一种细胞生长因子冻干粉、制备方法及应用与流程

本发明涉及干细胞技术领域，具体涉及一种细胞生长因子冻干粉、制备方法及应用。

背景技术：
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MSC是目前研究最多的干细胞，目前许多临床试验以证实MSC能够治疗多种疾病，并且具有较好效果，细胞生长因子是一种多功能强力细胞因子，对促进成纤维细胞的代谢和胶原蛋白的形成发挥着重要功能。在体内的含量极微，但是具有很高的生物活性；能够促进和调控皮肤细胞的分裂、增殖和分化，对多种细胞生理功能和代谢活动发挥生物调节作用，具有延缓皮肤细胞衰老、促进表皮细胞的修复和生长作用，使皮肤光滑丰润，堪称我们的青春因子。市场上现有的技术主要是将细胞因子提取后制备成脂质体包裹物，或者注射液，或者涂抹剂，由于细胞因子生物活性会由于保存不当随着时间的延长慢慢消失这一时效性特点，因此并不能发挥细胞因子真正的效果。基于上述原因，直接将MSC为来源的细胞因子制备冻干粉视为保护细胞因子活性最为简单有效的办法，如专利CN106367386 A就采取直接将其冷冻干燥的方法进行保存，CN 106109496 A在此基础上加入海藻糖作为保护剂，进一步保护细胞因子的活性与性质，但是海藻糖或其他外源添加剂有可能引起排斥反应，造成过敏或吸收不良的状况。

技术实现要素：
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为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种细胞生长因子冻干粉、制备方法及应用。

具体技术方案如下：

一种细胞生长因子冻干粉，其不同之处在于，所述细胞生长因子冻干粉是由脐带间充质干细胞传代培养2～3代的细胞培养上清液进行冰冻后制备而成，并加入人血白蛋白作为保护剂。

一种细胞生长因子冻干粉制备方法，其不同之处在于，其包括以下步骤：

A:将脐带间充质干细胞进行分离；

B:将脐带间充质干细胞加入培养基中进行传代培养；

C:收集步骤B中脐带间充质干细胞培养上清液，加入甘露醇与人血白蛋白后先将细胞培养上清液抽至离心管中放置低温冰箱或者液氮罐中冻存至固态状，使培养基完全冰冻结实，将固态状的冰冻培养基放置冻存瓶中，然后上机冷冻干燥12-24h制成冻干粉，并冷藏保存。

上述技术方案中，所述步骤A包括以下步骤:

A1：分离新鲜脐带血管周围的沃顿胶，剪碎；

A2：放入Ⅰ型胶原酶中，加入双抗和两性霉素B，混合均匀后置于培养箱中37℃过夜，取出后加入胰酶，再次置于培养箱中37℃，消化30min；

A3：消化后,用生理盐水稀释4～6倍后3000rpm离心15～20min；

A4：离心后弃上清液，加入培养基混悬后转入培养皿中，每皿加添加剂，双抗和两性霉素B,置培养箱中培养,根据培养状态进行换液，待细胞长满后传代培养。

上述技术方案中，所述步骤B包括以下步骤:

B1：细胞长满后进行传代，按1:(3～5)传代，吸取步骤A4中培养基至离心管；

B2:在离心管中加入生理盐水和浓度为0.05％胰酶，混匀消化，消化好后加入培养基终止消化；

B3：把消化好细胞洗下来收集到离心管中，1800rpm离心5min；

B4：离心后弃上清，加入培养基(含添加剂)混悬，稀释后转入培养皿；

B5：放入培养箱中培养。

上述一种细胞生长因子冻干粉在延缓皮肤衰老，促进胶原蛋白生长、补充皮肤水分、缩小皮肤毛孔以及淡化皮肤黑色素中的应用。

上述技术方案中，所述冻干粉在使用时用溶酶溶解后使用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)本发明采用直接冷冻干燥的方法，该方法有效地防止了细胞因子理化及生物特性的改变，对细胞结构和特征的损伤较小，使其快速进入休眠状态，有效保护了其有效成份(蛋白质、微生物)的稳定性；细胞因子培养基经过冻干后水份含量非常低，使细胞因子的稳定性提高，受污染的机会减小，这不仅方便了运输还延长了细胞因子的保存期限。

(2)本发明在冻干粉中添加人血白蛋白作为保护剂，进一步延长了细胞因子的保存期限，相较于外源添加剂做为保护剂，其保护效果更好，细胞因子冻干粉剂在干燥后形态疏松、颜色基本不发生改变，加水后能够快速溶解并恢复原有水溶液的理化特性和生物活性，且人血白蛋白来自人体，不易引起过敏及其他排斥反应，更易吸收。

(3)加入人血白蛋白作为保护剂，对于细胞因子中易氧化的物质具有很好的保护作用，对皮肤有抗氧化的功效，进一步延缓皮肤衰老。

附图说明

图1为实施例一间充质干细胞流式检测鉴定图；

图2为不同保存条件下细胞因子活性对比图；

图3不同细胞因子产品4℃保存条件下细胞因子表皮生长因子(EGF)活性对比图。

图4不同细胞因子产品4℃保存条件下纤维母细胞生长因子(bFGF)活性对比图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例一

细胞因子冻干粉的制备

A:间充质干细胞分离培养

1)用无菌瓶(200ml生理盐水+一支庆大霉素)取回新鲜脐带；

2)分离血管周围的沃顿胶(Wharton’s jelly)，剪碎；

3)放入2mg/mlⅠ型胶原酶中(约15ml)；

4)加入200μl的双抗和200μl的两性霉素B，混合均匀后置于培养箱中(37℃)过夜；

5)取出后加入10ml(视胶原酶消化情况而定)胰酶，再次置于培养箱中(37℃)消化30min；

6)取出,用生理盐水稀释4～6倍后3000rpm离心15～20min；

7)弃上清，加培养基混悬后转入2～3个培养皿中(约20ml/皿)，每皿加1ml添加剂，200μl的双抗和200μl的两性霉素B,置培养箱中培养；

8)根据培养状态适时适量换液，待细胞长满后传代培养。

B:间充质干细胞传代

1)细胞长满后(1×10⁷)进行传代，按1:(3～5)进行传代培养。

2)吸取皿中部分培养基至50ml离心管(3ml/皿)，剩余转至废液缸；

3)每皿加8ml生理盐水和2ml 0.25％的胰酶(胰酶终浓度0.05％)；

4)混匀消化适量时间(1min)，看到细胞飘起来或于镜下观察确认细胞消化好后加入培养基终止消化，每皿加3ml；

5)用移液管吹打皿底把细胞洗下来(5～6次)，然后收集到50ml离心管中，1800rpm离心5min；

6)弃上清，加入培养基(含添加剂)混悬，按所需细胞密度稀释后转入皿中，每皿16～20ml；

7)放入培养箱中培养。上述培养基均采用人血清替代物培养基，不含任何动物血清，不会引起过敏反应。

C:间充质干细胞流式检测鉴定

1)用0.1％胰蛋白酶/柠檬酸消化液将生长状态良好的MSC细胞消化下来；

2)用50μlPBS混悬，然后分别加入10μlCD31-FITC，10μlCD73-PE，10μlDRPer CP，5μlCD29-APC，避光孵育15min；

3)用PBS清洗一遍，后1000rpm/min，离心5min；

4)沉淀用500μlPBS重悬后，上流式细胞仪检测分析，测试结果如附图1所示。

D、冷冻干燥

选取脐带间充质干细胞传代培养2～3代的培养上清液，加入5％wt甘露醇作为赋形剂与5％～10％wt人血白蛋白后作为保护剂，先将细胞培养上清液抽至离心管中放置低温冰箱或者液氮罐中冻存至固态状，使培养基完全冰冻结实，将固态状的冰冻培养基放置冻存瓶中，然后上机冷冻干燥12-24h制成冻干粉，并在4℃或-20℃下冷藏保存。

采用第二第三代次的干细胞培养上清液，因其干细胞里面含有的端粒酶活性更高，所以细胞因子活性更好。

对比例一

细胞因子冻干粉的制备

A:间充质干细胞分离培养

1)用无菌瓶(200ml生理盐水+一支庆大霉素)取回新鲜脐带；

2)分离血管周围的沃顿胶(Wharton’s jelly)，剪碎；

3)放入2mg/mlⅠ型胶原酶中(约15ml)；

4)加入200μl的双抗和200μl的两性霉素B，混合均匀后置于培养箱中(37℃)过夜；

5)取出后加入10ml(视胶原酶消化情况而定)胰酶，再次置于培养箱中(37℃)消化30min；

6)取出,用生理盐水稀释4～6倍后3000rpm离心15～20min；

7)弃上清，加培养基混悬后转入2～3个培养皿中(约20ml/皿)，每皿加1ml添加剂，200μl的双抗和200μl的两性霉素B,置培养箱中培养；

8)根据培养状态适时适量换液，待细胞长满后传代培养。

B:间充质干细胞传代

1)细胞长满后(1×10⁷)进行传代。按1:(3～5)传代。

2)吸取皿中部分培养基至50ml离心管(3ml/皿)，剩余转至废液缸；

3)每皿加8ml生理盐水和2ml 0.25％的胰酶(胰酶终浓度0.05％)；

4)混匀消化适量时间(1min)，看到细胞飘起来或于镜下观察确认细胞消化好后加入培养基终止消化，每皿加3ml；

5)用移液管吹打皿底把细胞洗下来(5～6次)，然后收集到50ml离心管中，1800rpm离心5min；

6)弃上清，加入培养基(含添加剂)混悬，按所需细胞密度稀释后转入皿中，每皿16～20ml；

7)放入培养箱中培养。上述培养基均采用人血清培养基，不含任何动物血清，不会引起过敏反应。

C、冷冻干燥

选取脐带间充质干细胞传代培养2～3代的培养上清液，加入5％wt甘露醇作为赋形剂，先将细胞培养上清液抽至离心管中放置低温冰箱或者液氮罐中冻存至固态状，使培养基完全冰冻结实，将固态状的冰冻培养基放置冻存瓶中，然后上机冷冻干燥12-24h制成冻干粉，并在4℃或-20℃下冷藏保存。

对比例2

A:间充质干细胞分离培养

4)用无菌瓶(200ml生理盐水+一支庆大霉素)取回新鲜脐带；

5)分离血管周围的沃顿胶(Wharton’s jelly)，剪碎；

6)放入2mg/mlⅠ型胶原酶中(约15ml)；

4)加入200μl的双抗和200μl的两性霉素B，混合均匀后置于培养箱中(37℃)过夜；

9)取出后加入10ml(视胶原酶消化情况而定)胰酶，再次置于培养箱中(37℃)消化30min；

10)取出,用生理盐水稀释4～6倍后3000rpm离心15～20min；

11)弃上清，加培养基混悬后转入2～3个培养皿中(约20ml/皿)，每皿加1ml添加剂，200μl的双抗和200μl的两性霉素B,置培养箱中培养；

12)根据培养状态适时适量换液，待细胞长满后传代培养。

B:间充质干细胞传代

4)细胞长满后(1×10⁷)进行传代。按1:(3～5)传代。

5)吸取皿中部分培养基至50ml离心管(3ml/皿)，剩余转至废液缸；

6)每皿加8ml生理盐水和2ml 0.25％的胰酶(胰酶终浓度0.05％)；

4)混匀消化适量时间(1min)，看到细胞飘起来或于镜下观察确认细胞消化好后加入培养基终止消化，每皿加3ml；

8)用移液管吹打皿底把细胞洗下来(5～6次)，然后收集到50ml离心管中，1800rpm离心5min；

9)弃上清，加入培养基(含添加剂)混悬，按所需细胞密度稀释后转入皿中，每皿16～20ml；

10)放入培养箱中培养。上述培养基均采用人血清培养基，不含任何动物血清，不会引起过敏反应。

C、冷冻干燥

选取脐带间充质干细胞传代培养2～3代的培养上清液，加入5％wt甘露醇作为赋形剂，加入5％～10％wt海藻糖作为保护剂，先将细胞培养上清液抽至离心管中放置低温冰箱或者液氮罐中冻存至固态状，使培养基完全冰冻结实，将固态状的冰冻培养基放置冻存瓶中，然后上机冷冻干燥12-24h制成冻干粉，并在4℃或-20℃下冷藏保存。

实施例二

不同保存条件下细胞因子活性对比

冻干粉不同保存条件下，细胞因子表皮生长因子(EGF)、血管内皮生长因子(VEGF)、纤维母细胞生长因子(FGF)、外泌体(exosome)含量测定实验，实验结果如附图二所示。

实验结果表明细胞生长因子冻干粉的保藏温度在4℃及-20℃以下可保证其良好的活性。

不同细胞因子产品4℃保存条件下活性对比

分别将本发明冻干粉、对比例一冻干粉、对比例二冻干粉、市场上干细胞成品面膜，常规4℃保存不同期限细胞因子EGF、bFGF含量测定实验：

1)分别将四种干细胞试验品放置4℃冰箱中，放置1个月、3个月、6个月、一年；

2)分别用EGF、bFGF的ELISA试剂盒检测这几种不同产品不同保存条件下细胞因子的含量；实验结果如附图3所示

实验结果表明在4℃保存条件下，本发明冻干粉相较于其他细胞因子产品其活性保持时间更长。现有技术中，细胞生长因子冻干粉的保藏温度在-20℃及以下，其保存起来相对困难，本发明生产冻干粉在4℃保存也可保证其良好的活性。

术语“细胞因子表皮生长因子(EGF)”，其主要功能是促进皮肤细胞的分裂,极微量的EGF即能强烈刺激细胞生长，抑制衰老基因表达，阻止皮肤衰老，使皮肤各组成份保持最佳生理状态；

术语“血管内皮生长因子(VEGF)”,是血管内皮细胞特异性的肝素结合生长因子，可在体内诱导血管新生(induce angiogenesis in vivo)，该因子能有效的促进血管再生。

术语“纤维母细胞生长因子(FGF)”，在不同组织器官中发挥多样性的作用,如促进血管生成、促进伤口愈合,参与胚胎发育过程等。另外,FGFs涉及到各种细胞过程,如趋药性、细胞增殖分化和迁移、细胞存活、细胞凋亡。

术语“外泌体(exosome)”更是具有修复受损的皮肤组织。

实施例三

皮肤测试实验

皮肤测试实验：本发明干细胞因子冻干粉与市场上干细胞面膜成品对人面部皮肤改善；

实验步骤：实验之前先使用CBS-807皮肤分析系统选取四个皮肤肤质相差不大的年轻女性A、B、C、D做皮肤测试试验：A用洗面奶将皮肤清洗干净后，将本发明干细胞因子冻干粉剂用溶酶溶解后，用无针注射器将细胞因子溶解液泵进面部皮肤上，呈T型全脸涂抹划开，然后敷上专用面膜，30min后取下，无须清洗；B用洗面奶将皮肤清洗干净后，将对比例一干细胞因子冻干粉剂用溶酶溶解后，用无针注射器将细胞因子溶解液泵进面部皮肤上，呈T型全脸涂抹划开，然后敷上专用面膜，30min后取下，无须清洗；C用洗面奶将皮肤清洗干净后，将对比例二干细胞因子冻干粉剂用溶酶溶解后，用无针注射器将细胞因子溶解液泵进面部皮肤上，呈T型全脸涂抹划开，然后敷上专用面膜，30min后取下，无须清洗；D将面部皮肤清洗干净后，敷上市场购买来的干细胞面膜30min后取下；用后一周、二周、一个月后用皮肤检测仪(CBS-807皮肤分析系统)检测皮肤的水分、毛孔、斑点、皱纹、弹性及肤色。结果显示干细胞因子冻干粉剂相比普通干细胞面膜能更好的改善人面部皮肤。

表1皮肤测试实验结果

从上表可以看出，使用本发明冻干粉后，其肤质明显改善。