化本公开。本公开方法不应被解释为要求所要求保护的实施方式需要比每个权利要求中明确叙述的更多的特征。相反，如权利要求所反映的，本发明的主题在于少于单个公开的实施方式的所有特征。因此，权利要求特此并入详细描述中，其中每个权利要求独立地作为单独要求保护的主题。