多价t细胞受体复合物的制作方法

专利名称：多价t细胞受体复合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及多价形式的T细胞受体(TCRs)及其检测细胞的用途，在细胞的表面带有在主要组织相容性复合体(MHC)中呈递的特异性肽抗原，本发明还涉及传递方法，特别是使用多聚体TCRs将治疗剂传递到靶细胞中。
一般背景1.细胞表面上的抗原呈递MHC分子是可呈递通过适应性免疫系统的细胞器而在细胞表面上识别的短蛋白质片段即肽抗原的特异性蛋白质复合物。
I型MHC是一种由可变重链和恒定轻链组成的二聚化蛋白质复合物即β2微球蛋白。I型MHC呈递可在胞内加工、载入MHC中的结合裂缝并转运至细胞表面的肽类，其中所述的复合物通过MHC重链被锚定在膜内。肽类通常有8-11个氨基酸长，这取决于在MHC中结合时引入所述肽中的弯曲程度。由MHC重链的膜远端α1和α2结构域形成的结合裂缝具有“封闭”端，从而对可以被结合的肽的长度产生相当严格的限制。
II型MHC也是一种由α(重)和β(轻)链组成的二聚化蛋白质，两者是可变的糖蛋白并通过跨膜结构域贴壁在细胞中。类似于I型MHC，II型分子形成结合裂缝，其中插入了12-24个氨基酸的较长肽类。使肽类通过胞吞作用从胞外环境中被吸收并在载入随后被转运至细胞表面的II型复合物前被加工。
各细胞呈递高达6种不同的I型分子和大量类似的II型分子形式的肽类，所呈递的MHC复合物的总数在105-106/细胞的范围。据估计存在于I型分子中的肽类的多样性一般在1,000-10,000，它们中的90％以100-1,000个拷贝/细胞存在(Hunt，Michel等，1992；Chicz，Urban等，1993；Engelhard，Appella等，1993；Huczko，Bodnar等，1993)。认为最大量的肽类构成所呈递总肽的0.4-5％，这意味着可能存在高达20,000个相同的复合物。然而，最大量的单一肽复合物的平均数可能在2,000-4,000/细胞的范围，且可识别T细胞表位的一般呈递水平在100-500个复合物/细胞的范围(参见(Engelhard，1994)的综述)。2.抗原呈递细胞的识别大量细胞可以呈递抗原(如MHC-肽)并将具有该特性的细胞称作抗原呈递细胞(APC)。可呈递特殊抗原的细胞类型取决于抗原如何且在何处首次与免疫系统的细胞相遇。APCs包括在淋巴结和脾脏的T细胞区域中发现的大量镶嵌树突细胞；在皮肤中的朗格汉斯细胞；在淋巴组织的B细胞区域中的小结树突细胞；单核细胞/巨噬细胞系的单核细胞、巨噬细胞和其它细胞；B细胞和T细胞；以及诸如内皮细胞和成纤维细胞这样不属于APCs类别但可以以APC方式起作用的各种其它细胞。
由在胸腺中成熟的淋巴细胞亚群(T细胞)来识别抗原呈递细胞，其中它们进行了所设计的选择过程以便确保根除对自身肽有反应的T细胞(阴性选择)。此外，不具有识别所呈递的MHC变体(在男性中，HLA单元型)能力的T细胞未能成熟(阳性选择)。
T细胞对特异性MHC-肽复合物的识别是由α-和β-链组成的T细胞受体(TCR)介导的，所述的α-和β-链被锚定在膜中。在类似于对抗体基因所观察到的重组过程中，TCRα和β基因由在胞外抗原结合结构域中产生大量多样性的可变、连接、多样和恒定的元件重新排列(1013-1015种不同的可能性)。TCRs还以带有γ和δ链的不同形式存在，但它们仅存在于大约5％的T细胞上。
抗体和TCRs是唯一两类以特异性方式识别抗原的分子且由此TCR是对存在于MHC中特定肽抗原具有特异性的唯一受体，外源肽通常是细胞内异常的唯一标记。
以大量不同方式表达TCRs，各TCR对一种或几种MHC-肽复合物具有特异性。TCR与MHC-肽配体之间的连接是极其短寿命的，半衰期通常低于1秒。T细胞与靶细胞(假定是TCR/MHC-肽)之间的粘附依赖于多种TCR/MHC-肽连接物以及一定量的共同受体-配体连接物的应用。
当T细胞和抗原呈递细胞(APC)以直接的物理方式连接时发生T细胞识别且该过程通过抗原特异性TCRs与pMHC复合物连接而引发。TCR是一种与涉及介导信号转导的CD3复合物不变蛋白相关的免疫球蛋白超家族中的异二聚化细胞表面蛋白。TCRs以αβ和γδ型存在，它们在结构上相似并具有完全不同的结构位置和可能的功能。所述受体的胞外部分由两个膜近端恒定结构域和两个膜远端可变结构域组成，其中的两个膜远端可变结构域具有类似于抗体的互补性决定区(CDRs)的高度多形态的环状结构。就是这些环状结构可形成TCR分子的MHC-结合位点并决定肽的特异性。MHC I型和II型配体也是免疫球蛋白超家族蛋白质并对抗原呈递具有特异性，高度多形的肽结合位点能够使它们在APC细胞表面呈现不同排列的短肽片段。
近来，这些相互作用的实例已经在结构上特征化(Garboczi，Ghosh等，1996；Garcia，Degano等，1996；Ding，Smith等，1998)。鼠和人I型pMHC-TCR复合物的晶体结构表明了TCR在其pMHC配体内的对角方向并显示出了在其相联处具有极差的形状互补性。CDR3环状结构仅连接肽残基。连接与未连接的TCR结构的比较结果也提示在TCR CDR环状结构中存在弹性程度(Garboczi和Biddison，1999)。
T细胞激活模型试图解释在T细胞与抗原呈递细胞(APC)相联处的这类蛋白质-蛋白质相互作用如何引发诸如杀死病毒感染的靶细胞这样的反应。在许多这些模型中涉及TCR-pMHC相互作用的物理特性作为关键参数。例如，已经发现TCR解离率的定量改变可解释成受体接合(诸如完全或部分T细胞激活)或拮抗作用的生物结果中的定性差异(Matsui，Boniface等，1994；Rabinowitz，Beeson等，1996；Davis，Boniface等，1998)。
已经证实TCR-pMHC相互作用具有低亲和性和相对缓慢的动力学特性。许多研究已经使用了生物传感器技术诸如BiacoreTM(Willcox，Gao等，1999；Wyer，Willcox等，1999)，该项技术利用了表面胞质共振(SPR)并能够测定蛋白质-蛋白质相互作用的直接亲和性和适时的动力学测量(Garcia，Scott等，1996；Davis，Boniface等，1998)。然而，所研究的受体是同种异体反应的TCRs或对人工免疫原的反应提高的那些TCRs。3.TCR和CD8与MHC-肽复合物的相互作用大多数由I型MHC-肽复合物结合的T细胞(即，它们可识别I型MHC-肽复合物)也需要接合共同受体CD8以用于激活，而由II型MHC结合的T细胞需要结合CD4。还不完全清楚所述的共同受体在T细胞激活中的确切功能。两者均不是控制激活的关键机理和参数。然而，CD8和CD4两者均带有与激酶p56lck相关的胞质结构域，所述的激酶p56lck涉及使T细胞激活特征化的最早期的酪氨酸磷酸化情况。CD8是一种二聚化受体，它以αα型被表达或更常见的是以αβ型被表达。CD4是一种单体。在CD8受体中，仅α- 链与p56lck相关。
近期使用可溶性受体形式测定的控制TCR和CD8与MHC结合的物理参数已经证实通过TCR的结合可控制识别过程。TCR对MHC的亲和性明显高于所述的共同受体(Willcox，Gao等，1999；Wyer，Willcox等，1999)。
所述受体与MHC的各种相互作用在生理温度下即37℃下是极为短寿命的。使用对由HLA-A*0201(HLA-A2)呈递的流感病毒“基质”肽具有特异性的人TCR测定的TCR-MHC/肽相互作用半衰期的近似数值是0.7秒。CD8αα与这种MHC/肽复合物的相互作用的半衰期低于0.01秒即至少比前者快18倍。4.可溶性MHC-肽复合物的生产首先通过使用木瓜蛋白酶裂解抗原呈递细胞的表面分子来获得可溶性MHC-肽复合物(Bjorkman，Strominger等，1985)。尽管这种方法产生了结晶物质，但是近年来已经通过在大肠杆菌中分别表达重链和轻链、随后在有合成肽存在的情况下重折叠而替代了I型分子(Garboczi，Hung等，1992；Madden，Garboczi等，1993；Garboczi，Madden等，1994；Reid，McAdam等，1996；Reid，Smith等，1996；Smith，Reid等，1996；Smith，Reid等，1996；Gao，Tormo等，1997；Gao，Gerth等，1998)。这种方法超过现有方法的几个优点在于以较低的成本获得较高的产率、抗原准确地控制肽的同一性且终产物更为均匀。此外，可以方便地进行对所修饰重链或轻链的表达、例如与蛋白标记物的融合。5.MHC-肽四聚体肽-MHC与TCR和CD8受体之间的个别结合事件的短的半衰期使这一相互作用不适用于检测方法的发展。这个问题已经被使用肽-MHC复合物的四聚体分子的新技术(Altman等，1996)所克服。多聚体相互作用的高的亲合力使得与T细胞结合的分子的半衰期比以单聚体肽-MHC复合物的结合将会获得的半衰期显著延长。这一技术在WO96/26962中也有描述。
四聚体肽-MHC复合物是用合成肽，即β2微球蛋白(通常在大肠杆菌中表达)，和可溶性MHC重链(也在大肠杆菌中表达)构成的。在跨膜区的起始处截断MHC重链，用构成细菌修饰酶BirA的识别序列的蛋白质标记取代跨膜区(Barker和Campbell，1981；Barker和Campbell，1981；Schatz，1993)。BirA催化在有点冗余的识别序列中赖氨酸残基的生物素化(Schatz，1993)，然而，其特异性要足够高以确保绝大多数蛋白质只在标记的特定位置上被生物素化。然后生物素化蛋白质便可与其中每个都有四个生物素结合位点的抗生物素蛋白、链霉抗生物素或外抗生物素蛋白(sigma)共价连接，生成肽-MHC复合物的四聚体分子(Altman等，1996)。6.MHC-肽四聚体和T细胞的染色WO 96/26962和Altman等(1996)也描述了使用制成四聚体分子的可溶性MHC-肽复合物染色具有特殊特异性的T细胞的技术。这一技术已在T细胞的检测和量化中获得了科学上的意义(Callen等，1998；Dunbar等，1998；MCHeyzer Williams等，1996；Murali Krishna等，1998；Ogg等，1998)并且可能在诊断上具有潜力(参见McMichael和O’Callaghan，1998)。虽然MHC与TCR和CD8之间相互作用的半衰期(如用可溶性蛋白质所测得的)很短，即短于1秒钟，但是用四聚体可获得稳定的结合，因此能够检测染色。这是由于四聚体与T细胞之间的多聚体相互作用较高的亲合力。7.可溶性TCR近来仅描述了许多方法可生产可溶性TCR。一般来说，所有的方法描述的是截短形式的TCR，它们仅含有胞外域或胞外和胞质结构域。因此，在所有情况中，跨膜结构域已经从所表达的蛋白质中缺失。尽管许多报导证明按照所述方法生产的TCR可以被TCR特异性抗体所识别(表明已经将由所述抗体识别的部分重组TCR进行了正确折叠)，但是还没有人能够以高产率生产在低浓度下保持稳定并可以识别MHC-肽复合物的可溶性TCR。
第一种生产可结晶物质的方法充分利用了在真核细胞中的表达，而生产该物质是极其昂贵的(Garcia，Degano等，1996；Garcia，Scott等，1996)。另一种已经生产了可结晶物质的方法充分利用了类似于已经预先用于MHC-肽复合物的大肠杆菌表达系统(Garboczi，Ghosh等，1996；Garboczi，Utz等，1996)。已经证明后一种方法一般不实用，该方法包括表达在与形成链间二硫键发生关联、随后在体外重折叠的半胱氨酸残基前立即截短的TCR链的胞外部分。大多数异二聚化TCRs在以这种方式生产时看起来不稳定，这是由于α与β链之间的低亲和性所导致的。
此外，存在许多对工程化生产可溶性TCR的其它描述。它们中的某些仅描述了表达TCR的α或β链，由此产生无法保持MHC-肽特异性结合的蛋白质(Calaman，Carson等，1993；Ishii，Nakano等，1995)。已经获得了不含α链的β链结晶它们是独立的或与超抗原结合(Bentley，Boulot等，1995；Boult，Bentley等1994；Fields，Malchiodi等，1996)。
其它报导描述了用于表达异二聚化γ/δ或α/β TCR的方法(Corr，Slanetz等，1994；Eilat，Kikuchi等，1992；Gregoire，Rebai等，1996；Gregoire，Malissen等，1991；Ishii，Nakano等，1995；Necker，Rebai等，1991；Romagne，Peyrat等，1996；)。在某些情况中，已经将TCR表达为单链融合蛋白(Broker，Peter等，1993；Gregoire，Malissen等，1996；Schlueter，Schodin等，1996；Weber，Traunecker等，1992；)。另一种策略是将TCR链表达为与Ig铰合部和恒定结构域融合的嵌合蛋白(Eilat，Kikuchi等，1992；Weber，Traunecker等，1992)。已经用所设计的可形成彼此具有高亲和性和特异性的卷曲螺旋的序列表达了其它嵌合型TCR蛋白，由此使TCRα-β连接物保持稳定并增加可溶性。已报道了这种策略由杆状病毒表达系统和由大肠杆菌都能产生可溶性TCR(Chang，Bao等，1994)Golden，Khandekar等，1997)。
本发明描述了制备能够识别TCR配体的可溶性TCR的方法。根据该方法的优选实施方案，TCR的胞外片段作为与c-jun和c-fos的“亮氨酸拉链”的融合体独立地表达，然后在体外折叠。TCR链不形成链间二硫键，因为它们正好在参与形成天然TCR中的二硫键的半胱氨酸残基之前被截断。而α和β链的异二聚化接触得到介导在其天然蛋白中的异二聚化的这两个亮氨酸拉链片段的支持。8.用TCR检测T细胞对抗原呈递细胞的肽特异性识别是基于通过多重低亲和力受体/配体相互作用获得的亲合力。这些相互作用包括TCR/MHC-肽相互作用和许多共同受体/配体相互作用。II型限制和I型限制T细胞的CD4和CD8共同受体也分别具有MHC，而非肽，作为它们的配体。然而，CD4和CD8与之相互作的MHC上的表位不与和TCR相互作用的表位交搭。
这种识别机制表明了这样的可能性，即抗原呈递细胞的肽特异性识别能够以接触的半衰期可能具有治疗用途的方式被可溶性TCR所介导。然而，在缺乏共同受体支持下通过多重TCR/MHC-肽相互作用的亲合力获得的稳定性是否足以达到这样的目的尚不清楚。Plaksin等人报道了可溶性TCR对抗原呈递细胞的染色(Plaksin等人，1997)。此结果是用所谓的单链TCR获得的，单个蛋白质由TCR的α和β链的四个结构域中的三个组成。然而，通过将抗原呈递细胞与化学修饰的TCR一起培养，然后交联(不能在体内实施的方法)来进行染色。此外，该方法仅仅令人信服地检测到肽的水平(抗原呈递细胞与约100μM肽一起培养)，测得的水平远远大于在体内呈现出的肽的水平。
T细胞的特异性染色能够用MHC-肽四聚体来完成的事实(Altman等人，1996)—“交互”情况会被认为给以下想法提供了很大的支持多聚TCR大概介导与呈递表面上的有关肽抗原的细胞相对稳定的接触。然而，实际上并不能期望情况如此，因为有三个重要条件与多聚TCR对抗原呈递细胞的识别相比有利于多聚MHC-肽对T细胞的识别i)多聚MHC-肽复合物能够形成与T细胞表面上的TCR和CD4或CD8共同受体的接触。多聚TCR单独依赖于TCR/MHC-肽接触。
ii)T细胞表面上的TCR的浓度显著高于抗原呈递细胞表面上的MHC-肽的浓度(Engelhard，1994)。
iii)抗原呈递细胞在它们的表面上呈递大批不同的MHC-肽复合物(Engelhard，1994)，而T细胞正常情况下将只表达一个α/β或γ/δ组合。9.蛋白质与脂质体的连接脂质体是由封入水容量的脂质分子双层组成的脂小泡。脂质双层由膜脂，通常但并排他地由磷脂形成。磷脂分子具有两亲特性，因此它们或者以结晶态或者在极性溶剂中聚集成具有典型感胶离子液晶状对称的有序结构。在水溶液中，磷脂分子正常情况下形成自我封闭的球形或椭圆形结构，其中一个或几个磷脂双层在它们的内部截留一部分溶剂。
使残留在脂质体中的生物活性化合物免受外部环境的影响并逐渐扩散出来以产生持续作用。
脂质体将药物递送到其表面上的蛋白质所作用的特定位置具有巨大的治疗潜力(Allen，1997；Langer，1998)。特别是，药物在特定位置的缓慢释放可增强药效，同时使给药的总量降低。脂质体在这些方面的应用正在迅速发展并且大量资料不断涌现，例如有关它们在血流中的循环能力(Uster等人，1996)和它们的残存时间(Zalipshy等人，1996)。特别有用的特征可能是脂质体携带的药物可以口服(Chen和Langer，1997；Chen等人，1996；Okada等人，1995)。
许多报道描述了抗体与脂质体的连接(A hmad和Allen，1992；Ahnad等人，1993；Hansen等人，1995)。US5,620,689公开了所谓的“免疫脂质体”，其中有效结合B淋巴细胞或T淋巴细胞上所选抗原的抗体或抗体片段与具有聚乙二醇链表面涂层的脂质体中的膜脂远端连接。然而抗体-抗原相互作用通常亲和力相当高，为此对于多价导向可能是不稳定的。
本发明的目的是提供一种用于靶向特异性MHC-肽复合物的方法。
本发明的特别目的是提供能够检测特异性MHC-肽复合物、不过尤其不仅是在体内呈递的MHC-肽复合物的形式的TCR。
本发明的另外的目的是提供一种能够在体内将试剂、特别是治疗剂传送至表达特异性MHC-肽复合物的部位的靶向的传送载体。
本发明者目前已经出人意料地发现可以将TCR极为有效地用于体内的靶向目的并且已经成功地设计出一种用于使用靶向目的的TCR分子的策略。
在一个方面中，本发明提供了一种用于结合MHC-肽复合物的合成多价T细胞受体(TCR)复合物，该TCR复合物含有多个对MHC-肽复合物具有特异性的T细胞受体。
本发明主要涉及存在于95％T细胞上的αβTCRs。
在另一个方面中，本发明提供了一种多价TCR复合物，它含有具有比非多聚T细胞异二聚体增强的结合能力的多聚化重组T细胞受体异二聚体或由该多聚化重组T细胞受体异二聚体组成。该多聚T细胞受体可以含有两种或多种TCR异二聚体。
在另一个方面中，本发明提供了一种用于检测MHC-肽复合物的方法，该方法包括下列步骤(i)提供(a)一种含有多个T细胞受体的合成的多价T细胞受体复合物和/或(b)一种含有具有比非多聚T细胞异二聚体增强的结合能力的多聚化重组T细胞受体异二聚体的多价T细胞受体复合物，所述的T细胞受体对MHC-肽复合物具有特异性；(ii)使所述的多价TCR复合物与MHC-肽复合物接触；并且(iii)检测所述的多价TCR复合物与MHC-肽复合物的结合情况。
在另一个方面中，本发明提供了一种用于将治疗剂传送至靶细胞的方法，该方法包括下列步骤(i)提供(a)一种含有多个T细胞受体的合成的多价TCR复合物和/或(b)一种含有具有比非多聚T细胞异二聚体增强的结合能力的多聚化重组T细胞受体异二聚体的多价TCR复合物，所述的T细胞受体对MHC-肽复合物具有特异性且所述的多价TCR复合物中含有与之连接的治疗剂；(ii)在使所述的T细胞受体与靶细胞结合的条件下使所述的多价TCR复合物与可能的靶细胞接触。
本发明的多价TCR复合物(或多聚结合部分)自身具有用于追踪或靶向体外或体内传递特殊抗原的细胞的能力且还用作生产另外的具有这类用途的多价TCR复合物的中间体。由此可以以体内应用的药物上可接受的制剂的形式提供多价TCR复合物。
在本发明的上下文中，如果不能够在活生物体内发现多价TCR复合物或它对于活生物体来说不是天然存在的，例如如果它是非代谢性的和/或没有胞核，那么该多价TCR复合物是“合成的”。因此，例如，如果所述的TCRs是多聚体形式或它们存在于脂双层、例如脂质体中，那么它是优选的。另外可能的是通过分离T细胞并除去胞内成分即例如使所述的复合物没有胞核可以形成所述的TCR复合物。所得的“空胞”T细胞单纯具有包括T细胞受体在内的T细胞膜。通过用洗涤剂裂解T细胞、从膜中分离胞内成分(例如通过离心)且然后除去洗涤剂并重建所述的膜可以形成这类空胞T细胞。
本发明的多价TCR复合物在其最简单的形式中含有优选通过接头分子彼此连接(例如以共价键方式或其它的方式连接)的两个或三个或四个或多个T细胞受体分子的多聚体。合适的接头分子包括多价结合分子诸如抗生物素蛋白、链霉抗生物素和外抗生物素蛋白，它们各自具有用于生物素的四个结合位点。因此，可以将生物素化的TCR分子制成具有多个TCR结合位点的T细胞受体的多聚体。多聚体形式的TCR分子的数量将取决于与用于生产所述多聚体的接头分子的量相关的TCR的量并且还取决于存在或不存在的任意其它生物素化分子。优选的多聚体是三聚或四聚TCR复合物。
用于追踪或靶向表达特异性MHC-肽复合物的细胞的多价TCR复合物优选是远大于TCR三聚体或四聚体的结构。优选该结构的直径在10nm-10μm的范围。各结构可以显示出以足够间距存在的多个TCR分子，所述的间距能够使两个或多个所述结构上的TCR分子同时结合细胞上的两个或多个MHC-肽复合物且由此增加多聚结合部分对细胞的亲和力。
用于本发明的合适的结构包括诸如脂质体这样的膜结构和优选是诸如珠例如乳胶珠这样的颗粒的固体结构。其它可以用T细胞受体分子外包被的结构也是合适的。优选的情况是，所述的结构由多聚T细胞受体复合物而不是由各个T细胞受体细胞分子包被。
就脂质体而言，T细胞分子可以附着在膜的外部或它们被包埋在膜内。就后者而言，可以使用包括部分或全部跨膜结构域在内的T细胞受体分子。就前者而言，优选可溶性T细胞受体分子。可溶形式的T细胞受体通常来源于缺失了跨膜结构域的天然形式。该蛋白质可以通过除去胞质和跨膜结构域来截短；或可以仅缺失跨膜结构域而保持部分或全部的胞质结构域。可以修饰该蛋白质以便通过蛋白酶剪切或通过表达基因工程截短的或部分缺失的形式来得到所需的形式。
一般来说，可溶性T细胞受体含有全部的四种分子的外结构域即α和β可变结构域以及α和β恒定结构域。然而，所关注的是保持可变结构域的MHC-肽结合特性的任何可溶形式的TCR。例如，可以删除一种或另一种恒定结构域而不会明显破坏结合位点。
如果本发明的多价TCR复合物含有具有比非多聚T细胞受体异二聚体增强的结合能力的多聚化重组T细胞受体异二聚体，那么它是优选的。重折叠的重组T细胞受体可以含有i)具有第一种异源C-末端二聚化肽的重组T细胞受体α或γ链的胞外域；和ii)具有特异性地与第一种二聚化肽异二聚化以形成异二聚化结构域的第二种C-末端二聚化肽的组T细胞受体β或δ链的胞外域。
这种重组TCR可以用于识别I型MHC-肽复合物和II型MHC-肽复合物。
优选将重组TCR的异二聚化结构域称作“卷曲螺旋”或“亮氨酸拉链”。将这些术语用于描述彼此以一种特殊方式发生相互作用而形成异二聚体的成对的螺旋肽类。所述的相互作用因沿各拉链肽一侧存在互补性疏水残基而发生。所述肽类的性质使得异二聚体的形成比螺旋同二聚体的形成更便利。亮氨酸拉链可以是合成的或天然出现的。可以将合成的亮氨酸设计成具有更高于天然出现的亮氨酸拉链的结合亲和性。实际上，用于本发明的优选亮氨酸拉链是天然出现的亮氨酸拉链或具有类似结合亲和性的亮氨酸拉链。来自c-jun和c-fos蛋白质的亮氨酸拉链是具有合适的结合亲和性的亮氨酸拉链的一个实例。其它合适的亮氨酸拉链包括那些来自myc和max蛋白质的亮氨酸拉链(Amati，Dalton等1992)。可以方便地设计其它具有合适特性的亮氨酸拉链(O’Shea等1993)。
优选的情况是，本发明的多聚体结合部分中的可溶性TCRs带有相当于来自c-jun(α链)和c-fos(β链)的异二聚化结构域的约40个氨基酸的亮氨酸拉链融合物(O’Shea，Rutkowski等，1989；O’Shea，Rutkowski等，1992；Glover和Harrison，1995)。可以使用较长的亮氨酸拉链。由于异二聚化特异性看起来甚至被保持在某些亮氨酸拉链结构域的十分短小的片段中(O’Shea，Rutkowski等，1992)，所以可能的情况是可以用较短的c-jun和c-fos片段来获得类似的益处。例如这类较短的片段可以带有少至8个氨基酸。因此，所述的亮氨酸拉链结构域可以在8-60个氨基酸长的范围内。
亮氨酸拉链配对中的特异性的分子机理已被充分鉴定(Landschulz，Johnson等，1988；McKnight，1991)且本领域技术人员可以设计并构建亮氨酸拉链以形成同二聚体、异二聚体或三聚体复合物(Lumb和Kim，1995；Nautiyal，Woolfson等，1995；Boice，Dieckmann等，1996；Chao，Houston等，1996)。所设计的高于c-jun和c-fos亮氨酸拉链亲和性的亮氨酸拉链(或其它异二聚化结构域)可以对表达某些系统中的可溶性TCRs有利。然而，正如下面具体描述的，当可溶性TCR在体外折叠时，优选将增溶剂导入折叠缓冲液以便减少副产物蛋白质聚集体的形成。对这种现象的一种解释是所述亮氨酸拉链结构域的折叠运动快于TCR链，导致未折叠TCRα和β链的二聚化，从而产生蛋白质聚集现象。通过减慢折叠过程并通过掺入增溶剂来抑制聚集现象，可以将蛋白质维持在溶液中直到两种融合结构域折叠完全为止。因此，亲和性高于c-jun和c-fos亮氨酸拉链的异二聚化结构域可能需要更高浓度的增溶剂以便实现可与c-jun和c-fos的产率相比拟的可溶性TCRs产率。
不同生物系统使用不同的方法来形成稳定的同型和异型蛋白质二聚体，且这些方法中的每一种一般可对将二聚化结构域改造成遗传修饰的蛋白质提供一种选择。亮氨酸拉链(Kouzarides和Ziff 1989)可能是最普通的二聚化组件并已经广泛用于生产遗传设计的二聚化蛋白质。因此，已经将GCN4的亮氨酸拉链(一种来自啤酒糖酵母的转录激活物蛋白)用于引导大量异源蛋白质的同二聚化(Hu，Newell等，1993；Greenfield，Montelione等1998)。优选的策略是使用引导异二聚化复合物诸如Jun/Fos两氨酸拉链对形成的拉链(de Kruif和Logtenberg 1996；Riley，Ralston等1996)。
异二聚化结构域不限于亮氨酸拉链。因此，用形成二硫桥的成分可以使之产生。另一方面，它可以由SH3结构域和疏水/富含脯氨酸的反结构域来产生，其中所述的SH3结构域和疏水/富含脯氨酸的反结构域可导致在涉及信号转导的蛋白质中所观察到的蛋白质-蛋白质相互作用(由Schlessinger综述，(Schlessinger 1994))。在参与信号转导级联的蛋白质中发现的其它天然蛋白质-蛋白质相互作用依赖于翻译后修饰的氨基酸与特异性识别这类修饰残基的蛋白质组件之间的相关性。这类翻译后修饰的氨基酸和蛋白质组件可以形成异二聚化结构域。这类蛋白质对的一个实例由诸如表皮生长因子受体或血小板衍生生长因子受体这样的酪氨酸磷酸化受体和GRB2的SH2结构域来提供(Lowenstein，Daly等1992；Buday和Downward1993)。正如在所有的科学领域中一样，正在积极地探求新型二聚化组件(Chevray和Nathans1992)且目前已经成功地开发出了用于设计完全人工化组件的方法(Zhang，Murphy等1999)。
在一个优选的重组TCR中，在天然α和βTCR链中的两个半胱氨酸残基之间以及天然γ和δTCR链之间形成的链间二硫键不存在。这可以例如通过使二聚化结构域与所述半胱氨酸残基上的TCR受体链融合而使在所述的重组蛋白质中不包括这些残基来实现。在另一个实例中，一个或多个半胱氨酸残基被另一种不涉及二硫键形成的氨基酸残基所取代。不可以引入这些半胱氨酸残基，这是因为它们不利于在体外折叠功能性TCR。
本发明的多价TCR复合物的优选的重折叠的重组TCR的α和β链或γ和δ链的重折叠在合适的重折叠条件下在体外进行。在一个特定的实施方案中，通过在含有增溶剂例如尿素的重折叠缓冲液中使增溶的TCR链重折叠而获得具有正确构象的重组TCR。有利的是，所述的尿素可以以至少0.1M或至少1M或至少2.5M或约5M的浓度存在。另一种可以使用的增溶剂是胍，其浓度为0.1M-8M，优选至少1M或至少2.5M。在重折叠前，优选使用还原剂来确保完全还原半胱氨酸残基。此外，如果必要，可以使用诸如DTT和胍这样的变性剂。在重折叠步骤前可以使用不同的变性剂和还原剂(例如脲、β-巯基乙醇)。在重折叠过程中可以使用另一种氧化还原对，诸如胱胺/半胱胺氧化还原对、DTT或β-巯基乙醇/空气氧以及还原和氧化形式的半胱氨酸。
为了使多价TCR复合物的检测成为可能，例如为了诊断目的可以用可检测的标记物。可以从各种已知的可检测的标记物中选择适宜的标记物。适宜标记物的类型包括荧光、光活化性、酶性、表位、磁性和颗粒(例如金)标记物。特别适合于体外应用的是荧光标记物FITC。特别适合于体内应用的是适合于在对哺乳动物给药后外部显象的标记物，如发出的辐射能穿透软组织的放射性核素。可将标记物附着于或掺入到多价TCR复合物的任何适宜的位点中。对于脂质体来说，可将其附着于或掺入到膜中，或包埋在膜的内部。对于颗粒或小珠来说，标记物可位于颗粒或小珠本身中，或附着于外部，例如在T细胞受体分子中。方便地，将标记物附着于多价连接分子上，由此形成T细胞受体复合物。在使用生物素化的异二聚体形成的四聚化TCR中，可以将荧光链霉抗生物素(商购)用于产生一种可检测的标记物。荧光标记的四聚体适用于FACS分析，例如用于检测携带TCR对其具有特异性的肽的抗原呈递细胞。
另一种方式通过使用TCR-特异性抗体、特别是单克隆抗体来进行，其中可以检测所述的多价TCR复合物。有许多商购的可分别识别β和α链的恒定区的抗-TCR抗体，诸如βF1和αF1。
对于治疗应用，将治疗剂附着于或掺入到本发明的多价TCR复合物中。在优选的实施方案中，适于治疗用途的多价TCR复合物是包被有T细胞受体的脂质体，治疗剂包埋在脂质体内。T细胞受体的特异性使脂质体所含药物定位于所需的靶位点如肿瘤或病毒感染的细胞成为可能。这在许多情况中且特别是对肿瘤是有用的，因为在肿瘤中不是所有细胞均可呈递抗原且由此不是所有的肿瘤细胞都可以被免疫系统检测到。使用多价TCR复合物可以转运一种化合物，使得它可以在局部发挥其作用、而不仅是在与之结合的细胞上发挥作用。因此，一种特殊的策略是关注与包含对肿瘤抗原具有特异性的T细胞受体的多价TCR复合物相关的或连接的抗肿瘤分子。
治疗剂例如可以是如在细胞杀伤中使用的毒性部分，或免疫刺激剂如白细胞介素或细胞因子。为了这一用途可以使用许多毒素，例如放射性化合物、酶类(例如穿孔素)或化疗剂(例如顺式铂氨)。
本发明的多价TCR复合物的一个实例是一种含有三个TCR分子和一个过氧化物酶分子的四聚体。它可以通过以3∶1的摩尔比混合TCR与所述酶而生成四聚化复合物并从不含正确比例分子的任意复合物中分离所需的多聚体来获得。混合的分子可以含有任意组合的分子，条件是位阻不损害或不明显损害所述分子的所需功能。结合位点在链霉抗生物素分子上的定位适合于混合的四聚体，因为不可能出现位阻。
优选的情况是，重组TCR链带有位于TCR结构域与二聚化肽之间的弹性接头。合适的弹性接头包括含有甘氨酸的标准肽接头，例如含有甘氨酸和丝氨酸的接头。认为在邻接可形成链间二硫键的半胱氨酸残基处的C-末端截短是有利的，因为α和β链经这些细胞TCRs中的残基而非常邻近。因此，仅要求相对较短的接头序列产生从TCR链到异二聚化结构域的非变形性过渡。优选使用Pro-Gly-Gly或Gly-Gly的接头序列。然而，所述的接头序列可以改变。例如，可以完全删除所述的接头或将其还原成单个残基，在这种情况中更好的选择是单一甘氨酸残基。较长的接头的变化形式也能够在所述可溶性TCR中被接受，条件是可以防止它们受到蛋白酶的攻击，所述的蛋白酶攻击可使二聚化肽类与具有随后缺失的α-β链稳定性的TCR的胞外域分离开来。
可溶性TCR不一定是α-βTCR。诸如γ-δ、α-δ和γ-βTCR分子这样的分子以及含有仅在发育早期表达的不变α链的TCR分子(前TCR)也包括在内。前-TCR特指表达α-βT细胞受体的细胞系，与表达γ-δT细胞受体的那些细胞相反(参见综述(Aifantis，Azogui等1998；von Boehmer，Aifantis等1998；Wurch，Biro等1998))。通过使用不变前-TCRα链的TCRβ链配对来表达前-TCR(Saint Ruf，Ungewiss等1994；Wilson和MacDonald 1995)，看起来所述的不变前-TCRα链使所述细胞定向于α-βT细胞系。因此认为前-TCR的作用在胸腺发育过程中是重要的(Ramiro，Trigueros等1996)。
如果合适，可以对重组TCR进行标准化修饰。它们包括例如对β链恒定区中的未配对的半胱氨酸残基进行改变以便避免不正确的链内或链间配对。
由于所述的信号肽无法在成熟受体内用于任何目的或因其配体结合能力，所以它可以被忽略，且实际上所述的信号肽可防止TCR能够识别配体。在大多数情况中，将在切割位点处从成熟TCR链中除去的信号肽进行推定而不进行实验测定。将所表达的TCR链改造成它们在n-末端处有几个(即例如达到约10个)氨基酸长或短这一过程对于所述可溶性TCR的功能性来说没有意义。可以添加不存在于原始蛋白质序列中的某些添加物。例如，可以添加有助于纯化所述TCR链的短标记物序列，条件是它不干扰正确的结构和所述TCR的抗原结合位点的折叠。
为了在大肠杆菌中进行表达，可以在所推定的成熟蛋白质序列的N-末端起点上改造甲硫氨酸残基以便能够引发翻译。
远离TCR链可变结构域中的所有残基对于抗原特异性和功能性来说是必不可少的。因此，可以在该区中引入大量突变而不会影响抗原特异性和功能性。
相反，可以将涉及形成与所述肽抗原或HLA重链多肽的连接物的某些残基(即构成TCR链的CDR区的残基)取代成可提高TCR对配体亲和性的残基。可以将这类使大多数TCRs对肽-MHC配体产生低亲和性的取代用于提高可溶性TCRs的特异性和功能性潜能。在本文的实施例中，测定了可溶性TCRs对肽-MHC配体的亲和性。可以将这类测定方法用于检测引入所述TCR中的突变作用并由此用于鉴定含有提高所述TCR活性的取代的TCRs。
远离TCR链恒定区中的所有残基对于抗原特异性和功能性来说是必不可少的。因此，可以在影响抗原特异性的该区中引入大量突变。在下面的实施例14中，我们已经证实在TCRβ链恒定区中的两个氨基酸取代不具有可检测到的TCR结合HLA-肽配体的能力的结果。
所述的TCRβ链含有在细胞或天然TCR中未配对的半胱氨酸残基。这种残基的突变提高了体外可溶性TCR重折叠的功效。将这种半胱氨酸残基取代成丝氨酸或丙氨酸这一过程对体外重折叠的功效具有显著的正面作用。使用取代成其它氨基酸的方法可以获得类似的正面作用乃至更好的效果。
如上所述，优选在天然TCR中形成链间二硫键的半胱氨酸残基不存在以便避免重折叠的困难。然而，由于这些半胱氨酸残基的排列是所述TCR中天然设计的且也已经证实具有这种排列对c-jun和c-fos亮氨酸拉链结构域起作用(O’Shea等，1989)，所以可以含有这些半胱氨酸残基，条件是所述的TCR可以被重折叠。
因为所述的恒定区不直接包含在与肽-MHC配体的连接物中，所以可以改变C-末端截断点而基本上不会丧失功能性。例如，应能够生产不包括完整恒定区的功能性可溶性TCRs。一般来说，它更易于表达并折叠仅含有可变区或可变区以及所述恒定区中唯一短片段的可溶性TCRs，这是因为所述的多肽类是较短的。然而，这种策略不是优选的。这是因为通过异二聚化结构域对α-β链配对增加稳定性的条件是复杂的，因为改造的两种链C-末端具有一定的距离，从而要求较长的接头序列。在形成链间二硫键的半胱氨酸位置前融合异二聚化结构域的优点在于保持α和β链在细胞受体内邻近。因此，在该点处的融合几乎不可能使所述的TCR结构变形。
可以生产具有较大的而非本文优选的恒定区片段的功能性可溶性TCR，即不要求它们的恒定区在形成链间二硫键的半胱氨酸前被截短。例如，可以包含除跨膜结构域外的完整的恒定区。在这种情况中有利的是使在细胞TCR中形成链间二硫键的半胱氨酸发生突变。
除通过异二聚化结构域辅助链间稳定性外，还可以使用引入的可形成链间二硫键的半胱氨酸残基。一种可能性是截短邻近形成链间二硫键的半胱氨酸残基的α和β链而不除去它们，从而进行正常的链间二硫键。另一种可能性是仅删除α和β链的跨膜结构域。如果表达α和β链的较短片段，那么可以以在氨基酸位置上进行取代的方式来改造半胱氨酸残基，其中两种链的折叠使所述的残基彼此邻近以适合于二硫键形成。
通过许多不同的方式可以进行TCR的纯化。可以使用另一种离子交换方式或可以使用其它蛋白质纯化方式诸如凝胶过滤层析法或亲和层析法。
在生产重组TCR的方法中，通过将某些蛋白质成分、例如侣伴蛋白质加入到重折叠混合物中也可以提高折叠功效。通过使蛋白质经过带有增溶的最小侣伴蛋白质的柱已经实现了对重折叠的改进(Altamirano，Golbik等1997；Altamirano，Garcia等1999)。
除实施例中所述的方法外，另一种使所述的TCR生物素标记的方式也是可行的。例如，可以使用化学生物素标记法。尽管在生物素标记物序列中的某些氨基酸是必需的，但是可以使用另一种生物素标记物(Schatz等，1993)。也可以改变用于生物素标记的混合物。酶需要Mg-ATP和低离子强度，不过可以改变这两个条件，例如能够使用较高的离子强度和较长的反应时间。能够使用非抗生物素蛋白或链霉抗生物素的分子以便形成TCR的多聚体。任何以多价方式结合生物素的分子都是合适的。另一方面，可以设计一种完全不同的键(诸如用于螯合镍离子的聚-组氨酸标记物)(Quiagen Product Guide 1999，第三章“蛋白质表达、纯化、缺失和检测”第35-37页)。优选的情况是，使所述的标记物定向于所述蛋白质的C-末端以便将与潜在肽-MHC复合物发生相互作用中的位阻的量降到最低限度。
为了使多价TCR复合物的检测成为可能，例如为了诊断目的可以用可检测的标记物。可以从各种已知的可检测的标记物中选择适宜的标记物。适宜标记物的类型包括荧火、光活化性、酶性、表位、磁性和颗粒(例如金)标记物。特别适合于体外应用的是荧光标记物FITC。特别适合于体内应用的是适合于在对哺乳动物给药后外部显象的标记物，如发出的辐射能穿透软组织的放射性核素。可将标记物附着于或掺入到多价TCR复合物的任何适宜的位点中。对于脂质体来说，可将其附着于或掺入到膜中，或包埋在膜的内部。对于颗粒或小珠来说，标记物可位于颗粒或小珠本身中，或附着于外部，例如在T细胞受体分子中。方便地，将标记物附着于多价连接分子上，由此形成T细胞受体复合物。在使用生物素化的异二聚体形成的四聚化TCR中，可以将荧光链霉抗生物素(商购)用于产生一种可检测的标记物。荧光标记的四聚体适用于FACS分析，例如用于检测携带TCR对其具有特异性的肽的抗原呈递细胞。
另一种方式通过使用TCR-特异性抗体、特别是单克隆抗体来进行，其中可以检测所述的多价TCR复合物。有许多商购的可分别识别β和α链的恒定区的抗-TCR抗体，诸如βF1和αF1。
对于治疗应用，将治疗剂附着于或掺入到本发明的多价TCR复合物中。在优选的实施方案中，适于治疗用途的多价TCR复合物是包被有T细胞受体的脂质体，治疗剂包埋在脂质体内。T细胞受体的特异性使脂质体所含药物定位于所需的靶位点如肿瘤或病毒感染的细胞成为可能。这在许多情况中且特别是对肿瘤是有用的，因为在肿瘤中不是所有细胞均可呈递抗原且由此不是所有的肿瘤细胞都可以被免疫系统检测到。使用多价TCR复合物可以转运一种化合物，使得它可以在局部发挥其作用、而不仅是在与之结合的细胞上发挥作用。因此，一种特殊的策略是关注与包含对肿瘤抗原具有特异性的T细胞受体的多价TCR复合物相关的或连接的抗肿瘤分子。
治疗剂例如可以是如在细胞杀伤中使用的毒性部分，或免疫刺激剂如白细胞介素或细胞因子。为了这一用途可以使用许多毒素，例如放射性化合物、酶类(例如穿孔素)或化疗剂(例如顺式铂氨)。本发明的多价TCR复合物的一个实例是一种含有三个TCR分子和一个过氧化物酶分子的四聚体。它可以通过以3∶1的摩尔比混合TCR与所述酶而生成四聚化复合物并从不含正确比例分子的任意复合物中分离所需的多聚体来获得。混合的分子可以含有任意组合的分子，条件是位阻不损害或不明显损害所述分子的所需功能。结合位点在链霉抗生物素分子上的定位适合于混合的四聚体，因为不可能出现位阻。
虽然本发明的目的是提供具有特异性相同的多个T细胞受体的多价TCR复合物但是也不排除具有不同特异性的T细胞受体。的确，具有两种或多种不同特异性的T细胞受体可能有利，如有可能同时导向两种或多种不同的MHC-肽复合物。那样可用于例如确保在具有不同HLA类型的不同个体中检测靶抗原，因为相同的外来抗原可经过不同的加工并按照HLA类型被呈递。
同样，也设想包括其结合活性不同于T细胞受体的分子。这样的分子可提高导向能力，或一旦多价TCR复合物到达其靶便执行有用的功能。有用的辅助分子包括支持T细胞受体对MHC-肽复合物的识别的CD8，和具有免疫调制作用的受体。
用于本发明的多价TCR复合物的合适MHC-肽靶物的实例包括但不限于病毒表位诸如HTLV-1表位(例如由HLA-A2结合的Tax肽；HTLV-1与白血病有关)；HIV表位；EBV表位；CMV表位；黑素瘤表位和其它癌症特异性表位；以及与自身免疫疾病例如类风湿关节炎相关的表位。
更具体地说，本发明T细胞受体包被的脂质体(也可以描述为“人工T细胞”)可以如下构建。“人工T细胞”的生产存在许多用于生产脂质体的方法。在最简单的方法中，在缓慢或剧烈振摇条件下使干燥的磷脂薄膜沉积在装有过量溶剂的圆底烧瓶中(Bangham等，1965)。其它方法包括多层脂质体(MLVs)的超声处理法、使用通过French Press促成MLVs悬浮的方法(Barenholzt等，1979)或通过脂类的洗涤剂增溶法。可以通过透析法、层析法、吸附法、超滤法或离心法来除去洗涤剂(Brunner等，1976)。
已经描述了通常通过修饰的脂类将蛋白质与脂质体表面连接的许多技术。一种这样的方法使用生物素化脂类。本文描述了一种用于生产可以通过例如抗生物素蛋白、链霉抗生物素或外抗生物素蛋白(extravidin)与生物素化脂类连接的生物素化T细胞受体的方法。另一种偶合方法使用聚乙二醇(PEG)来使得抗体与脂质体结合(Hansen等，1995)且还描述了S-琥珀酰亚胺基-S-硫代乙酸酯(SATA)的应用(Konigsberg等，1998)。
这些技术生产了具有20-100nm范围大小的小单层脂质体。由于稳定性的问题和为了包载宽范围的物质，已经开发了用于大单层脂质体的制备方法。这些方法包括使脂质体即通过反相蒸发法(Szoka和Papahadjopoulos，1978)制得的囊泡脱水-在水化法(Tan和Gregoriadis，1990)或用冷融的挤出法(Mayer等，1985)。使用这些方法产生的包裹功效可以达到65-80％。
当最初发现时，脂质体是不稳定的，但是近年来已经通过使用更复杂形式的脂类和衍生的脂类而克服了这类难题(参见(Allen，1994)的综述)。可以将包裹药物例如阿霉素(Ahmad和Allen，1992；Ahmad等，1993)、蛋白质/抗原(Cohen等，1994；Cohen等，1991)或胰岛素(Edelman等，1996)看作是公开的技术。脂质体连接的TCR多聚体的优点可以将这种技术的一般优点概括为如下几点-脂质体价廉、易于生产、易于使用标准技术充填和易于充填大量治疗用化合物。包括生物素化脂类在内的用于生产脂质体的试剂是方便得到的，例如商购自Avanti Polar Lipids Inc.，USA。
-脂质体和蛋白质是可生物降解的。
-TCR和脂类是非免疫原性的，因此不能诱发再次免疫反应。“人工T细胞”的优点在其追踪抗原呈递细胞的能力及其用于这一目的的用途以及用于将化合物传送至这类细胞方面，预计脂质体连接的TCR和脂质体连接的TCR多聚体具有超过TCR四聚体的许多优点。可以将这些优点概括为如下几点-脂质体连接的TCR的自由侧运动防止了可阻碍TCR/MHC-肽接触的任何位阻。实际上，在脂质体中与脂类连接的TCRs的侧面流动性使人联想到它在T细胞膜上运动的能力。
-脂质体表面的柔韧性使人联想到实际细胞膜的柔韧性，从而可能获得比用四聚体或其它简单复合物更好的接触表面。
-可以将大量的TCRs与脂质体连接，由此可以确保高亲和性结合能力。由于使用了TCR四聚体，结合将取决于使用最大量的4种TCR/MHC-肽连接物获得的足够的亲和力。
-对于体内和体外应用来说，脂质体连接的TCR几乎不可能通过TCR的降解而失去功能性，这是因为可以与脂质体连接的TCRs的数量远高于使用四聚体或其它简单TCR复合物的情况。
-通过以不同的比例混合生物素化与非生物素化脂类可以控制TCR在脂类上的浓度。类似地，可以按照不同的比例混合使脂类用于结合蛋白质的其它修饰方法得到的脂类例如PEG-衍生的(Allen等，1995；Hansen等，1995)或SATA-衍生的(Konigsberg等，1998)脂类。这产生了用于具有不同亲和性的TCRs的抗原呈递细胞的相互作用的强度或对抗原呈递细胞上肽表位的控制。
-用于使高数量分子与脂质体连接的潜能揭示了通过使用一种以上TCR生成具有多价MHC-肽特异性的脂质体的可能性。例如，可以预计在脂质体上连接对与相同疾病有关的不同表位具有特异性的两种或多种TCRs，从而得到这种具有可检测疾病影响的细胞的多种特异性。
-类似地，可以将TCR与在抗原呈递细胞附近发挥其它所需功能的其它分子或蛋白质进行混合。例如，细胞因子或细胞因子受体、特异性抗体、超抗原、共同受体样CD2、CD4、CD8或CD28或肽类可以具有本发明上下文中有用的特性。这种应用可以具有极宽范围的使试剂在某些抗原呈递细胞附近定位的潜能。可以用多价TCR复合物靶向的药物和疾病的实施例可以用多价TCR复合物靶向的的药物和疾病的实例通过因多价TCR复合物的特异性而将药物限制在一定区域能潜在地促进众多疾病的治疗，特别是使用与脂质体相联的TCR将是有用的。
药物对病毒性疾病例如HIV、SIV、CMV的治疗得益于所述药物在受感染细胞附近释放。对于癌症来说，在肿瘤或转移附近的定位会提高毒素或免疫刺激剂的作用。在自身免疫疾病中，免疫抑制剂药物可以缓慢释放，从而在较长的时间间隔内具有更多的局部作用，同时将对总体免疫能力的影响降到最低限度。在预防移植排斥过程中，可以按照同样的方式使免疫抑制剂药物的作用达到最佳效果。为了进行疫苗的转运，可以将疫苗抗原限制在消化性抗原呈递细胞附近，由此提高所述抗原的功效。可以将该方法用于成像目的。
本发明各方面中的优选特征在于可以对各其它方面做必要的修改。将本文所述的现有技术文献以法律所允许的最完整程度引入。
在下面的实施例中进一步描述本发明，这些实施例不以任何方式来限定本发明的范围。
参照下列附图进行描述，其中

图1是T-细胞受体-亮氨酸拉链融合蛋白的示意图。各链由两个免疫球蛋白超家族结构域、一个可变(V)区和一个恒定(C)区组成。所述的恒定区刚好在链间半胱氨酸残基的n-末端被截短并与通过短接头与来自C-末端约40个氨基酸的c-Jun(α)或c-Fos(β)的亮氨酸拉链异二聚化基序融合。所述的c-Jun(α)或c-Fos(β)各自含有两个链间二硫键并仅通过非共价连接物配对。α链因是一个较小的恒定区而比β链短。
图2是异二聚化JM22zip受体的还原/非还原凝胶分析的照片。将纯化TCR-拉链的相同样品在还原条件(泳道2)和非还原条件(泳道4)下上15％丙烯酰胺SDS凝胶。标记蛋白如泳道1和3中所示。分子量用千道尔顿表示。在两组条件下，非共价结合的异二聚体被分离成α和β链。在泳道4中，各链以较高的迁移率移动并成为单一带，这表明存在单一种类的链间二硫键。这与正确的二硫键形成相一致。
图3是表示JM22zip TCR与HLA-A2 Flu基质(M58-66)复合物特异性结合的示意图。围绕单一肽类重折叠并在β2-微球蛋白上生物素标记的HLA-A2复合物已经被固定在三种链霉抗生物素包被的流式细胞(FC)3上流式细胞(FC)3上的HLA-A2 POL对照的3770共振单位(RU)；和两种不同浓度的HLA-A2 M58-66 FLU(FC1上为2970RU且FC2上为4960RU)。已经在所有三种流式细胞上将JM22zip以43μM的浓度连续注入流动相，持续60秒。在注射过程中，观察到在HLA-A2FLU-包被的流式细胞的反应中上述背景值增加，JM22zip分别与流式细胞1和2特异性结合的共振单位约为1000RU和700RU。
图4表示作为与c-jun的“亮氨酸拉链”结构域融合的来自JM22的结合在可溶性HLA-A2/flu基质上的TCRα链的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示引入所述DNA序列5’末端以便在大肠杆菌中促进基因表达的突变，正如是TCR与c-jun序列之间的接头序列。
图5表示作为与c-fos的“亮氨酸拉链”结构域融合的来自JM22的结合在可溶性HLA-A2/flu基质上的TCRβ链的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示TCR与c-fos序列之间的接头序列。用粗体和下划线来表示用丝氨酸残基替换半胱氨酸残基的DNA序列的突变。这种突变可增加TCR的重折叠效率。
图6表示作为与c-fos的“亮氨酸拉链”结构域和起BirA底物作用的生物素标记融合的来自JM22的结合在可溶性HLA-A2/flu基质上的TCRβ链的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示TCR与c-fos序列之间以及c-fos与生物素标记之间的接头序列。用粗体和下划线来表示用丝氨酸残基取代半胱氨酸残基的DNA序列的突变。这种突变可增加TCR的重折叠效率。
图7是TCR-拉链-生物素标记融合蛋白的示意图。
图8表示用梯度氯化钠从PORO 10HQ柱上洗脱重折叠的TCR的结果。在约100mM NaCl处TCR洗脱液为单峰。收集含OD(280nm)大于0.1的蛋白质的级分并浓缩以便生物素标记。
图9表示通过在Superdex 200HR 10/30柱(Pharmacia)上的凝胶过滤从游离生物素中分离生物素标记的TCR的结果。在约15ml时TCR-生物素洗脱下来，相当于69kDa的分子量。(标准品蛋白质及其洗脱体积甲状腺球蛋白(669kDa)10.14ml；脱铁铁蛋白(134kDa)11.36ml；β-淀粉酶(200kDa)12.72ml；BSA二聚体(134kDa)13.12ml；BSA单体(67kDa)14.93ml；卵清蛋白(43kDa)15.00ml；胰凝乳蛋白酶原A(25kDa)18.09ml；Rnase A(13.7kDa)18.91ml)。
图10表示TCR四聚体在Superclex 200HR 10/30柱上凝胶过滤的结果。在14.61和12.74的峰相应于用于稳定外抗生物素蛋白的BSA(单体和二聚体)。在11.59的峰含有TCR四聚体，如当外抗生物素蛋白-FITC用于四聚化时因存在黄色FITC所判断的。此峰相应于是340k Da的分子量，与外抗生物素蛋白连接的TCR四聚体一致。
图11表示作为与c-jun的“亮氨酸拉链”结构域融合的来自克隆6(Garboczi等1996；Garboczi等1996)的结合在可溶性HTLA-1Tax/HLA-A2上的TCRα链的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示TCR与c-fos序列之间以及c-fos与生物素标记之间的接头序列。用小写字母表示引入所述DNA序列5’末端以便在大肠杆菌中促进基因表达的突变，正如是TCR与c-jun序列之间的接头序列。
图12表示作为与c-fos的“亮氨酸拉链”结构域和起BirA底物作用的生物素标记融合的来自克隆6(Garboczi等1996；Garboczi等1996)的结合在可溶性HTLA-1 Tax/HLA-A2上的TCRα链的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示TCR与c-fos序列之间的接头序列。用粗体和下划线来表示用丙氨酸残基替换半胱氨酸残基的DNA序列的突变。
图13表示作为与c-jun的“亮氨酸拉链”结构域融合的来自克隆M10B7/D3(Ding等，1998)的结合在可溶性HTLA-1 Tax/HLA-A2上的TCRα链的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示TCR与c-jun序列之间的接头序列。
图14表示作为与c-fos的“亮氨酸拉链”结构域和起BirA底物作用的生物素标记融合的来自克隆m10B7/D3(Ding等1998)的结合在可溶性HTLA-1 Tax/HLA-A2上的TCRβ链的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示TCR与c-fos序列之间的接头序列。用粗体和下划线来表示用丙氨酸残基替换半胱氨酸残基的DNA序列的突变。为克隆目的和除去Xmal限制位点而引入的两种沉默突变(P-G密码子)也用小写字母表示。
图15表示用于“锚着式扩增TCR基因”的合成DNA引物的序列。给用于克隆的DNA限制酶类的识别位点下划线。A聚-C“锚定引物”。BTCRα链恒定区特异性引物。CTCRβ链恒定区特异性引物。
图16表示用于可编码c-jun和c-fos 40个氨基酸卷曲螺旋(“亮氨酸拉链”)区的DNA片段的PCR扩增的合成DNA引物序列。给用于克隆的DNA限制酶类的识别位点下划线。Ac-jun 5’引物”。Bc-jun 3’引物。Cc-fos 5’引物。Dc-fos 3’引物。
图17表示作为与TCRs融合的c-fos和c-jun片段的相应DNA和氨基酸(一个字母编码)序列(pBJ107和pBJ108中的插入片段)。A与TCRα链融合的c-jun亮氨酸拉链。B与TCRβ链融合的c-fos亮氨酸拉链。
图18表示用于使TCRβ链中未配对的半胱氨酸残基发生突变的合成DNA引物的序列。设计所述的引物以便在用于诱变的“QuickchangTM”法中使用(Stratagene)。A半胱氨酸突变成丝氨酸，正向(有义)引物，表明氨基酸序列和突变。B半胱氨酸突变成丝氨酸，反向(无义)引物。C半胱氨酸突变成丙氨酸，正向(有义)引物，表明氨基酸序列和突变。D半胱氨酸突变成丙氨酸，反向(无义)引物。
图19是TCR-拉链融合蛋白的代表性示意图。将4个免疫球蛋白结构域表示为圆顶状，它们带有所示的半胱氨酸残基配对之间的链间二硫键。数字表示成熟T-细胞受体中的氨基酸位置；由于在重组后链长发生了轻度改变，所以链长可以在不同TCRs之间轻度改变。用一个字母编码表示接头序列中引入的残基。
图20表示用于TCRα和β链的PCR扩增的合成DNA引物的序列。给用于DNA限制酶类的识别位点下划线并在正向引物序列内表示符合相应TCR链的氨基酸序列。用小写字母表示相对于不符合TCR基因的TCR基因序列和其它DNA序列的沉默DNA突变。A用于结合在JM22流感基质病毒肽-HLA-A0201上的TCR的人Vα10.2链的5’PCR引物。B用于结合在JM22流感基质病毒肽-HLA-A0201上的TCR的人Vβ 17链的5’PCR引物。C用于结合在流感核蛋白肽-H2-Db上的TCR的鼠Vα4链的5’PCR引物。D用于结合在流感核蛋白肽-H2-Db上的TCR的鼠Vβ11链的5’PCR引物。E结合在003 HIV-1 Gag肽-HLA-A0201上的TCR的人Vα23链的5’PCR引物。F结合在003 HIV-1 Gag肽-HLA-A0201上的TCR的人Vβ5.1链的5’PCR引物。G结合在HTLV-1Tax肽-HLA-A0201上的A6 TCR的人Vα2.3链的5’PCR引物。H结合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的A6 TCR的人Vβ12.3链的5’PCR引物。I结合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的B7 TCR的人Vα17.2链的5’PCR引物。J结合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的B7 TCR的人Vβ12.3链的5’PCR引物。K一般使用的人Cα链的3’PCR引物。L一般使用的人Cβ链的3’PCR引物。
图21表示作为与c-jun的“亮氨酸拉链”结构域融合的来自JM22的结合在可溶性HLA-A2/flu基质上的TCRα链的推定的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示引入所述DNA序列5’末端以便在大肠杆菌中促进基因表达的突变，正如是TCR与c-jun序列之间的接头序列。
图22表示作为与c-fos的“亮氨酸拉链”结构域融合的来自JM22的结合在可溶性HLA-A2/flu基质上的TCRβ链的推定的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示TCR与c-fos序列之间的接头序列。
图23表示作为与c-jun的“亮氨酸拉链”结构域融合的来自JM22的结合在可溶性H2-Db/流感病毒核蛋白上的TCRα链的推定的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示引入所述DNA序列5’末端以便在大肠杆菌中促进基因表达的突变，正如是TCR与c-jun序列之间的接头序列。
图24表示作为与c-fos的“亮氨酸拉链”结构域融合的来自鼠F5受体的结合在可溶性H2-Db/流感病毒核蛋白上的TCRβ链的推定的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示引入所述DNA序列5’末端以便在大肠杆菌中促进基因表达的突变，正如是TCR与c-fos序列之间的接头序列。
图25表示作为与c-jun的“亮氨酸拉链”结构域融合的来自患者003的结合在可溶性HLA-A2/HIV-1 Gag上的TCRα链的推定的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示引入所述DNA序列5’末端以便在大肠杆菌中促进基因表达的突变，正如是TCR与c-jun序列之间的接头序列。
图26表示作为与c-fos的“亮氨酸拉链”结构域融合的来自患者003的结合在可溶性HLA-A2/HIV-1 Gag上的TCRβ链的推定的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示TCR与c-fos序列之间的接头序列。
图27表示作为与c-jun的“亮氨酸拉链”结构域融合的来自考虑A6的结合在可溶性HTLV-1 Tax/HLA-A2上的TCRα链(Garboczi，Utz等；1996；Garboczi，Ghosh等，1996)的推定的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示引入所述DNA序列5’末端以便在大肠杆菌中促进基因表达的突变，正如是TCR与c-jun序列之间的接头序列。
图28表示作为与c-fos的“亮氨酸拉链”结构域和起BirA替代物作用的生物素标记(Barker和Campbell，1981；Barker和Campbell，1981；Howard，Shaw等，1985；Schatz，1993；O’Callaghan，Byford，1999)融合的来自克隆A6(Garboczi，Utz等；1996；Garboczi，Ghosh等，1996)的结合在可溶性HTLV-1 Tax/HLA-A2上的TCRβ链的推定的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示TCR与c-fos序列之间的接头序列。用粗体和下划线来表示用半胱氨酸残基替换丙氨酸残基的DNA序列的突变。
图29表示作为与c-jun的“亮氨酸拉链”结构域融合的来自克隆M10B7/D3(Ding等，1998)的结合在可溶性HTLV-1 Tax/HLA-A2上的TCRα链的推定的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示TCR与c-jun序列之间的接头序列。
图30表示作为与c-fos的“亮氨酸拉链”结构域和起BirA替代物作用的生物素标记融合的来自克隆M10B7/D3(Ding等，1998)的结合在可溶性HTLV-1 Tax/HLA-A2上的TCRβ链的推定的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示TCR与c-fos序列之间的接头序列。用粗体和下划线来表示用丙氨酸取代半胱氨酸残基的DNA序列的突变。为克隆目的和除去Xmal限制位点而引入的两种沉默突变(P-G密码子)也用小写字母表示。
图31表示作为与c-fos的“亮氨酸拉链”结构域和起BirA替代物作用的生物素标记(Barker和Campbell，1981；Barker和Campbell，1981；Howard，Shaw等，1985；Schatz，1993；O’Callaghan，Byford，1999)融合的来自克隆A6(Garboczi，Utz等；1996；Garboczi，Ghosh等，1996)的结合在突变型可溶性HTLV-1 Tax/HLA-A2上的TCRβ链的推定的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。用小写字母表示TCR与c-fos序列之间的接头序列。用粗体和下划线来表示用半胱氨酸残基取代丙氨酸残基的DNA序列的突变。另外用粗体和下划线表示的是用天冬酰胺残基取代天冬氨酸，它是一种在对可溶性TCR没有可检测到的功能作用的恒定区中的突变。
图32表示用于TCRβ链的c-fos-生物素标记的融合配偶体的推定的蛋白质序列(单字母代码，上部)和DNA序列(下部)。给用于DNA限制酶类的识别位点下划线并表示两个融合结构域的边缘。用小写字母表示接头序列。
图33表示用于人JM22流感基质肽-HLA-A0201的Vβ-c-fos亮氨酸拉链片段的PCR扩增的合成DNA引物序列。
图34是一组凝胶的照片。a.对由SDS-PAGE分析的003 HIV gag肽-HLA-A2复合物具有特异性的TCR的变性蛋白质的制备物。泳道1广范围分子量标记(Bio-Rad)；泳道2和3用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达后的细菌；泳道4和5在6M胍缓冲液中增溶的纯化内含体。b.对由SDS-PAGE分析的流感基质肽-HLA-A2复合物具有特异性的生物素标记的TCR的变性蛋白质的制备物。泳道1广范围分子量标记(Bio-Rad)；泳道2和3在6M胍缓冲液中增溶的α-和β-链的纯化内含体。c.对由SDS-PAGE分析的HTLA tax肽-HLA-A2复合物具有特异性的生物素标记的TCR的变性蛋白质的制备物。泳道1和5广范围分子量标记(Bio-Rad)；泳道2、3和4用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达后的细菌中α-、β-和突变型β-链的表达；泳道6、7和8在6M胍缓冲液中增溶的α-、β-和突变型β-链的纯化内含体。
图35是表示JM22z异二聚体从POROS 10HQ阴离子交换柱上洗脱的层析谱。虚线表示显示出氯化钠浓度的传导性，实线表示在280nm处显示出洗脱液中蛋白质浓度的光密度。收集含有级分的峰蛋白质用于进一步分析。插入部分表示从Superdex 200 HR柱上洗脱纯化的JM22的层析谱。箭头指示用公知分子量校准的柱。通过与这些蛋白质比较，重折叠的JM22蛋白质具有的分子量约为74kDA，它与异二聚化蛋白质一致。
图36是表示纯化JM22z蛋白质的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的照片(考马斯染色)。泳道1和3公知分子量的标准品蛋白质(如指示的)；泳道2在上样前用含有还原剂(DTT)的SDS-样品缓冲液处理的JM22z蛋白质；泳道4在没有还原剂存在的情况下用SDS-样品缓冲液处理的JM22z蛋白质。
图37a.对流感基质肽-HLA-A2复合物具有特异性的重折叠生物素标记的TCR的纯化。i.从POROS 10HQ柱上洗脱所述蛋白质的层析谱。线x表示在280nm处的吸收度且线y表示传导性(用于洗脱所述蛋白质的氯化钠梯度的测定值)。用垂直线表示级分数量。ii.从柱中洗脱下来的级分的SDS-PAGE如i中所示。泳道1中含有广范围分子量标记(Bio-Rad)且泳道2-13中分别含有5μl的级分6-15。iii.对从含有生物素标记的flu-TCR的i中收集的级分的SDS-PAGE分析。泳道1广范围分子量标记(Bio-Rad)；泳道2生物素标记的flu-TCR蛋白质。b.对HTLA-tax肽-HLA-A2复合物具有特异性的重折叠生物素标记的TCR的纯化。i.从POROS 10HQ柱上洗脱所述蛋白质的层析谱。线x表示在280nm处的吸收度且线y表示传导性(用于洗脱所述蛋白质的氯化钠梯度的测定值)。用垂直线表示级分数量。ii.从柱中洗脱下来的级分的SDS-PAGE如i中所示。泳道1中含有广范围分子量标记(Bio-Rad)且泳道2-10中分别含有5μl的级分3-11。iii.对从生物素标记的tax-TCR的i中收集的级分的SDS-PAGE分析。泳道1广范围分子量标记(Bio-Rad)；泳道2生物素标记的tax-TCR蛋白质；泳道3突变型生物素标记的tax-TCR蛋白质。
图38是表示在用BirA酶生物素标记后从用PBS平衡的Superdex 200HR柱上洗脱生物素标记的可溶性TCR的层析谱。生物素标记的TCR在15-16分钟左右时洗脱下来且游离的生物素在21分钟左右时洗脱下来。收集含有生物素标记的可溶性TCR用于进一步应用。
图39是一组凝胶照片。生物素标记TCRs的生物素标记评估。a.重折叠TCRs和内含体制备物的SDS-PAGE。泳道1广范围分子量标记(Bio-Rad)、泳道2生物素标记的flu-TCR、泳道3生物素标记的tax-TCR、泳道4生物素标记的突变型tax-TCR、泳道5HIV gag-TCR(未经生物素标记)；b.将除广范围分子量标记(Bio-Rad)外与a.相同的凝胶蛋白质印迹进行生物素标记(Bio-Rad)。用抗生物素蛋白-HRP接合物染色以显示出生物素标记的蛋白质并用Opti-4CN(Bio-Rad)显色。
图40解释了JM22z与不同HLA-A2-肽复合物的结合情况(插入部分)。通过将来自使TCR通过用1900RU的HLA-A2-flu包被的流式细胞的SPR反应与来自使TCR通过两种其它流式细胞的反应进行比较来证明JM22z与HLA-A2-flu之间相互作用的特异性，其中所述的两种其它细胞中的一种用4200RU的HLA-A2-pol包被，而另一种用4300RU的CD5包被。在1700RU的HLA-A2-pol(a)上测定不同JM22z浓度下的背景响应值。从对1900RU的HLA-A2-flu(b)测定的特异性响应值中扣除背景值并对浓度(c)绘图。通过非线性曲线配合估计的13μM的Kd是以相同数据的斯卡查德图为基础计算的12lμM的Kd。
图41是表示对野生型和突变型可溶性生物素标记的tax TCR进行Biacore 2000TM分析的结果的示意图。使5μl、2.2mg/ml浓度的野生型taxTCR且然后使2.4mg/ml的突变型tax TCR流过含有下列与表面结合的蛋白质的流式细胞Atax-pMHC复合物；B/Cflu-pMHC复合物；DOX68对照蛋白质。野生型和突变型蛋白质以类似方式与特异性pMHC复合物结合。
图42表示可溶性CD8aa结合对可溶性TCR与相同HLA-A2-flu复合物结合的影响。(A)将TCR或TCR加120μM可溶性CD8注入用4100RU的无关蛋白质(CD5)包被的对照流式细胞和用4700RU的HLA-A2-flu包被的探针流式细胞。在扣除背景值后，显示出在不同浓度的单一TCR(空心圆圈)或不同浓度的TCR与120μM可溶性CD8结合物(实心圆圈)下计算的平衡响应值。还显示出的是单一CD8(空心三角形)的值和所计算的TCR+CD8与单一TCR(实心正方形)之间的差值。(B)显示出对在25℃和5μl/分钟流速条件下单一49μM TCR(实心圆圈)或与120μM CD8结合(实心圆圈)的4700RU的固定化HLA-A2-flu响应的时间依赖性(所述的值与对4100RU的固定化CD5测定的背景值相关)；TCR的偏离比例不会受到同时进行CD8结合的影响。
图43.使用外抗生物素蛋白的生物素化TCR的四聚化。使用Superdex200HR柱的凝胶过滤显示生物素化TCR和外抗生物素蛋白结合形成高于各蛋白质分子量的寡聚体。凝胶过滤层析谱A.外抗生物素蛋白；B.生物素化TCR；C.TCR-RPE四聚体。
图44.使用RPE-修饰的链霉抗生物素的生物素化TCR的四聚化。使用Superdex 200HR柱的凝胶过滤显示生物素化TCR和链霉抗生物素-RPE结合形成高于各蛋白质分子量的寡聚体。凝胶过滤层析谱A.链霉抗生物素-RPE；B.生物素化TCR；C.TCR-RPE四聚体。
图45A是表示生物素化可溶性flu-TCR的BIAcore分析结果的示意图。使浓度为1mg/ml的5μl flu-TCR流过经链霉列抗生物素附着下列物质的三种流式细胞-i非特异性对照蛋白质；iiflu基质pMHC；iiitaxpMHC。附图45B是表示flu-TCR四聚体的BIAcore分析结果的示意图。使浓度为0.05mg/ml的5μl flu-TCR四聚体溶液流过经链霉抗生物素附着下列物质的三种流式细胞-i非特异性对照蛋白质；iiflu基质pMHC；iiitax pMHC。
图46A是表示生物素化可溶性tax-TCR的BIAcore分析结果的示意图。使浓度为1mg/ml的5μl flu-TCR流过经抗生物素蛋白附着下列物质的三种流式细胞-i非特异性对照蛋白质；iiflu基质pMHC；iiitaxpMHC。附图45B是表示tax-TCR四聚体的BIAcore分析结果的示意图。使浓度为0.05mg/ml的5μl flu-TCR四聚体溶液流过经抗生物素蛋白附着下列物质的三种流式细胞-i非特异性对照蛋白质；iiflu基质pMHC；iiitax pMHC。
图47.用不同浓度的肽脉冲并用对流感基质肽或HTLV tax肽具有特异性的TCR四聚体染色的T2细胞的FACS分析。A.用于分析的细胞通道。B.用下列肽脉冲的T2细胞的染色“数据.001”＝0肽、“数据.007”＝10-4M flu肽、“数据.009”＝10-5M flu肽、“数据.010”＝10-6M flu肽、“数据.003”＝10-4M tax肽；所有细胞均由用RPE标记的5μg flu-TCR四聚体染色。C.用下列肽脉冲的T2细胞的染色“数据.002”＝0肽、“数据.004”＝10-4M tax肽、“数据.005”＝10-5M tax肽、“数据.006”＝10-6Mtax肽、“数据.008”＝10-4M flu肽；所有细胞均由用RPE标记的5μgtax-TCR四聚体染色。
图48.用不同浓度的肽脉冲并用对流感基质肽或HTLV tax肽具有特异性的TCR四聚体染色的.45细胞的FACS分析。A.用于分析的细胞通道。B.用下列肽脉冲的.45细胞的染色“数据.002”＝0肽、“数据.004”＝10-4M flu肽、“数据.006”＝10-5M flu肽、“数据.010”＝10-4M tax肽；所有细胞均由用RPE标记的5μg flu-TCR四聚体染色。C.用下列肽脉冲的.45细胞的染色“数据.003”＝0肽、“数据.011”＝10-4M tax肽、“数据.013”＝10-5M tax肽、“数据.015”＝10-6M tax肽、“数据.005”＝10-4Mflu肽；所有细胞均由用RPE标记的5μg tax-TCR四聚体染色。
图49.用不同浓度的肽脉冲并用带有红色荧光标记的TCR包被的乳胶珠(‘Flouspheres’-Molecular Probes)染色的T2细胞的FACS分析。A.用于分析的未染色细胞的通道。B.用于分析的染色细胞的通道。注意位移是由与细胞结合的珠的质量产生的侧散射。C.用下列肽脉冲的T2细胞的染色“数据.002”＝0肽、“数据.004”＝10-4M flu肽、“数据.006”＝10-5M flu肽、“数据.007”＝10-6M flu肽；所有细胞均用10μl flu-TCR包被珠染色。D.用下列肽脉冲的T2细胞的染色“数据.003”＝0肽、“数据.009”＝10-4M tax肽、“数据.010”＝10-5M tax肽、“数据.011”＝10-6Mtax肽；所有细胞均用10μl tax-TCR包被珠染色。
实施例在下列实施例中，使用如下列出的一般方法和材料。材料限制酶(Ndel、BamHI、HindIII、Bsu36l、XmaI)来自New EnglandBiolabs。
Tris pH8.1由均来自USB的等份的Tris碱与Tris-HCl制成2M储备溶液。
将EDTA(Sigma)制成0.5M的储备溶液并使用5MNaOH(Sigma)将pH调节至8.0。
氧化和还原形式的谷胱甘肽来自Sigma。
胱胺和半胱胺来自Sigma。
氯化钠来自USB并将其制成4M储备溶液。
用于质粒纯化的小量制备试剂盒来自Quiagen。
PCR纯化试剂盒来自Quiagen。
DTT来自Sigma。
胍来自Fluka。
尿素来自Sigma。
RPMI培养基来自Sigma。
PBS由来自Oxoid的片制成。
甘油来自BDH。一般方法如下制备细菌培养基(TYP培养基)将160g酵母提取物(Difco)、160g胰化蛋白胨(Difco)、50g NaCl(USB)和25g K2HPO4(BDH)溶于2L脱矿质水。将200ml该溶液的等分试样定量入10×2L锥瓶中并通过添加800ml脱矿质水制成1L。将锥瓶用4层铝箔覆盖、标记并高压灭菌。在冷却后，使用前将所述的锥瓶保存在避免日光直接照射的室温下。
使用Pierce考马斯结合检测法并以BSA作为标准品蛋白质测定蛋白质浓度。简单地说，由装在4ml塑料杯中的2mg/ml BSA(Pierce)储备液制备0-25μg BSA标准品溶于1ml体积水所得到的溶液。以相同方式用水将约10μg的未知蛋白质制成1ml。向各杯中加入1ml Pierce考马斯试剂并剧烈混合内含物。使用Beckman DU-530 UV分光光度计在595nm处测定15分钟内的光密度。对来自BSA标准品的结果进行线性回归(线性至25μg BSA是良好的)并通过使用这些结果的内插法来估计未知蛋白质的浓度。
在安装有计算机控制器的Pharmacia FPLC系统上进行凝胶过滤层析。使用用于测定280nm波长处吸收度的UV-M II系统监测蛋白质的洗脱。对于小规模分离来说，使用Superdex 200HR 10/30柱并使用1ml环上样。在运转前用30ml的PBS平衡柱并使含有所收集的1ml级分的样品以0.5ml/分钟流出。对于大规模分离来说，使用Superdex 75或200PG26/60柱与10ml超大环。在这种情况中，收集5或10ml样品并以4ml/分钟流过柱。所有分离均在室温下进行。
在Biocad Sprint系统(Perkin-Elmer)上进行离子交换层析。对于阳离子交换来说，使用20HS或50HS柱。对于阴离子交换来说，使用10HQ、20HQ或50HQ柱。使用可通过6路混合器的所建议的缓冲液过柱。使用5ml注射环注射少量样品(5-25ml。使用一种缓冲液管注射大量样品(>100ml)。在柱运转的洗脱步骤中收集1ml级分。通过280nm处的线内吸光度来测定蛋白质洗脱液。
使用Bio-Rad Mini-Protean II凝胶组件进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。在应用前使用下列程序倾出凝胶。制备凝胶板组件并检验以确保不渗漏。然后制备下列混合物12％丙烯酰胺/二丙烯酰胺(由30％丙烯酰胺/0.8％二丙烯酰胺储备溶液(National Diagnostics)制备)；0.375M Tris pH8.8(由1.5M具有相同pH的储备溶液制备)；0.1％SDS(由10％的SDS储备溶液制备)；0.05％过硫酸铵(由保存在4℃下的10％的相同储备溶液制备)；和0.1％TEMED(Sigma)。立即将该混合物倾入凝胶板组件并使水饱和的丁醇在上部分层以确保上表面平坦。在凝胶已经固定后(最少10-15分钟)，如下混合积层凝胶。4％丙烯酰胺(由如上所述的储备溶液制备)；0.125M Tris pH6.8(由具有相同pH的0.5M储备溶液制备)；0.1％SDS；0.05％过硫酸铵；和0.2％TEMED。通过在薄织物上吸附而从再溶解的凝胶表面除去丁醇并将积层凝胶混合物倾在再溶解的凝胶上部。立即插入凝胶蜂窝体，注意避免将气泡引入凝胶；并使积层凝胶固定最少5分钟。
然后将该凝胶装入凝胶装置并将流动的缓冲液(3g/L Tris-碱、14.4g/L甘氨酸、1g/L SDS(由10×浓缩储备溶液稀释))在阳极和阴极倾入所述装置。在除去凝胶蜂窝体后，用流动的缓冲液洗去孔中物以防止残留的丙烯酰胺混合物固定在孔的底部。通过按1∶1混合蛋白质与下列混合物来制备样品4％SDS；0.125M Tris pH6.8；20％甘油；10％β-巯基乙醇；1％溴酚蓝(Sigma)。接着将样品加热到95℃、持续2分钟并在加样至25μl前冷却入积层凝胶中的孔中。通常加约1-10μg的蛋白质以确保良好的染色和凝胶的流动性。在加样后，以200V的恒定电压使凝胶泳动约40分钟或直到溴酚蓝染料距凝胶末端约5mm为止。
在完成电泳后，从装置中取出凝胶并仔细滴入0.1％的考马斯R-250(Sigma)溶于10％乙酸、40％甲醇、50％水所得到的溶液。然后在几种10％乙酸、40％甲醇、50％水的变化溶液中脱色前将凝胶缓慢搅拌至少30分钟，直到凝胶背景清澈为止。接着将凝胶保存在水中并使用由发光盒、数字照相机和感热式印字机组成的UVP凝胶记录系统进行记录。实施例1-重组可溶性TCR将重组可溶形式的异二聚化TCR分子如图1中所述改造。各链由通过短弹性接头与有助于稳定异二聚体的卷曲螺旋基元融合的膜远端和膜近端免疫球蛋白区组成。
在半胱氨酸残基体外形成链间二硫键前立即将TCR恒定区截短。因此，两链通过非共价四元连接物配对且这由图2b来证明。当fos-jun拉链肽异二聚体也能够立即形成与所用接头连接的链间二硫N-末端(O’Shea等1989)时，预计彼此相对的两链的排列是最佳的情况。需要将融合蛋白以与各单独成分相容的方式连接，从而避免破坏各结构。
通过如上所述的锚式PCR(Moss等1991)从Vβ17+人CTL克隆(JM22)获得编码对HLA-A2中流感基质蛋白58-66表位具有特异性的TCRα和β链的cDNA。
通过使用标准PCR技术扩增各链中的可变区和恒定区并在亮氨酸拉链上剪接分别来自真核转录因子Jun和Fos的产物来分别构建α和βTCR-拉链构建体pJM22α-Jun和pJM22β-Fos(参见图1)。已经证实这些40个氨基酸长度的序列在从合成肽类中重折叠时特异性地异二聚化而不需共价链间键(O’Shea等1989)。
将引物设计成将高AT含量立即引入起始密码子的3’端(以使mRNA二级结构脱稳定)并使用大肠杆菌密码子选择以便最大程度地进行表达(Gao等)。使TCRβ恒定区中的备用半胱氨酸突变成丝氨酸以确保防止在重折叠过程中不正确的二硫键合。
将DNA构建体单独连入大肠杆菌表达载体pGMT7。质粒消化和DNA测序证明该构建体是正确的。
所用的程序具体描述如下。
TCR拉链的表达和变性内含体的纯化将分别含有JM22α-Jun和JM22β-Fos的pGMT7表达质粒GFG020和GFG021分别转入大肠杆菌菌株BL21pLysS并在用0.5mM IPTG诱导蛋白质表达前在37℃下使单一氨苄西林抗性克隆在TYP(氨苄西林100μg/ml)培养基中生长至OD600为0.4。通过在Beckman J-6B中以4000rpm离心30分钟而诱导3小时后收集细胞。将细胞沉淀重新悬浮于含有50mM Tris-HCl、25％(w/v)蔗糖、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮化钠、10mM DTT的缓冲液(pH8.0)中。在过夜冷冻-融化步骤后，使用标准12mm直径探针在MilsonixXL2020超声波仪中将重新悬浮的细胞用1分钟脉冲超声处理、总计约10分钟。通过在Beckman J2-21离心机中以13000rpm离心30分钟来回收内含体沉淀。然后进行三次洗涤剂洗涤以除去细胞碎片和膜成分。通过在Beckman J2-21中以13000rpm离心15分钟而沉淀前，每次将内含体沉淀在Triton缓冲液(50mM Tris-HCL、0.5％Triton-X100、200mMNaCl、10mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮化钠、2每DTT，pH8.0)中匀浆。接着通过用下列缓冲液进行类似洗涤而除去洗涤剂和盐50mMTris-HCl、1mM NaEDTA、0.1％(w/v)叠氮化钠、2mM DTT，pH8.0。最后，在4℃下分别将JM22α-Jun和JM22β-Fos内含体沉淀溶于尿素溶液(50mM MES、8M尿素、10mM NaEDTA、2mM DTT，pH6.5)3-4小时。通过在Beckman J2-21中以13000rpm离心30分钟沉淀不溶性物质并将上清液分成1ml的等分试样并在-70℃下冷冻。用Bradford染料结合试验(Biorad)对溶于尿素中的内含体进行定量。对各链来说，从1升培养物中获得约100mg纯化内含体的产量。以约20mg/ml的浓度使各内含体(JM22α-Jun和JM22β-Fos)溶于尿素溶液中并根据凝胶分析估计这种形式的纯度约为90％(未给出数据)。TCR-拉链融合蛋白的共重折叠使用标准重折叠缓冲液(100mM Tris pH8.5、1M L-精氨酸、2mMEDTA、5mM还原的谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽、0.2mM PMSF)进行的初始重折叠实验导致蛋白质急剧沉淀，这种沉淀情况视存在的拉链结构域而定。这种现象发生在低于拉链二聚化的解离恒定值的浓度下这一事实(即当预计大多数拉链螺旋是单体的情况时)提示另外有力量使错折叠的种类保持稳定。最可能的解释是完整的α-螺旋拉链结构域首先折叠且其瞬时异二聚化可诱导更为复杂的免疫球蛋白区的部分折叠的中间体发生链间聚集。由此将重折叠缓冲液改变成包括5M尿素以便防止部分折叠免疫球蛋白区之间的疏水相互作用并在异二聚化前使各链完全折叠。该步骤足以防止沉淀发生且使用下列方案得到装配有合适产量的正确折叠的TCR-拉链异二聚体。
通过稀释共重折叠来复原TCR-拉链JM22α-Jun和JM22β-Fos的尿素增溶的储备物。从冷冻的储备物中融化约30mg(即1μM)的各增溶的内含体链并加入进一步脉冲的DTT(4μM/ml)以确保完全还原半胱氨酸残基。然后混合样品并将混合物稀释成15ml的胍溶液(6M盐酸胍、10mM乙酸钠、10mM EDTA)，从而确保完整链的变性。接着将含有全部还原并变性TCR-拉链的胍溶液注入1升的下列重折叠缓冲液中100mM TrispH8.5、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM还原的谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽、5M尿素、0.2mM PMSF。使该溶液维持24小时。然后将重折叠物透析两次，第一次对10升的100mM尿素透析，第二次对10升的100mM尿素、10mM Tris pH8.0透析。在6-8℃下进行重折叠和透析步骤。重折叠的TCR-拉链的纯化使用BioCad工作站(Perseptive Biosystems)、通过将透析的重折叠物以7个200ml的等分试样上POROS 10HQ分析型阴离子交换柱并用0-400mM NaCl梯度洗脱结合的蛋白质50个体积以上而从降解产物和杂质中分离TCR-拉链JM22zip。在单峰中以约100mM NaCl洗脱非共价结合的异二聚体。收集和浓缩前，将峰级分(一般含有100-300μg/ml浓度的异二聚体)保存在4℃下。异二聚体的产率约为15％。重折叠TCR-拉链JM22zip的鉴定通过阴离子交换洗脱的JM22zip异二聚体从Superdex 200凝胶过滤分级柱(Pharmacia)上洗脱为约70kDa蛋白质。特别重要的是在表面胞质共振结合分析前包括凝胶过滤步骤，因为精确的亲和性和动力学测定值依赖于发生单体的相互作用。在这种方式中，用于分析的可溶性蛋白质级分中不包括更高级别的聚集物。特别地，聚集物人为地产生可检测的缓慢结合和解离率的恒定值。
通过图2中的还原/非还原凝胶分析检验了各链的氧化态。在SDS存在的情况下，非共价结合的异二聚体被解离成α和β链。如果将DTT用于上样缓冲液，那么两链通过任何一侧的31kDa标记。在没有这类变性剂存在的情况下，两链仍然起单一种类的作用，而各链的迁移率增加，这提示各链已经形成了单一的二硫键结合的种类(Garboczi等1996)。
已经使用Biacore 2000机(Biacore)上的表面胞质共振检测了重折叠受体的抗体反应性。使用标准胺偶合法在pH5.5下将TCR-拉链JM22z固定在葡聚糖基质(CM嵌片)结合表面上。对β链(Vβ17)具有特异性的可变区抗体特异性地与所固定的受体结合，这意味着正确的构象。稳定性表达为α-jun和β-fos亮氨酸拉链融合体的可溶性TCRs在数个月的期限内是稳定的且由此适合于检测由I型MHC呈递的特异性抗原。实施例2-人TCR-病毒肽-MHC的动力学和亲和性研究重折叠TCR-拉链与肽-MHC复合物的特异性结合将表面胞质共振生物传感器(Biacore)用于分析TCR-拉链(JM22zip，对HLA-A2流感基质蛋白M58-66复合物具有特异性)与其肽-MHC配体的结合情况(参见图3)。我们通过生产可以以半定向的方式固定在链霉抗生物素包被的结合表面上的单一pMHC复合物(如下所述)而促进了这一分析，从而可有效地检测可溶性T-细胞受体同时与高达4种不同pMHC(固定在单独的流式细胞上)的结合情况。手工注射HLA复合物使得可方便地操作精确水平的固定化I型分子。
这类固定化复合物能够结合T-细胞受体(参见图3)和共同受体CD8αα，可以将两者注入流动相。甚至在低浓度(至少40μg/ml)下也获得了TCR-拉链的特异性结合，这意味着TCR拉链是相对稳定的。如果将TCR用于流动相或固定相，那么可近似定性和定量地观察到JM22z的pMHC结合特性。这是对可溶性物质的部分活性的重要控制并且还提示生物素标记的pMHC复合物与非生物素标记的复合物同样具有生物活性。化学生物素标记的HLA复合物的制备已经描述了用于生产可溶性重组I型单一肽HLA复合物的方法(Garboczi 1992)。已经将它们进行了修饰以便生产具有以化学方式生物素标记且由此可以被固定在链霉抗生物素包被的结合嵌片上并用于表面胞质基因结合研究的β-2-微球蛋白结构域的HLA复合物。
表达β-2-微球蛋白并基本上如上所述(Garboczi 1992)在标准重折叠缓冲液(100mM Tris pH8.0、400mM L-精氨酸、2mM EDTA、5mM还原的谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽、0.1mM PMSF)中重折叠40mg的β-2-微球蛋白。在任意的凝胶过滤步骤后，将蛋白质交换成0.1M硼酸钠(pH8.8)且最终浓缩至5-10mg/ml。另外使用Bradfod测定法(Biorad)来对β-2微球蛋白进行定量。从制成的10mg/ml的DMSO储备溶液中添加5摩尔过量的生物素羟基琥珀酰亚胺(Sigma)。在室温下将该反应维持1小时并用20μl的1M氯化铵/250μg所用的生物素酯来终止反应。使用Superdex 200凝胶过滤分级柱(Pharmacia)从游离生物素和游离生物素标记的β-2-微球蛋白中分离重折叠的HLA复合物。通过标准胺偶合法来固定链霉抗生物素。结论因此，实施例1中所述的蛋白质重折叠法生产了稳定的、正确折叠的功能性重组受体融合蛋白，它适合于使用光学生物传感器进行的生物物理学分析。该方法已经提供了一种用于进行人TCR-pMHC相互作用的具体亲和性和动力学分析的试剂。已经另外研究了T-细胞共同受体-MHC和TCR-pMHC的相互作用对彼此的影响。所用的重组技术一般适用于鼠和人TCRs(结合在I型和II型上的)且能够对TCRs的范围进行类似的分析。这会产生各种问题，诸如TCR亲和性在抗病毒反应中的范围；区域选择性受体的特性和受体触发的动力学要求。该方法还提供了一种在结晶试验前检验TCR配体特异性的方式并还对其它细胞表面受体的重组生产具有意义。实施例3-可溶性T-细胞受体的生物素标记和四聚体化如实施例1中所述制备的2.5ml纯化的可溶性TCR(～0.2mg/ml)是使用PD-10柱(Pharmacia)交换成生物素标记反应缓冲液(10mM TrispH8.0、5mM NaCl、7.5mM MgCl2)的缓冲液。使用centricon浓缩器(Amicon)将含有10kDa截止分子量的洗脱液(3.5ml)浓缩成1ml。用从储备溶液(调节至pH7.0的0.1g/ml)添加的ATP将其制成5mM。加入蛋白酶抑制剂的混合物亮抑蛋白酶肽、抑胃酶肽和PMSF(0.1mM)；随后加入1mM生物素(从0.2M储备溶液中添加)和5μg/ml酶(来自0.5mg/ml储备溶液)。然后在室温下将该混合物培养过夜。通过对10mM Tris pH8.0、5mM NaCl(200个体积，在4℃下改变两次)透析而从该溶液中除去过量的生物素。接着通过在硝化纤维上印迹、随后用5％脱脂乳粉封闭并且使用链霉抗生物素-HRP接合物(Biorad)进行检测来检验蛋白质中存在的结合生物素。使用外抗生物素蛋白-RPE或外抗生物素蛋白-FITC接合物(Sigma)使生物素标记可溶性TCR四聚化。使用考马斯结合蛋白测定法(Pierce)测定生物素-可溶性TCR的浓度，并计算外抗生物素蛋白接合物与0.224mg可溶性TCR/mg TCR之比以便实现用生物素标记TCR饱和外抗生物素蛋白的比例为1∶4。以添加总量的十分之一的等分试样在冰上添加外抗生物素蛋白接合物，每个等分试样至少持续15分钟(以确保饱和外抗生物素蛋白)。将可溶性TCR四聚体保存在4℃下的暗处。该四聚体在数个月的期限内极为稳定。实施例4-可溶性α/βTCR的表达、重折叠和位点特异性生物素标记a)TCRα和β链的改造如图7中所述改造重组可溶性形式的异二聚化TCR分子。各链由通过短弹性接头与有助于稳定所述异二聚体的卷曲螺旋基序融合的远端和近端免疫球蛋白区组成。
图4-6和11-14表示各种来自具有不同特异性的TCR的TCRα和β链的DNA编码序列和相应的氨基酸序列。本实施例集中在由图4-6的序列所代表的TCR上，而可以使用图11-14中给出的TCRs类似地实施所公开的方法。
TCR恒定区刚好在体内形成链间二硫键的半胱氨酸前已经被截短。结果是两链通过非共价的四元连接物配对。当Fos-Jun拉链肽异二聚体也能够立即形成与所用接头(O’Shea等1989)连接的链间二硫化物N-末端时，推定彼此相对两链的排列是最佳的。需要以与各单独成分相容的方式连接融合蛋白以便避免破坏各结构。
通过如上所述的锚定PCR(Moss等1991)从Vβ17+人CTL克隆(JM22)中获得编码对HLA-A2中流感基质蛋白质58-66表位具有特异性的TCR的α和β链的cDNA。
通过使用标准PCR技术扩增各链的可变区和恒定区并在亮氨酸拉链结构域上剪接分别来自真核转录因子Jun和Fos的产物来分别构建α和βTCR-拉链构建体pJM22α-Jun和pJM22β-Fos。已经证实当从合成肽类中重折叠时这40个氨基酸长度的序列可特异性地异二聚化而不需共价链间键(O’Shea等1989)。
将引物设计成立即将高AT含量引入起始密码子的3’端(以便使mRNA二级结构失去稳定性)并使用大肠杆菌密码选择以便最大限度地表达(Gao等1998)。使TCRβ恒定区中剩余的半胱氨酸突变成丝氨酸以确保防止重折叠过程中不正确的二硫键形成。
图4和5表示了融合的DNA和蛋白质序列。为了使这种TCRβ链的位点特异性地被生物素标记，将编码称作“生物素-标记”的DNA序列改造成可表达可溶性Vβ17的基因的3’端。使用下列PCR引物进行这种DNA构建体的改造5’-GCTCTAGACATATGGGCCCAGTGGATTCTGGAGTCAC-3’和5’-GGGGGAAGCTTAATGCCATTCGATTTTCTGAGCTTCAAAAATATCGTTCAGACCACCACCGGATCCGTAAGCTGCCAGGATGAACTCTAG-3’。
将所得的PCR产物用限制酶NdeI和HindIII(New EnglandBiolabs)消化并用T4 DNA连接酶(New England Biolabs)连入载体pGMT7(Studier等1990)中。附图3表示在该构建体中插入片段的DNA序列和推断的蛋白质序列。b)TCR链的表达如下进行具有对由HLA-A*0201呈递的流感病毒基质肽特异性的TCR的表达和重折叠在TYP培养基(1.6％细菌用胰蛋白胨、1.6％酵母提取物、0.5％NaCl、0.25％K2HPO4)中在载体pGMT7的控制下分别将TCRα和β链在大肠杆菌菌株BL21DE3pLysS中进行表达。在对数中期用0.5mM IPTG来诱导表达并在3-5小时后通过离心收集细菌。通过下列步骤来裂解细菌细胞在“裂解缓冲液”(10mM EDTA、2mM DTT、10mM Tris pH8.1、150mM NaCl、0.5mM PMSF、0.1mg/ml溶菌酶、10％甘油)中重新悬浮；随后加入10mM MgCl2和20μg/ml DNase；在冰上培养20分钟并使用探针超声波仪以10×30秒脉冲进行超声处理。然后通过下列步骤来纯化内含体中的蛋白质使用Triton缓冲液(0.5％Triton-X100、50mM TrispH8、100mM NaCl、0.1％叠氮化钠、10mM EDTA、2mM DTT)的几次洗涤(通常为3次)、使用15,000rpm离心20分钟以沉淀内含体和使用‘dounce’匀浆器来重新悬浮它们。从单独用50mM Tris pH8、100mMNaCl、10mM EDTA、2mM DTT洗涤的制备物中除去洗涤剂并用‘尿素缓冲液’(20mM Tris pH8、8M尿素、10％甘油、500mM NaCl、10mMEDTA、2mM DTT)使蛋白质增溶。在4℃下彻底混合过夜后，通过离心使溶液澄清并在-70℃下保存增溶的蛋白质。通过考马斯结合试验(Pierce)来测定蛋白质浓度。c)TCR的重折叠在37℃下，在‘胍缓冲液’(6M盐酸胍、10mM乙酸钠pH5.5、10mMEDTA、2mM DTT)中进一步使等比例的尿素增溶的蛋白质变性。在冰上将该溶液加入到重折叠缓冲液(5M尿素、100mM Tris pH8、400mML-精氨酸、5mM还原的谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽、0.1mMPMSF)中以确保快速混合。在4℃下＞12小时后，将该溶液对10个体积的水、且然后对10个体积的10mM Tris pH8、100mM尿素进行透析。在所有阶段均加入蛋白酶抑制剂PMSF以使TCR上的生物素标记的蛋白水解损失降到最低限度。d)TCR的纯化通过0.45微米的滤膜过滤稀释的TCR溶液以便除去聚集的蛋白质且然后将该溶液加到POROS 20HQ柱上。用10mM Tris pH8中的氯化钠的梯度来洗脱重折叠的TCR并收集1ml级分且通过SDS-PAGE分析。收集含有TCR的级分并使用30kDa截止离心浓缩器将该级分浓缩至1ml。e)TCR的生物素标记使用缓冲的ATP、5mM MgCl2、1mM生物素将1ml TCR溶液制成7.5mM ATP并加入包括PMSF、亮抑蛋白酶肽和抑胃酶肽在内的蛋白酶抑制剂的混合物。最后，将酶BirA加至5μg/ml的终浓度并使反应在室温下进行过夜。然后通过凝胶过滤从游离的生物素中分离TCR。收集含有生物素标记的TCR的级分并加入蛋白酶抑制剂混合物。还测定了蛋白质浓度。图7表示可溶性生物素标记的TCR的示意图。实施例5-TCR四聚体和TCR包被的珠的生产为了使生物素化TCR四聚化，按照1∶4的摩尔比加入外抗生物素蛋白(Sigma)。将荧光标记的外抗生物素蛋白用于标记细胞的实验。使用逐步添加法以便达到外抗生物素蛋白的饱和，从而可酌情处理生物素化反应中某些不完全性和蛋白质测定中的某些不准确性。在每次为结合进行的添加外抗生物素蛋白之间使它们在冰上保持15分钟，随后在最终添加后的4℃下至少保持过夜。通过在校准的Superdex 200柱(Pharmacia)上对溶液小样进行凝胶过滤来证实四聚化。然后在4℃和有蛋白酶抑制剂混合物和0.05％叠氮化钠存在的条件下保存TCR四聚体溶液。对于TCR四聚体的生产来说，参见附图4-7。
可以用类似的手段包被各种类型的含有可溶性TCR的珠或其它固体支持物。抗生物素蛋白/链霉抗生物素包被的珠可以从商业来源得到(例如，获自DYNAL，Oslo，Norway的Dynabeads或获自Miltenyi Biotec Ltd.，Bergisch Gladbach，Germany的MACS)并可以得到约4.5μm-65nm直径的宽范围大小。已经预先描述了MHC-肽复合物通过生物素-链霉抗生物素在Dynabeads上的固定(Vessey等，1997)。在4℃下，用链霉抗生物素包被的珠将纯化的生物素化蛋白质培养例如30分钟的时间期限，此后，洗涤所述的珠以便除去未结合的蛋白质。这些MHC-肽包被的珠可消除用于刺激表达TCR的细胞系时产生的抗原特异性反应。类似地，可以将TCR四聚体或单体生物素化TCR固定在抗生物素蛋白/链霉抗生物素包被的珠上；或可以通过抗-TCR抗体包被法或通过直接的化学交联或通过其它合适的方法来固定非生物素化TCR。实施例6-脂质体的生产和药物的包裹脂类和其它成分、试验用无菌物和内毒素可以从许多来源得到，例如商购自Sigma Chemical Company或Avanti Polar lipids Inc.，USA。
由形成囊泡的脂类和形成生物素化囊泡的脂类的混合物来制备脂质体。存在各种用于形成脂质体的方法。然后通过合适的连接剂诸如抗生物素蛋白、链霉抗生物素或外抗生物素蛋白将生物素化T细胞受体与脂质体的外部连接。将可检测标记和/或治疗剂混入膜本身或包载在膜内的水体积内。实施例7-来自公知特异性的T细胞系或T细胞克隆的T细胞受体基因的分子克隆用于从细胞中分子克隆TCR基因的方法和程序分别与用于所有α链和所有β链的方法和程序相同且由此仅在本实施例中描述。
用来自“mRNA捕捉试剂盒”(Boehringer Mannheim)的裂解缓冲液裂解合适数量的T细胞、一般为1-5百万个。通过使生物素标记的寡-dT与mRNA的聚腺苷酸尾杂交而用试剂盒试剂分离mRNA。然后通过使生物素与用链霉抗生物素包被的PCR管结合来捕捉杂交的复合物。mRNA在PCR管中固定后，如上所述(‘mRNA捕捉试剂盒’的BoehringerMannheim使用指南)使用AMV逆录酶(Stratagene)生成cDNA。
在cDNA仍然固定的情况下，使用末端转录酶(BoehringerMannheim)在3’末端生成聚腺苷酸尾。然后加入PCR反应混合物，包括高保真度的热稳定聚合酶pfu(克隆的，Stratagene)，使用所述的反应混合物以便使PCR产物中的误差的危害降低到最低限度。使用在相应TCR恒定区中退火的聚-C‘锚定引物’(图15A)和α或β链特异性引物(分别是图15B和C)来进行PCR反应。进行30个循环的由在95℃下变性1分钟、在50℃下退火1分钟和在72℃下延伸5分钟组成的PCR反应以便扩增TCR基因片段。
使用在PCR引物中含有的XhoI和XamI限制酶位点(所有酶均来自New England Biolabs)将PCR产物连入Bluescript测序载体(pBluescript II KS-，Stratagene)。在大肠杆菌菌株XL-1 Blue中转染连接混合物后，选择各链的几个克隆以用于在ABI 377 Prism自动测序仪上使用BigDyeTM终止子(Applied Biosystems Inc.)进行DNA测序。实施例8-编码c-jun和c-fos的40个氨基酸卷曲螺旋(‘亮氨酸拉链’)区的DNA片段的分子克隆使用人cDNA作为模板和图16中所示的引物、通过PCR反应来生成编码c-jun和c-fos的40个氨基酸卷曲螺旋(“亮氨酸拉链”)区的DNA片段。在包括克隆的pfu聚合酶(Stratagene)的反应缓冲液中进行30个循环的PCR反应，所述的循环由在95℃下变性1分钟、在58℃下进行引物退火1分钟和在72℃下延伸2分钟组成。
使用唯一的XhoI和XmaI限制位点将c-jun和c-fos片段连入pBluescript II KS-(Stratagene)以分别获得构建体pBJ107和pBJ108(图7)。通过在ABI 377 Prism自动测序仪上使用BigDyeTM终止子(Applied Biosystems Inc.)进行的DNA测序来检验c-jun和c-fos片段的DNA序列。
然后使用唯一的XmaI和BamHI限制位点将测序的c-jun和c-fos片段亚克隆入T7聚合酶表达载体pGMT7(Studier，Rosenberg等1990)的多接头区。实施例9-用于生产稳定的可溶性TCRs的TCR-亮氨酸拉链融合蛋白的设计用于共重折叠TCRα和β链的胞外片段的尝试产生了有限的成功，其中将所述的α和β链截短使得它们含有可体内形成二硫键的半胱氨酸残基(数据未显示，参见实施例12对用于重折叠条件的表达方法和一般方法和物质的描述)。然而，当刚好在形成链间二硫键的半胱氨酸残基前，即其N-末端一侧将TCRα和β链截短时，在Superdex G-75柱(Pharmacia)上的分析型层析表明少量级分蛋白质(用于重折叠反应的约1-2％的量)已经折叠成截短的α/β异二聚体的预期分子大小的复合物(另外参见(Garboczi，Utz等1996)参考文献中涉及的方法)。
因为形成不正确的二硫键可以在体外重折叠过程中导致不可逆的错折叠，所以通过使在细胞TCR中未配对的TCRβ恒定区中的半胱氨酸残基发生突变来寻找发生这种情况的可能性以便将其降低到最低限度。用半胱氨酸残基替换丝氨酸或丙氨酸残基。用于三个突变步骤的合成DNA引物如图18中所示。刚好在形成链间二硫键的半胱氨酸残基前被截短的TCRα和突变的β链的共同重折叠表明异二聚体、即一般构成15-30％总蛋白的正确分子量的蛋白质级分的产量显著提高。然而，当将这些可溶性TCRs保存过夜时，蛋白质分析证明具有符合异二聚化TCR的分子量的级分已经分裂成符合单体TCRα和β链的两个分子量的峰。在对可溶性TCRs稀释时进行类似的观察，表明α/β链的稳定性较低且不足以进行需要时间间隔长于有限的小时数或蛋白质稀释度的分析。总之，这些用于生产可溶性TCR的方法仅生成具有极为有限稳定性的受体。
为了改进TCRα和β链的稳定性并在重折叠过程中能够有助于异二聚体的形成，使TCR链与公知优选形成异二聚体的c-jun和c-fos的“亮氨酸拉链”结构域融合(O’Shea，Rutkowski等1989；Schuermann，Hunter等1991；O’Shea，Rutkowski等1992；Glover和Harrison 1995)。对用于融合TCRs的两种设计进行试验。
在一种设计中，仅在半胱氨酸残基形成TCRα和β链中的链间二硫键后使亮氨酸拉链与C-末端融合。当c-jun和c-fos亮氨酸拉链肽类也能够立即形成与所用接头N-末端连接的链间二硫化物时(O’Shea，Rutkowski等1989)，推定彼此相对且与链间二硫键相对的两链排列是最佳的。
在另一种设计中，亮氨酸拉链刚好融合到在TCRα和β链中形成链间二硫键的半胱氨酸残基前，即该半胱氨酸残基的N-末端(图19)。因此，在第二种设计中，从重组受体中删除了半胱氨酸残基。
在使用这些设计的TCR-拉链(TCR-z)链进行的重折叠实验中，发现当从TCRα和β链中删除形成链间二硫键的半胱氨酸残基时异二聚化可溶性受体的产量更高，正如图19中所示的设计。实施例10-用于TCR-亮氨酸拉链蛋白的DNA表达载体的构建本实施例描述了用于5种TCRs的α和β链的表达载体的构建。所述的策略和设计应适合于任何人或动物的TCR基因。尽管本文所述的5种TCRs均被MHC I型表位所结合，但是同样可以将本方法用于克隆和构建结合在MHC II型上的TCRs的表达载体。所有载体均表达目的在于重折叠图19中所示设计的可溶性TCR的蛋白质，但是不包括用C-末端生物素标记序列表达的两种TCRs(参见如下和图28、29和30)。克隆策略分别与所有的TCRα和β链的克隆策略相同。
根据对获自含有TCR锚定PCR产物的质粒的序列数据的分析来推定TCRα和β链的前导区的范围或信号肽序列(参见实施例7)。以此为基础，设计用于产生表达不含前导区序列的TCR链的PCR片段的5’引物(图20)。所有的5’引物均编码恰在成熟TCR蛋白质序列前的甲硫氨酸残基以便在大肠杆菌中翻译。用C或G碱基替换A或T(图20)的沉默突变引入大量基因的5’近端密码子以便减少形成二级mRNA结构的倾向，二级mRNA结构的形成对抑制大肠杆菌中的表达不利(PCT/GB98/03235；(Gao，Tormo等1997；Gao，Gerth等1998))。
通过使用含有如实施例6中所述生成的TCR锚定PCR产物的质粒的PCR来扩增可编码结合在人JM22流感基质肽-HLA-A0201(肽序列GILGFVFTL)上的TCR的Vα0.2和Vβ17链、结合在003 HIV-1 Gag肽-HLA-A0201(肽序列SLYNTVATL)上的TCR的人Vα23和Vβ5.1链以及F5 NP肽-H2-Db(肽序列ASNENMDAM)的鼠Vα4和Vβ11链的基因。以用于生成构建这些TCR链的表达载体的PCR产物的质粒形式(Garboczi，Utz等1996；Ding，Smith等1998)获得用于人A6(Vα2.3/Vβ12.3)和B7(Vα17.2/Vβ12.3)TCRs的基因，其中所述的人A6(Vα2.3/Vβ12.3)和B7(Vα17.2/Vβ12.3)TCRs是由HLA-A0201(肽序列LLFGYPVYV)呈递的特异性HTLV-1 Tax肽。将用于这些TCRs的基因克隆入含有c-fos亮氨酸拉链-生物素标记融合片段的序列的表达载体中(参见实施例11)。
在标准缓冲条件下(Stratagene)使用克隆的pfu聚合酶并使用由在95℃下变性1分钟、在60℃下进行引物退火1分钟和在72℃下延伸6分钟组成的25个循环来进行PCR反应。将PCR产物用酶NdeI和XmaI进行限制消化并连入含有c-jun(TCRα链)和c-fos(TCRβ链)插入片段的pGMT7载体中(参见实施例8)。
图21-30表示TCR-z插入片段的序列和由pGMT7载体表达的推定的蛋白质序列。图31表示在恒定区中含有突变而不以可检测到的方式影响可溶性TCR的折叠和功能的A6 TCRβ链的序列(参见实施例12和13)。实施例11-用于与c-fos亮氨酸拉链-生物素标记片段融合的TCRβ链表达的DNA载体的构建为了能够固定可溶性TCRs或能够检测或连接所述受体，如果使用另外的功能性融合成分来生产蛋白质，那么是有用的。这能够得到可溶性TCR诸如作为多聚体被生产或能够进行高度敏感性的检测或使其它功能结合到受体/受体复合物上。
本实施例表明了用于TCRβ链表达载体的构建，在所述经改造的TCRβ链上，在体内大肠杆菌中或体外用酶BirA可以使一种融合多肽特异性生物素标记(Barker和Campbell 1981；Barker和Campbell 1981；Howard，Shaw等1985；Schatz 1993；O’Callaghan，Byford等1999)。正如实施例13和14中所示，可以表达这些可溶性TCR融合物并以相同方式和以类似于不与‘生物素标记’(BT-tag)融合的TCRβ链的产量使其与α链一起重折叠。这些结果证明本文所述的可溶性TCR能够适合于用作为融合配偶体的大量不同的多肽类来表达。
如下使用与fos亮氨酸拉链序列C-末端连接的生物素-标记序列将T细胞受体β-链亚克隆入pGMT7表达载体起始-TCRβ-链-fos拉链-生物素-标记-终止所述构建体末端的确切序列如下(还参见图32)接头→|fos拉链→|BamHI|←接头→|←生物素标记将两种手段用于生产带有生物素标记的可溶性TCRs。就结合在人JM22流感基质肽-HLA-A0201上的TCR而言，使用图33中所示的合成DNA引物在3’-末端修饰克隆的β-链-c-fos亮氨酸拉链融合物以便使用与pfu聚合酶(Stratagene)的标准PCR反应引导BamHI位点替换HindIII位点。
将含有NdeI位点的原始5’引物(参见图20)用作正向引物。将产生的PCR产物克隆入含有生物素-标记序列(图32)的修饰的pGMT7载体中以便形成上述构建体。将该质粒称作JMB002。
使用与图20中所示正向和反向引物的PCR将对结合在HLA-A0201上的HTLV-1表位LLFGYPVYV具有特异性的克隆的TCR、称作A6 taxTCR(Vα2.3/Vβ12.3)截短。将这种TCRβ-链克隆入含有c-fos-BT片段的pGMT7载体(JMB002)的NdeI和XamI位点。
在构建融合表达载体后，进行DNA测序以便确保在亚克隆程序中没有引入错误(所有测序过程均在牛津大学化学系DNA测序实验室中使用ABI377 Prism测序仪和ABI BigDye荧光终止剂来进行)。与公开的序列相比和进一步的研究中，显现出在所述的tax TCRβ-链中存在两个错误，我们发现这两个错误存在于我们得到的原始质粒中。由于这两个错误是在TCRβ-链中唯一的Bsu36I位点的3’端，所以将它用于克隆入(正确的)JMB002质粒中。表达两个版本的tax TCRβ-链并使它们与α-链重折叠并使用Biacore进行比较。两个版本的蛋白质特异性地与具有类似表观亲和性的tax肽-MHC I型分子结合(参见实施例20)。在随后的实验中，仅使用正确版本的β-链。实施例12-大肠杆菌中TCR链的表达和内含体的纯化在TYP培养基中和载体pGMT7的控制下在大肠杆菌菌株BL21DE3pLysS中分别表达TCRα和β链，当在600nm处的光密度(OD)达到0.2-0.6时，使用0.5mM IPTG诱导蛋白质生产。使诱导过程持续过夜并通过在Beckman J-6B离心机中以4000rpm离心来收集细菌。
然后将细菌细胞沉淀重新悬浮于“裂解缓冲液”(10mM Tris pH8.1、10mM EDTA、150mM NaCl、2mM DTT、10％甘油)。将该混合物在冰上冷却且随后加入20μg/ml溶菌酶、10mM MgCl2、和20μg/mlDnase I；接下来在冰上最少培养1小时。
接着使用12mM探针超声波仪(Milsonix XL2020)在全功率下对所述的混合物进行超声处理、在30秒的间隔进行5个30秒的脉冲猝发，从而使所述的混合物冷却下来。在该过程中使用冰-水混合物来维持温度。然后用5个体积的“Triton洗涤缓冲液”(50mM Tris pH8.1、0.5％Triton X-100、100mM NaCl、0.1％叠氮化钠、10mM EDTA、2mM DTT)稀释该混合物。冰上最少培养1小时后，在Beckman GS-6R离心机中以3,500rpm离心该混合物并弃去上清液。使用小塑料一次性移液管将沉淀重新悬浮于“重新悬浮缓冲液”(50mM Tris pH8.1、100mM NaCl、10mM EDTA、2mM DTT)中。然后在Beckman J2-21离心机中以8,000rpm离心该混合物并弃去上清液。使用手控匀浆器将沉淀重新悬浮于“胍缓冲液”(50mM Tris pH8.1、6.0M盐酸胍、100mM NaCl、10mMEDTA、2mM DTT)中。在低速离心以除去不溶性物质后，将上清液等分并保存在-70℃下。通常获得约100mg/升细菌培养物的产量。
通过在胍缓冲液中用SDS-PAGE样品缓冲液稀释2μl的内含体制备物、随后加热至100℃ 2分钟来进行对纯化内含体制备物的SDS-PAGE分析。将样品加到凝胶上，同时仍然加温以防止胍/SDS混合物在上样过程中沉淀。通过以该方式进行的SDS-PAGE的考马斯染色将以该方式纯化的内含体蛋白质鉴定约为90％的纯度(参见附图34)。实施例13-TCRz异二聚体的重折叠和纯化在37℃下，在“胍缓冲液”(6.0M盐酸胍、10mM乙酸钠pH5.5、10mM EDTA、2mM DTT)中进一步使等比例的尿素增溶的蛋白质变性。以60mg/L的总蛋白质浓度将该蛋白质混合物注入冰冷的重折叠缓冲液(50mM Tris pH8.1、0.4M L-精氨酸-HCl、5.0M尿素、5mM还原的谷胱甘肽、0.5mM氧化的谷胱甘肽)中以确保快速混合。冰上至少培养5小时以便重折叠后，将该混合物对10个体积的脱矿质水透析24小时且然后对10个体积的10mMTris pH8.1透析24小时。
接着通过0.45μ硝化纤维膜(Whatman)过滤透析的重折叠蛋白质以便除去聚集的蛋白质(在重折叠过程中作为副产物产生)。然后通过上在连接有Biocad Sprint系统的POROS 20HQ柱来进行生物素标记的可溶性TCR的纯化。每次运转可以加约500ml的重折叠蛋白质溶液并通过在Bis-Tris-丙烷缓冲液(pH8.0)中氯化钠的梯度来洗脱所述的蛋白质。使以约100mM氯化钠洗脱的蛋白质和相关级分立即在冰上骤冷并加入蛋白酶抑制剂混合物。通过考马斯染色的SDS-PAGE来分析级分。实施例14-带有可生物素标记的β链的TCRz异二聚体的重折叠和纯化将生物素标记的TCRβ链与表达并纯化为可溶性TCR细胞受体的等量α-链混合。按照与实施例13对TCRz所述相同的程序来重折叠异二聚化的TCRz-β-BT(参见图37)。实施例15-生物素标记的可溶性TCRz-BT的生物素标记使用10K截止离心浓缩器(Ultrafree，Millipore)将含蛋白质的级分浓缩至2.5ml。使用用10mM Tris pH8.1、5mM NaCl平衡的PD-10脱盐柱来交换缓冲液；进一步加入蛋白酶抑制剂混合物并再次使用离心浓缩器将蛋白质浓缩至～1ml。向1ml的生物素标记的可溶性TCR中加入下列物质7.5mM MgCl2、5mM ATP(pH8.0)、1mM生物素、2.5μg/mlBriA生物素标记酶。然后使该生物素标记反应在室温下(20-25℃)进行过夜。
接着通过在连接有Pharmacia FPLC系统的Superdex 200HR柱(Pharmacia)上进行凝胶过滤而从残留的未反应的生物素中分离酶促生物素标记的可溶性TCR(参见图38)。用PBS平衡该柱并收集1ml级分，使其立即在冰上骤冷并再次用蛋白酶抑制剂混合物对其进行保护。使用考马斯结合试验(Pierce)来估计蛋白质浓度且然后将生物素标记的蛋白质在4℃下保存达1个月或在-20℃下保存更长的期限。
使用生物素标记的蛋白质的蛋白质印迹法来检验生物素标记反应的功效。在使用SemiPhor半干电印迹装置(Hoefer)将凝胶印迹在PVDF膜(Bio-Rad)上、但不进行染色前，使用所述方法来使SDS-PAGE凝胶运动。该印迹堆积物由切成所述凝胶大小并浸入了转移缓冲液(25mMTris碱、150mM甘氨酸)的6层滤纸(Whatman 4M)组成，随后将PVDF膜用甲醇预湿润且然后浸入转移缓冲液中，接着在转移缓冲液中将凝胶、随后是6层以上的浸泡滤纸缓慢搅拌5分钟。使用试验管压制所述的堆积物以便压出任何气泡并加入约10ml的附加转移缓冲液以辅助传导。将阴极置于所述的堆积物之上并以50mA的恒定电流使电流通过装置1小时。然后在室温和缓慢搅拌条件下将膜在明胶(Bio-Rad)溶于PBS-T缓冲液(PBS+0.05％吐温-20)所得到的2％溶液中培养＞1小时。过夜的培养还包括使用0.01％叠氮化钠以抑制细菌生长。将该膜用几种(4-5种)改变的PBS-T洗涤，随后在室温和缓慢搅拌条件下用在明胶溶于PBS-T得到的1％溶液中按1∶1000稀释的抗生物素蛋白-HRP接合物(Sigma)染色＞30分钟。在用Opti-4CN(Bio-Rad)检测前用几种(4-5种)改变的PBS-T洗涤该膜。这是一种在有HRP存在的情况下反应形成不溶性蓝色染料的试剂，所述的蓝色染料可在一定位置上对所述的膜染色，在该位置上有如存在的结合HRP指示的相关蛋白质。当将抗生物素蛋白-HRP接合物用于染色时，它由此表明存在含有生物素的蛋白质。
图39表示以这类方式对几种生物素标记的TCRs进行的印迹。涉及该印迹的标准品是生物素标记的广范围分子量标记(Bio-Rad)。该印迹清楚地表明了含有已经与BirA酶反应的生物素标记的TCRs的高水平生物素标记。实施例16-生物素标记的可溶性MHC-肽复合物的生产生物素标记的可溶性MHC-肽复合物可以如上述实施例2中所述来生产。实施例17-对可溶性TCR与MHC-flu-肽之间的特异性结合的检测可溶性TCR分子JM22z对可呈递由流感基质蛋白质的氨基酸残基58-66(GILGFVFTL)组成的免疫显性抗原的HLA-A2 MHC分子具有特异性。JM22z的克隆、表达和纯化如实施例7、10、11和13以及图35和36中所述。在Biacore 2000TM表面胞质共振(SPR)生物传感器上分析JM22z与其配体/MHC复合物(HLA-A2-flu)或无关HLA-A2肽结合物之间的相互作用(它们的生产如实施例16中所述)。SPR测定接近传感器表面的小流式细胞内用响应单位(RU)表示的折射率的改变，这是一种可以用于检测受体配体相互作用并分析其亲和性和动力学参数的机理。通过在分离的流式细胞中经交联在β2m上的生物素与已经以化学方式与激活的流式细胞表面交联的链霉抗生物素之间的结合而固定各个HLA-A2-肽复合物来制备探针流式细胞。然后通过使JM22z以恒定的流速经过不同流式细胞表面来进行检测，从而测定在实施这类步骤中的SPR响应值。最初，通过使28μM JM22z以5μl/分钟的恒定流速经过三种不同的表面来检验所述相互作用的特异性；其中一种表面用2800RU的HLA-A2-flu包被、第二种表面用4200RU的经来自HIV逆录酶的无关肽折叠的HLA-A2-flu(HLA-A2-polILKEPVHGV)包被、且第三种表面用4300RU的CD5包被(图40a插入部分)。将以恒定流速和超过HLA-A2-pol的不同浓度注射的可溶性JM22z用于定义背景共振(图40a)。将这些对照测定值从用HLA-A2-flu(图40b)获得的值中扣除并用于计算表示为解离恒定值Kd(图40c)的结合亲和性。在37℃下将JM22z和相关MHC分子的Kd测定为15±4μM(n＝7)并且在25℃下测定为6.6±2μM(n＝14)。在25℃下使用在探针流式细胞中固定的TCR和可溶性MHC-肽复合物进行的测定得到类似的Kd为5.6±4μM(n＝3)。在37℃下测定的相互作用的正常速率为6.7×104-6.9×104M-1S-1，而非正常速率为1.1s-1(Willcox，Gao等1999)。实施例18-对可溶性鼠TCR与鼠MHC H2-Db-NP之间的特异性结合的检测在本实验中，我们使用对来源于由鼠H2-DbMHC分子(H2-Db-NP)呈递的流感病毒核蛋白(aa.366-374ASNENMDAM)肽具有特异性的鼠TCR即F5。轻度修饰所用的MHC重链基因，其意义是它可仅编码天然蛋白质的第1-280位氨基酸和由BirA酶识别的第13位氨基酸序列。可以以酶促方式使所得的蛋白质被生物素标记(Schatz 1993；O’Callaghan，Byford等1999)。使用对固定化H2-Db-NP具有特异性的可溶性TCR在Biacore 2000TMSPR生物传感器上进行的SPR分析证明它可特异性地结合配体MHC-肽结合物(数据未显示)。实施例19-生物素标记的可溶性tax-TCR与生物素标记的可溶性突变型tax TCR结合的比较如实施例12-14中所述制备生物素标记的可溶性tax-TCRs并如实施例17中所述使用用流感基质肽(GILGFVFTL)或HTLV tax 11-19肽(LLFGYPVYV)重折叠的生物素标记的pMHC复合物来进行Biacore2000分析。使生物素标记的可溶性TCRs以5μl/分钟流过所有的细胞，总计1分钟。图41表示首先是生物素标记的可溶性tax-TCR且然后是生物素标记的可溶性突变型tax-TCR与HTLV tax 11-19肽-MHC复合物(A)的结合情况。野生型和突变型tax-TCR均没有表现出与流感基质肽-MHC复合物(B/C)或OX68单克隆抗体对照物(D)的结合。因此，我们推断显然野生型和突变型生物素标记的可溶性TCRs均可有效而特异性地与tax-pMHC复合物结合并在结合程度上几乎没有显示出差异。实施例20-同时与固定化MHC肽复合物结合的TCR-和CD8共同受体的分析CD8和CD4是通过同时结合与TCR相同的MHC分子而认为对TCRs起共同受体作用的表面糖蛋白。CD8是细胞毒性T细胞的特征且它与MHC I型分子结合，而将CD4在辅助系T细胞上表达且它结合MHCII型分子。CD8是由两个相同的α-链组成或由一个α-链和一个β-链组成的二聚体。如上所述(PCT/GB98/03235；(Gao，Tormo等1997；Gao，Gerth等1998))生产异二聚化αα-CD8分子。在本实施例中，我们描述了可溶性TCR和CD8分子同时与固定化HLA-A2-flu复合物结合。正如在图42A中所观察到的，结合响应是单纯附加的。从合并的响应值(实心圆圈)中扣除TCR响应值(空心圆圈)得到接近于单独120μM CD8响应值(空心三角形)的值(空心正方形)。图42B表示TCR-MHC-肽相互作用的动态特性不受同时进行的CD8结合的影响。所观察到的附加性结合表明TCR和CD8在分离的界面上结合MHC肽复合物。本实施例还解释了在某些情况中一个分子的特异性结合不会影响另一个分子的特异性结合，对于分子的其它结合情况来说，最可能的情况就是不同。实施例21-TCR四聚体从生物素化可溶性TCR中的形成使用抗生物素蛋白或链霉抗生物素或其衍生物可以形成TCR四聚体。抗生物素蛋白(来自母鸡的卵)具有非常高的等电点，从而在中性pH下产生较高的正电，它可导致与许多其它蛋白质和表面的非特异性结合。因此，通常将它进行商业上的修饰以便降低等电点，使得它表现得更类似于链霉抗生物素(来源于细菌)。在这种形式中，将它称作外抗生物素蛋白(Sigma)或中性抗生物素蛋白(Neutravidin)(Molecular Probes)。可以将它们中的每一种或链霉抗生物素修饰成含有诸如用于使用FACS扫描的检测的荧光标记这样的标记物。
使用占总生物素化可溶性TCR浓度1/4的终浓度的外抗生物素蛋白/链霉抗生物素来形成TCR四聚体。按照等分将外抗生物素蛋白/链霉抗生物素加到冰上，使得如果浓度不十分精确，那么仍然可以用TCR来饱和大部分的外抗生物素蛋白/链霉抗生物素。通过Superdex 200 HR柱(Pharmacia)上的大小排阻层析来分析TCR四聚体-图43和44。通过分别洗脱未连接的TCR对照样品和外抗生物素蛋白/链霉抗生物素来证实TCR与抗生物素蛋白的连接。TCR四聚体以相当于高分子量的保留体积从该柱上洗脱下来。对于未修饰的外抗生物素蛋白来说，能够测定产生的TCR四聚体的大约的分子量(通过与公知分子量的蛋白质标准物比较)，与计算的全TCR四聚体的分子量305,000相比为～285,000。实施例22-生物素化单体TCR和TCR四聚体与MHC肽结合的分析如实施例16中所述使用流感基质肽(GILGFVFTL)或HTVL tax肽(LLFGYPVYV)、重组HLA-A2重链和重组化学生物素化β-2-微球蛋白来制备肽-MHC复合物。将Biacore 2000TMSPR生物传感器用于测定TCRs、TCR-四聚体和pMHC复合物之间的分子相互作用。通过胺偶合将生物素化pMHC复合物固定在与CM-5嵌片表面接合的链霉抗生物素上。将来自Sir William Dunn School of Pathology的Dr.P.Anton van derMerwe提供的一种生物素化单克隆抗体OX68用作细胞之一中的非特异性对照蛋白质。
在pMHC复合物固定后，将残余的结合生物素的位点用10mM生物素饱和。对于防止生物素化TCRs通过其生物素化而不是特异性地通过TCR-pMHC相互作用结合链霉抗生物素包被的嵌片来说，这是必要的。然后使可溶性生物素化TCRs以约1mg/ml的浓度流过所述的嵌片并使TCR四聚体以约50μg/ml的浓度流过。
图45表示可溶性生物素化flu-TCR和flu-TCR四聚体与pMHC复合物的结合情况；附图46表示可溶性生物素化tax-TCR和tax-TCR四聚体与相同pMHC复合物的结合情况。生物素化sTCRs和TCR四聚体均显示出完整的特异性，从而牢固地与其特异性肽-MHC复合物结合而并不与非特异性肽MHC复合物结合。在相应的两种TCR即sTCR和TCR四聚体的不正常情况中可以观察到了由sTCR多聚化导致的亲和性的增加。两种TCRs的不正常情况从几秒增加至几小时(不正常情况的确切测定因再结合作用而是不可能的)。
在由制备过程中聚集蛋白质的存在而导致的两种情况中均观察到了某些更为永久结合的生物素化可溶性TCR。在两种情况中，这种牢固结合的水平远低于所考虑到的TCR四聚体，即在流式细胞上注射的TCR四聚体的总量约为注射的生物素化可溶性TCR的量的1/4(与5μl×1mg/ml相比为25μl×0.05mg/ml)。实施例23-用TCR四聚体对抗原呈递细胞的染色在称作T2的B-细胞系上进行细胞染色实验，所述的B-细胞系对于HLA-A2来说是纯合的并且不加工导致细胞表面上可以用单一类型外部肽充填的未充填MHC 1型分子存在的肽抗原。在37℃下和5％CO2气体中，使细胞在R-10培养基中生长。取出约2百万个细胞并用RPMI培养基洗涤两次(以1,500rpm离心5分钟)，以不同的浓度将肽加入到10％DMSO的RPMI中。一般来说，使用0、10-4、10-5、和10-6M的流感基质肽(序列GILGFVFTL)和tax肽(序列LLFGYPVYV)。在37℃下将细胞脉冲1小时以使肽与细胞表面上的MHC 1型分子结合。然后用RPMI培养基将细胞洗涤两次以便除去过量的肽。
在室温下，使用含有用FITC或RPE荧光标记标记的1-10μg TCR四聚体的TCR四聚体染色肽脉冲的细胞。使染色持续30分钟且然后用冰冷的RPMI将细胞洗涤一次，随后用3％甲醛的PBS溶液固定。接着在4℃下将固定的染色的细胞保存在暗处直到FACS分析前1周为止。
使用Becton-Dickinson FACS扫描仪进行FACS分析并记录数据和使用‘Cellquest’软件分析。附图47表示用flu基质TCR或tax TCR制得的TCR四聚体与其特异性肽类的特异性结合。背景和交叉反应性较低。令人感兴趣的是，看起来tax TCR四聚体与其肽的结合好于flu基质TCR四聚体与其肽的结合，不过，这可以是在肽脉冲过程中所述肽对MHC 1型分子的不同亲和性的作用。
还使用TCR四聚体来染色另一种类细胞即属于对HLA-A2来说是杂合的正常B-细胞系的.45细胞。就T2细胞而言，制备细胞并进行肽脉冲、标记和确切地FACS扫描。附图48表示标记肽脉冲的.45细胞的TCR四聚体的结果。对该细胞的染色显著低于对T2细胞的染色，预计这会得到对HLA-A2来说是杂合的.45细胞，而T2细胞是纯合的。除这种作用外，因为最初用肽充填了.45细胞表面上的MHC 1型复合物、而就T2细胞而言所述的复合物最初是空的，所以在T2细胞表面上加载肽的功效大于其它HLA-A2阳性细胞也是可能的。实施例24-TCR包被的乳胶珠的制备和使用TCR包被的乳胶珠的染色为了改善TCR对抗原染色的敏感性，制备用荧光标记标记的TCR包被的珠。荧光标记的中性抗生物素蛋白(Neutravidin)包被的珠商购自Molecular Probes。通过在4℃下与饱和浓度的TCR共培养来用生物素化可溶性TCR包被所述珠以便确保所述珠上最大数量的结合位点充满TCR。然后将所述珠用于标记肽脉冲的抗原呈递细胞，除包括阻断试剂以便降低自然背景值外，所使用的方式与对TCR四聚体所述的方式类似。正如对非脉冲的细胞和对用无关肽脉冲的细胞的高度染色所证明的，这种策略不完全成功。然而，在染色的自然背景值内还观察到了主要量的特异性标记(图49)。令人感兴趣的是，观察到了用tax TCR包被的珠对tax肽脉冲的T2细胞的某些标记。这种标记处于低于能够使用TCR四聚体检测的肽浓度的数量级，这表明TCR的高度多聚化使得检测和结合低水平呈递的抗原成为可能。
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Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Pro Gly Gly Arg195 200 205Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser210 215 220Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu225 230 235 240Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr245<210>3<211>864<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述编码与c-fos亮氨酸拉链结构域融合的结合在人HLA-A2/flu基质肽上的JM22 TCRβ链的基因。<400>3atggtggatg gtggaatcac tcagtcccca aagtacctgt tcagaaagga aggacagaat 60gtgaccctga gttgtgaaca gaatttgaac cacgatgcca tgtactggta ccgacaggac 120ccagggcaag ggctgagatt gatctactac tcacagatag taaatgactt tcagaaagga 180gatatagctg aagggtacag cgtctctcgg gagaagaagg aatcctttcc tctcactgtg 240acatcggccc aaaagaaccc gacagctttc tatctctgtg ccagtagttc gaggagctcc 300tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtt 360ttcccacccg aggtcgctgt gtttgaacca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 540cccgccctca 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Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe115 120 125Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val130 135 140Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp145 150 155 160Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro165 170 175Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser180 185 190Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe195 200 205Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr210 215 220Gln Asn Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp225 230 235 240Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr245 250 255Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn260265 270Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr275 280 285<210>5<211>918<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述编码与c-fos亮氨酸拉链结构域和BirA生物素化标记融合的结合在人HLA-A2/flu基质肽上的JM22 TCRβ链的基因。<400>5atggtggatg gtggaatcac tcagtcccca aagtacctgt tcagaaagga aggacagaat 60gtgaccctga gttgtgaaca gaatttgaac cacgatgcca tgtactggta ccgacaggac 120ccagggcaag ggctgagatt gatctactac tcacagatag taaatgactt tcagaaagga 180gatatagctg aagggtacag cgtctctcgg gagaagaagg aatcctttcc tctcactgtg 240acatcggccc aaaagaaccc gacagctttc tatctctgtg ccagtagttc gaggagctcc 300tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtt 360ttcccacccg aggtcgctgt gtttgaacca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 540cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840gagttcatcc tggcagctta cggatccggt ggtggtctga acgatatttt tgaagctcag 900aaaatcgaat ggcattaa918<210>6<211>305<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述与c-fos亮氨酸拉链结构域和BirA生物素化标记融合的结合在人HLA-A2/flu基质肽上的JM22 TCRβ链的氨基酸序列。<400>6Met Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys15 10 15Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp20 25 30Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu50 55 60Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val65 70 75 80Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser85 90 95Ser Arg Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr100 105 110Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe115 120 125Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val130 135 140Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp145 150 155 160Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro165 170 175Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser180 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His305<210>7<211>750<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述编码与c-jun亮氨酸拉链结构域融合的来自克隆A6的结合在人HLA-A2/HTLV-1 Tax肽上的TCRα链的基因。<400>7atgcagaagg aagtggagca gaactctgga cccctcagtg ttccagaggg agccattgcc 60tctctcaact gcacttacag tgaccgaggt tcccagtcct tcttctggta cagacaatat 120tctgggaaaa gccctgagtt gataatgtcc atatactcca atggtgacaa agaagatgga 180aggtttacag cacagctcaa taaagccagc cagtatgttt ctctgctcat cagagactcc 240cagcccagtg attcagccac ctacctctgt gccgttacaa ctgacagctg ggggaaattg 300cagtttggag cagggaccca ggttgtggtc accccagata tccagaaccc tgaccctgcc 360gtgtaccagc tgagagactc taaatccagt gacaagtctg tctgcctatt caccgatttt 420gattctcaaa caaatgtgtc acaaagtaag gattctgatg tgtatatcac agacaaaact 480gtgctagaca tgaggtctat ggacttcaag agcaacagtg ctgtggcctg gagcaacaaa 540tctgactttg catgtgcaaa cgccttcaac aacagcatta ttccagaaga caccttcttc 600cccagcccag aaagttcccc cgggggtaga atcgcccggc tggaggaaaa agtgaaaacc 660ttgaaagctc agaactcgga gctggcgtcc acggccaaca tgctcaggga acaggtggca 720cagcttaaac agaaagtcat gaactactag 750<210>8<211>249<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述与c-jun亮氨酸拉链结构域融合的来自克隆A6的结合在人HLA-A2/HTLV-1 Tax上的TCRα链的氨基酸序列。<400>8Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30
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Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala115 120 125Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr130 135 140Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser145 150 155 160Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro165 170 175Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu180 185 190Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn195 200 205His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu210 215 220Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu225 230 235 240Ala Trp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala245 250 255Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile260 265 270Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala275 280 285Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile290 295 300Glu Trp His305<210>11<211>765<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述编码与c-jun亮氨酸拉链结构域融合的来自克隆M10B7/D3的结合在人HLA-A2/HTLV-1 Tax肽上的TCRα链的基因。<400>11atgcaacaga agaatgatga ccagcaagtt aagcaaaatt caccatccct gagcgtccag 60gaaggaagaa tttctattct gaactgtgac tatactaaca gcatgtttga ttatttccta 120tggtacaaaa aataccctgc tgaaggtcct acattcctga tatctataag ttccattaag 180gataaaaatg aagatggaag attcactgtc ttcttaaaca aaagtgccaa gcacctctct 240ctgcacattg tgccctccca gcctggagac tctgcagtgt acttctgtgc agcaatggag 300ggagcccaga agctggtatt tggccaagga accaggctga ctatcaaccc aaatatccag 360aaccctgacc ctgccgtgta ccagctgaga gactctaaat ccagtgacaa gtctgtctgc 420ctattcaccg attttgattc tcaaacaaat gtgtcacaaa gtaaggattc tgatgtgtat 480atcacagaca aaactgtgct agacatgagg tctatggact tcaagagcaa cagtgctgtg 540gcctggagca acaaatctga ctttgcatgt gcaaacgcct tcaacaacag cattattcca 600gaagacacct tcttccccag cccagaaagt tcccccgggg gtagaatcgc ccggctggag 660gaaaaagtga aaaccttgaa agctcagaac tcggagctgg cgtccacggc caacatgctc 720agggaacagg tggcacagct taaacagaaa gtcatgaact actag 765<210>12<211>254<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述与c-jun亮氨酸拉链结构域融合的结合在人HLA-A2/HTLV-1 Tax上的TCRα链的氨基酸序列。<400>12Met Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln Asn Ser Pro Ser1 5 10 15Leu Ser Val Gln Glu Gly Arg Ile Ser Ile Leu Asn Cys Asp Tyr Thr20 25 30Asn Ser Met Phe Asp Tyr Phe Leu Trp Tyr Lys Lys Tyr Pro Ala Glu35 40 45Gly Pro Thr Phe Leu Ile Ser Ile Ser Ser Ile Lys Asp Lys Asn Glu50 55 60Asp Gly Arg Phe Thr Val Phe Leu Asn Lys Ser Ala Lys His Leu Ser65 70 75 80Leu His Ile Val Pro Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys85 90 95Ala Ala Met Glu Gly Ala Gln Lys Leu Val Phe Gly Gln Gly Thr Arg100 105 110Leu Thr Ile Asn Pro Asn Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln115120 125Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp130135 140Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr145 150 155 160Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser165 170 175Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn180 185 190Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro195 200 205Glu Ser Ser Pro Gly Gly Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys210 215 220Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu225 230 235 240Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr245 250<210>13<211>925<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述编码与c-fos亮氨酸拉链结构域和BirA生物素化标记融合的来自克隆M10B7/D3的结合在人HLA-A2/HTLV-1 Tax肽上的TCRβ链的基因。<400>13atgaacgctg gtgtcactca gaccccaaaa ttccaggtcc tgaagacagg acagagcatg 60acactgcagt gtgcccagga tatgaaccat gaatacatgt cctggtatcg acaagaccca 120ggcatggggc tgaggctgat tcattactca gttggtgctg gtatcactga ccaaggagaa 180gtccccaatg gctacaatgt ctccagatca accacagagg atttcccgct caggctgctg 240tcggctgctc cctcccagac atctgtgtac ttctgtgcca gcagttacca ggaggggggg 300ttttacgagc agtacttcgg gccgggcacc aggctcacgg tcacagagga cctgaaaaac 360gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 420aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttctaccccg accacgtgga gctgagctgg 480tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacag acccgcagcc cctcaaggag 540cagcccgccc tcaatgactc cagatacgct ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 600ttctggcagg acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 660aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cccgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 720tggggtagag cagaccccgg gggtctgact gatacactcc aagcggagac agatcaactt 780gaagacaaga agtctgcgtt gcagaccgag attgccaatc tactgaaaga gaaggaaaaa 840ctagagttca tcctggcagc ttacggatcc ggtggtggtc tgaacgatat ttttgaagct 900cagaaaatcg aatggcatta agctt925<210>14<211>306<212>PRT<213>流感病毒<400>14Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr1 5 10 15Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr20 25 30Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His35 40 45Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly50 55 60Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu65 70 75 80Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Ser Tyr85 90 95Pro Gly Gly Gly Phe Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu100 105 110Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val115 120 125Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu130 135 140Val cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp145 150 155 160Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln165 170 175Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser180 185 190Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn His195 200 205Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp210 215 220Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala225 230 235 240Trp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu245 250 255Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala260 265 270Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu PheIle Leu Ala Ala Tyr275 280285Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu290 295 300Trp His305<210>15<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述使用末端转移酶对在带有一段G-残基序列的3＇-末端伸展的cDNAs进行PCR扩增的正向聚-C“锚定”引物。<400>15taaatactcg aggcgcgccc cccccccccc ccc 33<210>16<211>48<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人TCRα链恒定区3＇-特异性引物。<400>16atataacccg gggaaccaga tccccacagg aactttctgg gctgggga 48<210>17<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人TCRβ链恒定区3＇-特异性PCR引物。<400>17atataacccg gggaaccaga tccccacagt ctgctctacc ccaggcc47<210>18<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人c-jun亮氨酸拉链5＇-特异性PCR引物。<400>18catacacccg ggggtagaat cgcccggctg gag 33<210>19<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人c-jun亮氨酸拉链3＇-特异性PCR引物。<400>19gtgtgtgctc gaggatccta gtagttcatg actttctgtt taagctgtgc50<210>20<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人c-fos亮氨酸拉链5＇-特异性PCR引物。<400>20catacacccg ggggtctgac tgatacactc caagcggag39<210>21<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述人c-fos亮氨酸拉链3＇-特异性PCR引物。<400>21tgtgtgctcg aggatcctag taagctgcca ggatgaactc tagtttttc 49<210>22<211>120<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>编码与TCRα链融合的亮氨酸拉链结构域的部分人c-jun序列。<400>22agaatcgccc ggctggagga aaaagtgaaa accttgaaag ctcagaactc ggagctggcg 60tccacggcca acatgctcag ggaacaggtg gcacagctta aacagaaagt catgaactac 120<210>23<211>120<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>编码与TCRβ链融合的亮氨酸拉链结构域的部分人c-fos序列。<400>23ctgactgata cactccaagc ggagacagac caactagaag atgagaagtc tgctttgcag 60accgagattg ccaacctgct gaaggagaag gaaaaactag agttcatcct ggcagcttac 120<210>24<211>40<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>与TCRα链融合的C-jun亮氨酸拉链氨基酸序列。<400>24Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn1 5 10 15Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln20 25 30Leu Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr35 40<210>25<211>40<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>与TCRβ链融合的C-fos亮氨酸拉链氨基酸序列。<400>25Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Glu Lys1 5 10 15Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys20 25 30Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr35 40<210>26<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于使人TCRβ链的未配对半胱氨酸突变成丝氨酸的正向PCR引物。<400>26gactccagat acagcctgag cagccg26<210>27<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>未配对半胱氨酸突变成丝氨酸后的人TCRβ链的氨基酸序列。<400>27Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Ser Ser1 5<210>28<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于使人TCRβ链的未配对半胱氨酸突变成丝氨酸的反向PCR引物。<400>28cggctgctca ggctgtatct ggagtc 26<210>29<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于使人TCRβ链的未配对半胱氨酸突变成丙氨酸的正向PCR引物。<400>29gactccagat acgctctgag cagccg 26<210>30<211>8<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述未配对半胱氨酸突变成丙氨酸后的人TCRβ链的氨基酸序列。<400>30Asp Ser Arg Tyr Ala Leu Ser Ser1 5<210>31<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于使人TCRβ链的未配对半胱氨酸突变成丙氨酸的反向PCR引物。<400>31cggctgctca gagcgtatct ggagtc 26<210>32<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于结合在JM22流感基质肽-HLA-A0201上的TCR的人Vα10.2链的5＇PCR引物。<400>32gctctagaca tatgcaacta ctagaacaaa gtcctcagtt tctaagcatc caagagg57<210>33<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>结合在人JM22流感基质肽-HLA-A0201上的TCR的截短的Vα10.2链的新型N-末端氨基酸序列。<400>33Met Gln Leu Leu Glu Gln Ser Pro Gln Phe Leu Ser Ile Gln Glu1 5 10 15<210>34<211>39<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于结合在JM22流感基质肽-HLA-A0201上的TCR的人Vβ17链的5＇PCR引物。<400>34gctctagaca tatggtggat ggtggaatca ctcagtccc 39<210>35<211>9<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述结合在JM22流感基质肽-HLA-A0201上的TCR的截短Vβ17链的新型N-末端氨基酸序列。<400>35Met Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser1 5<210>36<211>57<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述结合在流感核蛋白肽-H2Db上的TCR的鼠Vα4链的5＇PCR引物。<400>36gctctagaca tatggattct gttactcaaa tgcaaggtca agtgaccctc tcatcag57<210>37<211>15<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述结合在鼠流感核蛋白肽-H2-Db上的TCR的截短Vα4链的新型N-末端氨基酸序列。<400>37Met Asp Ser Val Thr Gln Met Gln Gly Gln Val Thr Leu Ser Ser1 5 10 15<210>38<211>53<212>DNA<213>小鼠<220><223>结合在流感核蛋白肽-H2Db上的TCR的鼠Vβ11链的5＇PCR引物。<400>38gctctagaca tatggaacca acaaatgctg gtgttatcca aacacctagg cac 53<210>39<211>14<212>PRT<213>小鼠<220><223>结合在流感核蛋白肽-H2-Db上的TCR的截短鼠Vβ11链的新型N-末端氨基酸序列。<400>39Met Glu Pro Thr Asn Ala Gly Val Ile Gln Thr Pro Arg His1 5 10<210>40<211>36<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>结合在003HIV-1 GAGag肽-HLA-A0201上的TCR的人Vα23链的5＇PCR引物。<400>40ggaattccat atgaaacaag aggttacaca aattcc 36<210>41<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>结合在003HIV-1 Gag肽-HLA-A0201上的TCR的截短人Vα23链的新型N-末端氨基酸序列。<400>41Met Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile1 5<210>42<211>36<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>结合在003HIV-1 Gag肽-HLA-A0201上的TCR的人Vβ5.1链的5＇PCR引物。<400>42ggaattccat atgaaagctg gagttactca aactcc 36<210>43<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>结合在003HIV-1 Gag肽-HLA-A0201上的TCR的截短人Vβ5.1链的新型N-末端氨基酸序列。<400>43Met Lys Ala Gly Val Thr Gln Thr1 5<210>44<211>33<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>结合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的A6 TCR的人Vα2.3链的5＇PCR引物。<400>44cccccccata tgcagaagga agtggagcag aac33<210>45<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>结合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的A6TCR的截短的人Vα2.3链的新型N-末端氨基酸序列。<400>45Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Lys1 5<210>46<211>33<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>结合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的A6 TCR的人Vβ12.3链的5＇PCR引物。<400>46cccccccata tgaacgctgg tgtcactcag acc33<210>47<211>8<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>结合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的A6 TCR的截短的人Vβ12.3链的新型N-末端氨基酸序列。<400>47Met Lys Ala Gly Val Thr Gln Thr1 5<210>48<211>48<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>结合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的B7 TCR的人Vα17.2链的5＇PCR引物。<400>48cccccccata tgcaacaaaa aaatgatgac cagcaagtta agcaaaat48<210>49<211>13<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>结合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的B7 TCR的截短的人Vα17.2链的新型N-末端氨基酸序列。<400>49Met Gln Gln Lys Asn Asp Asp Gln Gln Val Lys Gln Asn1 5 10<210>50<211>45<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>结合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的B7 TCR的人Vβ12.3链的5＇PCR引物。<400>50cccccccata tgaacgctgg tgtcactcag accccaaaat tccag 45<210>51<211>12<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>结合在HTLV-1 Tax肽-HLA-A0201上的B7 TCR的截短的人Vβ12.3链的新型N-末端氨基酸序列。<400>51Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln1 5 10<210>52<211>38<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>一般使用的人Cα链的3＇PCR引物。<400>52catacacccg ggggaacttt ctgggctggg gaagaagg 38<210>53<211>33<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>一般使用的人Cβ链的3＇PCR引物。<400>53catacacccg gggtctgctc taccccaggc ctc33<210>54<211>744<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>与人c-jun“亮氨酸拉链”结构域融合的来自JM22结合在可溶性HLA-A2/flu基质上的TCRα链的突变DNA序列。<400>54atgcaactac tagaacaaag tcctcagttt ctaagcatcc aagagggaga aaatctcact 60gtgtactgca actcctcaag tgttttttcc agcttacaat ggtacagaca ggagcctggg 120gaaggtcctg tcctcctggt gacagtagtt acgggtggag aagtgaagaa gctgaagaga 180ctaacctttc agtttggtga tgcaagaaag gacagttctc tccacatcac tgcggcccag 240cctggtgata caggcctcta cctctgtgca ggagcgggaa gccaaggaaa tctcatcttt 300ggaaaaggca ctaaactctc tgttaaacca aatatccaga accctgaccc tgccgtgtac 360cagctgagag actctaaatc cagtgacaag tctgtctgcc tattcaccga ttttgattct 420caaacaaatg tgtcacaaag taaggattct gatgtgtata tcacagacaa aactgtgcta 480gacatgaggt ctatggactt caagagcaac agtgctgtgg cctggagcaa caaatctgac 540tttgcatgtg caaacgcctt caacaacagc attattccag aagacacctt cttccccagc 600ccagaaagtt cccccggggg tagaatcgcc cggctggagg aaaaagtgaa aaccttgaaa 660gctcagaact cggagctggc gtccacggcc aacatgctca gggaacaggt ggcacagctt 720aaacagaaag tcatgaacta ctag 744<210>55<211>247<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>与c-jun的“亮氨酸拉链”结构域融合的来自JM22的结合在可溶性HLA-A2/flu基质上的α链的推定氨基酸序列。<400>55Met Gln Leu Leu Glu Gln Ser Pro Gln Phe Leu Ser Ile Gln Glu Gly1 5 10 15Glu Asn Leu Thr Val Tyr Cys Asn Ser Ser Ser Val Phe Ser Ser Leu20 25 30Gln Trp Tyr Arg Gln Glu Pro Gly Glu Gly Pro Val Leu Leu Val Thr35 40 45Val Val Thr Gly Gly Glu Val Lys Lys Leu Lys Arg Leu Thr Phe Gln50 55 60Phe Gly Asp Ala Arg Lys Asp Ser Ser Leu His Ile Thr Ala Ala Gln65 70 75 80Pro Gly Asp Thr Gly Leu Tyr Leu Cys Ala Gly Ala Gly Ser Gln Gly85 90 95Asn Leu Ile Phe Gly Lys Gly Thr Lys Leu Ser Val Lys Pro Asn Ile100 105 110Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser Ser115 120 125Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr Asn Val130 135 140Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr Val Leu145150 155 160Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val Ala Trp Ser165 170 175Asn Lys Ser Asp Phe Ala Cys Ala Asn Ala Phe Asn Asn Ser Ile Ile180 185 190Pro Glu Asp Thr Phe Phe Pro Ser Pro Glu Ser Ser Pro Gly Gly Arg195 200 205Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn Ser210 215 220Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln Leu225 230 235 240Lys Gln Lys Val Met Asn Tyr245<210>56<211>864<212>DNA<213>Homo sapiens<220><223>与c-fos“亮氨酸拉链”结构域融合的来自JM22结合在可溶性HLA-A2/flu上的TCRα链的DNA序列。<400>56atggtggatg gtggaatcac tcagtcccca aagtacctgt tcagaaagga aggacagaat 60gtgaccctga gttgtgaaca gaatttgaac cacgatgcca tgtactggta ccgacaggac 120ccagggcaag ggctgagatt gatctactac tcacagatag taaatgactt tcagaaagga 180gatatagctg aagggtacag cgtctctcgg gagaagaagg aatcctttcc tctcactgtg 240acatcggccc aaaagaaccc gacagctttc tatctctgtg ccagtagttc gaggagctcc 300tacgagcagt acttcgggcc gggcaccagg ctcacggtca cagaggacct gaaaaacgtt 360ttcccacccg aggtcgctgt gtttgaacca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc taccccgacc acgtggagct gagctggtgg 480gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agcacagacc cgcagcccct caaggagcag 540cccgccctca atgactccag atactgcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840gagttcatcc tggcagctta ctag 864<210>57<211>287<212>PRT<213>Homo sapiens<220><223>与c-fos“亮氨酸拉链”结构域融合的来自JM22的结合在可溶性HLA-A2/flu基质上的β链的推定氨基酸序列。<400>57Met Val Asp Gly Gly Ile Thr Gln Ser Pro Lys Tyr Leu Phe Arg Lys1 5 10 15Glu Gly Gln Asn Val Thr Leu Ser Cys Glu Gln Asn Leu Asn His Asp20 25 30Ala Met Tyr Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Gln Gly Leu Arg Leu Ile35 40 45Tyr Tyr Ser Gln Ile Val Asn Asp Phe Gln Lys Gly Asp Ile Ala Glu50 55 60Gly Tyr Ser Val Ser Arg Glu Lys Lys Glu Ser Phe Pro Leu Thr Val65 70 75 80Thr Ser Ala Gln Lys Asn Pro Thr Ala Phe Tyr Leu Cys Ala Ser Ser85 90 95Ser Arg Ser Ser Tyr Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg Leu Thr100 105 110Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe115 120 125Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val130 135 140Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp145 150 155 160Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro Gln Pro165 170 175Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Cys Leu Ser Ser180 185 190Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe195 200 205Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr210 215 220Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp225 230 235 240Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr245 250 255Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn260 265 270Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr275 280 285<210>58<211>795<212>DNA<213>人工序列<220><223>与c-jun“亮氨酸拉链”结构域融合的来自鼠F5受体的结合在可溶性H2-Db/流感病毒核蛋白上的TCRα链的DNA序列。<220><223>人工序列描述编码与人c-jun亮氨酸拉链结构域融合的截短的鼠F5 TCRα链的融合基因。<400>58atgaactatt ctccagcttt agtgactgtg atgctgtttg tgtttgggag gacccatgga 60gactcagtaa cccagatgca aggtcaagtg accctctcag aagacgactt cctatttata 120aactgtactt attcaaccac atggtacccg actcttttct ggtatgtcca atatcctgga 180gaaggtccac agctcctttt gaaagtcaca acagccaaca acaagggaat cagcagaggt 240tttgaagcta catatgataa aggaacaacg tccttccact tgcagaaagc ctcagtgcag 300gagtcagact ctgctgtgta ctactgtgtg ctgggtgatc gacagggagg cagagctctg 360atatttggaa caggaaccac ggtatcagtc agccccaaca tccagaaccc agaacctgct 420gtgtaccagt taaaagatcc tcggtctcag gacagcaccc tctgcctgtt caccgacttt 480gactcccaaa tcaatgtgcc gaaaaccatg gaatctggaa cgttcatcac tgacaaaact 540gtgctggaca tgaaagctat ggattccaag agcaatgggg ccattgcctg gagcaaccag 600acaagcttca cctgccaaga tatctccaaa gagaccaacg ccacctaccc cagttcagac 660gttcccgggg gtagaatcgc ccggctggag gaaaaagtga aaaccttgaa agctcagaac 720tcggagctgg cgtccacggc caacatgctc agggaacagg tggcacagct taaacagaaa 780gtcatgaact actag 795<210>59<211>264<212>PRT<213>人工序列<220><223>与c-jun“亮氨酸拉链”结构域融合的来自鼠F5受体的结合在可溶性H2-Db/流感病毒核蛋白上的α链的推定氨基酸序列。<220><223>人工序列描述由与人c-jun亮氨酸拉链结构域融合的截短的鼠F5 TCRα链组成的融合蛋白。<400>59Met Asn Tyr Ser Pro Ala Leu Val Thr Val Met Leu Phe Val Phe Gly1 5 10 15Arg Thr His Gly Asp Ser Val Thr Gln Met Gln Gly Gln Val Thr Leu20 25 30Ser Glu Asp Asp Phe Leu Phe Ile Asn Cys Thr Tyr Ser Thr Thr Trp35 40 45Tyr Pro Thr Leu Phe Trp Tyr Val Gln Tyr Pro Gly Glu Gly Pro Gln50 55 60Leu Leu Leu Lys Val Thr Thr Ala Asn Asn Lys Gly Ile Ser Arg Gly65 70 75 80Phe Glu Ala Thr Tyr Asp Lys Gly Thr Thr Ser Phe His Leu Gln Lys85 90 95Ala Ser Val Gln Glu Ser Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Val Leu Gly100 105 110Asp Arg Gln Gly Gly Arg Ala Leu Ile Phe Gly Thr Gly Thr Thr Val115 120 125Ser Val Ser Pro Asn Ile Gln Asn Pro Glu Pro Ala Val Tyr Gln Leu130 135 140Lys Asp Pro Arg Ser Gln Asp Ser Thr Leu Cys Leu Phe Thr Asp Phe145 150 155 160Asp Ser Gln Ile Asn Val Pro Lys Thr Met Glu Ser Gly Thr Phe Ile165 170 175Thr Asp Lys Thr Val Leu Asp Met Lys Ala Met Asp Ser Lys Ser Asn180 185 190Gly Ala Ile Ala Trp Ser Asn Gln Thr Ser Phe Thr Cys Gln Asp Ile195 200 205Ser Lys Glu Thr Asn Ala Thr Tyr Pro Ser Ser Asp Val Pro Gly Gly210 215 220Arg Ile Ala Arg Leu Glu Glu Lys Val Lys Thr Leu Lys Ala Gln Asn225 230 235 240Ser Glu Leu Ala Ser Thr Ala Asn Met Leu Arg Glu Gln Val Ala Gln245 250 255Leu Lys Gln Lys Val Met Asn TVr260<210>60<211>864<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述与c-fos亮氨酸拉链结构域融合的来自鼠F5受体的结合在可溶性H2-Db/流感病毒核蛋白上的TCRβ链的DNA序列。<400>60atgaaagctg gagttactca aactccaaga tatctgatca aaacgagagg acagcaagtg 60acactgagct gctcccctat ctctgggcat aggagtgtat cctggtacca acagacccca 120ggacagggcc ttcagttcct ctttgaatac ttcagtgaga cacagagaaa caaaggaaac 180ttccctggtc gattctcagg gcgccagttc tctaactctc gctctgagat gaatgtgagc 240accttggagc tgggggactc ggccctttat ctttgcgcca gcagcttcga cagcgggaat 300tcacccctcc actttgggaa cgggaccagg ctcactgtga cagaggacct gaacaaggtg 360ttcccacccg aggtcgctgt gtttgagcca tcagaagcag agatctccca cacccaaaag 420gccacactgg tgtgcctggc cacaggcttc ttccctgacc acgtggagct gagctggtgg 480gtgaatggga aggaggtgca cagtggggtc agccaggacc cgcagcccct caaggagcag 540cccgccctca atgactccag atacagcctg agcagccgcc tgagggtctc ggccaccttc 600tggcagaacc cccgcaacca cttccgctgt caagtccagt tctacgggct ctcggagaat 660gacgagtgga cccaggatag ggccaaacct gtcacccaga tcgtcagcgc cgaggcctgg 720ggtagagcag accccggggg tctgactgat acactccaag cggagacaga tcaacttgaa 780gacaagaagt ctgcgttgca gaccgagatt gccaatctac tgaaagagaa ggaaaaacta 840gagttcatcc tggcagctta ctag 864<210>61<211>287<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述与c-fos亮氨酸拉链结构域融合的来自鼠F5受体的结合在可溶性H2-Db/流感病毒核蛋白上的TCRβ链的氨基酸序列。
<400>61Met Lys Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Arg Tyr LeuIle Lys Thr Arg1 5 10 15Gly Gln Gln Val Thr Leu Ser Cys Ser Pro Ile Ser Gly His Arg Ser20 25 30Val Ser Trp Tyr Gln Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Gln Phe Leu Phe35 40 45Glu Tyr Phe Ser Glu Thr Gln Arg Asn Lys Gly Asn Phe Pro Gly Arg50 55 60Phe Ser Gly Arg Gln Phe Ser Asn Ser Arg Ser Glu Met Asn Val Ser65 70 75 80Thr Leu Glu Leu Gly Asp Ser Ala Leu Tyr Leu Cys Ala Ser Ser Phe85 90 95Asp Ser Gly Asn Ser Pro Leu His Phe Gly Asn Gly Thr Arg Leu Thr100 105 110Val Thr Glu Asp Leu Asn Lys Val Phe Pro Pro Glu Val Ala Val Phe115 120 125Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr Leu Val130 135 140Cys Leu Ala Thr Gly Phe Phe Pro Asp His Val Glu Leu Ser Trp Trp145 150 155 160Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Gln Asp Pro Gln Pro165 170 175Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ser Leu Ser Ser180 185 190Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asn Pro Arg Asn His Phe195 200 205Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu Trp Thr210 215 220Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu Ala Trp225 230 235 240Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr245 250 255Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn260 265 270Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu PheIle Leu Ala Ala Tyr275 280285<210>62<211>747<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述与c-jun亮氨酸拉链结构域融合的来自患者003的结合在可溶性HLA-A2/HIV-1 Gag上的TCRα链的DNA序列。<400>62atgaaacaag aagttacaca gattcctgca gctctgagtg tcccagaagg agaaaacttg 60gttctcaact gcagtttcac tgatagcgct atttacaacc tccagtggtt taggcaggac 120cctgggaaag gtctcacatc tctgttgctt attcagtcaa gtcagagaga gcaaacaagt 180ggaagactta atgcctcgct ggataaatca tcaggacgta gtactttata cattgcagct 240tctcagcctg gtgactcagc cacctacctc tgtgctgtga ccaacttcaa caaattttac 300tttggatctg ggaccaaact caatgtaaaa ccaaatatcc agaaccctga ccctgccgtg 360taccagctga gagactctaa atccagtgac aagtctgtct gcctattcac cgattttgat 420tctcaaacaa atgtgtcaca aagtaaggat tctgatgtgt atatcacaga caaaactgtg 480ctagacatga ggtctatgga cttcaagagc aacagtgctg tggcctggag caacaaatct 540gactttgcat gtgcaaacgc cttcaacaac agcattattc cagaagacac cttcttcccc 600agcccagaaa gttcccccgg gggtagaatc gcccggctgg aggaaaaagt gaaaaccttg 660aaagctcaga actcggagct ggcgtccacg gccaacatgc tcagggaaca ggtggcacag 720cttaaacaga aagtcatgaa ctactag 747<210>63<211>248<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述与c-jun亮氨酸拉链结构域融合的来自患者003的结合在可溶性HLA-A2/HIV-1 Gag上的TCRα链的氨基酸序列。<400>63Met Lys Gln Glu Val Thr Gln Ile Pro Ala Ala Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Glu Asn Leu Val Leu Asn Cys Ser Phe Thr Asp Ser Ala Ile Tyr20 25 30Asn Leu Gln Trp Phe Arg Gln Asp Pro Gly Lys Gly Leu Thr Ser Leu35 40 45Leu Leu Ile Gln Ser Ser Gln Arg Glu Gln Thr Ser Gly Arg Leu Asn50 55 60Ala Ser Leu Asp Lys Ser Ser Gly Arg Ser Thr Leu Tyr Ile Ala Ala65 70 75 80Ser Gln Pro Gly Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Asn Phe85 90 95Asn Lys Phe Tyr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Asn Val Lys Pro Asn100 105 110Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys Ser115 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agaactcgga gctggcgtcc acggccaaca tgctcaggga acaggtggca 720cagcttaaac agaaagtcat gaactactag750<210>67<211>249<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述与c-jun亮氨酸拉链结构域融合的来自克隆A6的结合在可溶性HLA-A2/HTLV-1 Tax上的TCRα链的氨基酸序列。<400>67Met Gln Lys Glu Val Glu Gln Asn Ser Gly Pro Leu Ser Val Pro Glu1 5 10 15Gly Ala Ile Ala Ser Leu Asn Cys Thr Tyr Ser Asp Arg Gly Ser Gln20 25 30Ser Phe Phe Trp Tyr Arg Gln Tyr Ser Gly Lys Ser Pro Glu Leu Ile35 40 45Met Ser Ile Tyr Ser Asn Gly Asp Lys Glu Asp Gly Arg Phe Thr Ala50 55 60Gln Leu Asn Lys Ala Ser Gln Tyr Val Ser Leu Leu Ile Arg Asp Ser65 70 75 80Gln Pro Ser Asp Ser Ala Thr Tyr Leu Cys Ala Val Thr Thr Asp Ser85 90 95Trp Gly Lys Leu Gln Phe Gly Ala Gly Thr Gln Val Val Val Thr Pro100 105 110Asp Ile Gln Asn Pro Asp Pro Ala Val Tyr Gln Leu Arg Asp Ser Lys115 120 125Ser Ser Asp Lys Ser Val Cys Leu Phe Thr Asp Phe Asp Ser Gln Thr130 135 140Asn Val Ser Gln Ser Lys Asp Ser Asp Val Tyr Ile Thr Asp Lys Thr145 150 155 160Val Leu Asp Met Arg Ser Met Asp Phe Lys Ser Asn Ser Ala Val 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cgggctctcg 660gagaatgacg agtggaccca ggatagggcc aaacctgtca cccagatcgt cagcgccgag 720gcctggggta gagcagaccc cgggggtctg actgatacac tccaagcgga gacagatcaa 780cttgaagaca agaagtctgc gttgcagacc gagattgcca atctactgaa agagaaggaa 840aaactagagt tcatcctggc agcttacgga tccggtggtg gtctgaacga tatttttgaa 900gctcagaaaa tcgaatggca ttaagctt 928<210>75<211>307<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述与c-fos亮氨酸拉链结构域和BirA生物素化标记融合的来自克隆A6的结合在突变的可溶性HLA-A2/HTLV-1 Tax上的TCRβ链的氨基酸序列。<400>75Met Asn Ala Gly Val Thr Gln Thr Pro Lys Phe Gln Val Leu Lys Thr1 5 10 15Gly Gln Ser Met Thr Leu Gln Cys Ala Gln Asp Met Asn His Glu Tyr20 25 30Met Ser Trp Tyr Arg Gln Asp Pro Gly Met Gly Leu Arg Leu Ile His35 40 45Tyr Ser Val Gly Ala Gly Ile Thr Asp Gln Gly Glu Val Pro Asn Gly50 55 60Tyr Asn Val Ser Arg Ser Thr Thr Glu Asp Phe Pro Leu Arg Leu Leu65 70 75 80Ser Ala Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Tyr Phe Cys Ala Ser Arg Pro85 90 95Gly Leu Ala Gly Gly Arg Pro Glu Gln Tyr Phe Gly Pro Gly Thr Arg100 105 110Leu Thr Val Thr Glu Asp Leu Lys Asn Val Phe Pro Pro Glu Val Ala115 120 125Val Phe Glu Pro Ser Glu Ala Glu Ile Ser His Thr Gln Lys Ala Thr130 135 140Leu Val Cys Leu Ala Thr Gly Phe Tyr Pro Asp His Val Glu Leu Ser145 150 155 160Trp Trp Val Asn Gly Lys Glu Val His Ser Gly Val Ser Thr Asp Pro165 170 175Gln Pro Leu Lys Glu Gln Pro Ala Leu Asn Asp Ser Arg Tyr Ala Leu180 185 190Ser Ser Arg Leu Arg Val Ser Ala Thr Phe Trp Gln Asp Pro Arg Asn195 200 205His Phe Arg Cys Gln Val Gln Phe Tyr Gly Leu Ser Glu Asn Asp Glu210 215 220Trp Thr Gln Asp Arg Ala Lys Pro Val Thr Gln Ile Val Ser Ala Glu225 230 235 240Ala Trp Gly Arg Ala Asp Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala245 250 255Glu Thr Asp Gln Leu Glu Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile260 265 270Ala Asn Leu Leu Lys Glu Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala275 280 285Tyr Gly Ser Gly Gly Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile290 295 300Glu Trp His305<210>76<211>190<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于TCRβ链的c-fos-BirA生物素化标记融合配偶体的DNA序列。<400>76cccgggggtc tgactgatac actccaagcg gagacagatc aacttgaaga caagaagtct 60gcgttgcaga ccgagattgc caatctactg aaagagaagg aaaaactaga gttcatcctg 120gcagcttacg gatccggtgg tggtctgaac gatatttttg aagctcagaa aatcgaatgg 180cattaagctt 190<210>77<211>61<212>PRT<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于TCRβ链的c-fos-BirA生物素化标记融合配偶体的氨基酸序列。<400>77Pro Gly Gly Leu Thr Asp Thr Leu Gln Ala Glu Thr Asp Gln Leu Glu1 5 10 15Asp Lys Lys Ser Ala Leu Gln Thr Glu Ile Ala Asn Leu Leu Lys Glu20 25 30Lys Glu Lys Leu Glu Phe Ile Leu Ala Ala Tyr Gly Ser Gly Gly Gly35 40 45Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His50 55 60<210>78<211>42<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于结合在流感基质肽/HLA-A0201上的人JM22TCR融合基质的V-β-c-fos亮氨酸拉链片段PCR扩增的反向引物。<400>78acacacggat ccgtaagctg cgacgatgaa ctcgattttc tt 42<210>79<211>90<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR扩增与Bir生物素化标记融合的人JM22TCR的Vβ17链的引物。<400>79gggggaagct taatgccatt cgattttctg agcttcaaaa atatcgttca gaccaccacc 60ggatccgtaa gctgccagga tgaactctag 90<210>80<211>37<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述用于PCR扩增与Bir生物素化标记融合的人JM22TCR的Vβ17链的引物。<400>80gctctagaca tatgggccca gtggattctg gagtcac37<210>81<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷病毒<220><223>来源于HIV-1Pol蛋白质并作为肽抗原由HLA-A0201呈递的肽。<400>81Ile Leu Lys Glu Pro Val His G1y Val1 5<210>82<211>9<212>PRT<213>人T-细胞嗜淋巴细胞1型病毒<220><223>来源于HTLV-1 Tax蛋白质并作为肽抗原由HLA-A0201呈递的肽。这种HLA/肽结合物结合A6和B7 TCRs。<400>82Leu Leu Phe Gly Tyr Pro Val Tyr Val1 5<210>83<211>9<212>PRT<213>流感病毒<220><223>来源于流感病毒核蛋白并作为肽抗原由鼠H2-Db呈递的肽。这种HLA/肽结合物结合鼠F5TCR。<400>83Ala Ser Asn G1u Asn Met Asp A1a Met1 S<210>84<211>9<212>PRT<213>人免疫缺陷1型病毒<220><223>来源于HIV-1 Gag蛋白质并作为肽抗原由HLA-A0201呈递的肽，这种HLA/肽结合物结合来自病人003的克隆的TCR。<400>84Gly Ile Leu Gly Phe Val Phe Thr Leu1 5<210>85<211>9<212>PRT<213>流感病毒<220><223>来源于流感病毒基质蛋白质并作为肽抗原由HLA-A0201呈递的肽。这种HLA/肽结合物结合JM22TCR。<400>85Ser Leu Tyr Asn Thr Val Ala Thr Leu1 权利要求
1.一种用于结合MHC-肽复合物的合成的多价T细胞受体(TCR)复合物，该TCR复合物含有多个对MHC-肽复合物具有特异性的T细胞受体。
2.根据权利要求1所述的TCR复合物，其中所述的T细胞受体是具有α链和β链的αβT细胞受体。
3.根据权利要求2所述的TCR复合物，其中所述的α链和β链是T细胞受体的α链和β链的可溶形式。
4.根据上述任意一项权利要求所述的TCR复合物，其中所述的T细胞受体是两个或多个T细胞受体的多聚体形式。
5.根据权利要求4所述的TCR复合物，其中所述的多聚体是三聚体或四聚体。
6.根据上述任意一项权利要求所述的TCR复合物，其中所述的T细胞受体通过接头分子彼此连接。
7.根据权利要求6所述的TCR复合物，其中所述的接头分子是多价结合分子诸如抗生物素蛋白、链霉抗生物素或外抗生物素蛋白。
8.根据权利要求7所述的TCR复合物，其中T细胞受体的α或β链中的至少一种来源于含有用于修饰诸如生物素这样的酶的氨基酸识别序列的融合蛋白。
9.根据权利要求8所述的TCR复合物，其中所述的T细胞受体是生物素化的。
10.根据上述任意一项权利要求所述的TCR复合物，它包括具有比非多聚化T细胞受体异二聚体增强的结合能力的多聚化重组T细胞受体异二聚体。
11.一种多价TCR复合物，它包括具有比非多聚化T细胞受体异二聚体增强的结合能力的多聚化重组T细胞受体异二聚体。
12.根据上述任意一项权利要求所述的TCR复合物，其中所述的T细胞受体是重折叠的重组T细胞受体，它包括i)具有第一种异源C-末端二聚化肽的重组T细胞受体α或γ链胞外域；和ii)具有与第一种二聚化肽特异性异二聚化以便形成异二聚化结构域的第二种C-末端二聚化肽的重组T细胞受体β或δ链胞外域。
13.根据权利要求12所述的TCR复合物，其中存在于邻近胞质结构域的α与β或γ与δ链之间的天然T细胞受体中的二硫键从重组T细胞受体中缺失。
14.根据权利要求12或权利要求13所述的TCR复合物，其中所述的异二聚化结构域是卷曲螺旋结构域。
15.根据权利要求14所述的TCR复合物，其中所述的二聚化肽类是c-jun和c-fos二聚化肽类。
16.根据权利要求12-15中任意一项所述的TCR复合物，它包括位于T细胞受体链与异二聚化肽类之间的柔性接头。
17.根据权利要求10-16中任意一项所述的TCR复合物，其中在大肠杆菌表达系统中表达所述的T细胞受体。
18.根据权利要求10-17中任意一项所述的TCR复合物，其中使所述的T细胞受体在C-末端生物素化。
19.根据上述任意一项权利要求所述的TCR复合物，其中所述的T细胞受体与脂双层结合。
20.根据权利要求19所述的TCR复合物，其中所述的脂双层形成囊泡。
21.根据权利要求20所述的TCR复合物，其中所述的T细胞受体结合在所述囊泡的外部。
22.根据权利要求20或权利要求21所述的TCR复合物，其中所述的T细胞受体通过所述囊泡中衍生的脂类成分与所述囊泡结合。
23.根据权利要求19或权利要求20所述的TCR复合物，其中所述的T细胞受体被包埋在所述的脂双层中。
24.根据权利要求1-18中任意一项所述的TCR复合物，其中所述的T细胞受体与一种颗粒结合。
25.根据上述任意一项权利要求所述的TCR复合物，它进一步包括一种可检测标记。
26.根据上述任意一项权利要求所述的TCR复合物，它进一步包括一种治疗剂诸如细胞毒性剂或免疫刺激剂。
27.根据上述任意一项权利要求所述的TCR复合物，它以一种药物上可接受的制剂的形式在体内应用。
28.一种用于检测MHC-肽的方法，该方法包括下列步骤(i)提供(a)一种含有多个T细胞受体的合成的多价T细胞受体复合物和/或(b)一种含有具有比非多聚T细胞异二聚体增强的结合能力的多聚化重组T细胞受体异二聚体的合成多价T细胞受体复合物，所述的T细胞受体对MHC-肽复合物具有特异性；(ii)使所述的多价TCR复合物与MHC-肽复合物接触；并且(iii)检测所述的多价TCR复合物与MHC-肽复合物的结合情况。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述的多价TCR复合物中含有可检测标记。
30.根据权利要求28或权利要求29所述的方法，该方法用于检测呈递特异性肽抗原的细胞。
31.根据权利要求28-30中任意一项所述的方法，其中所述的多价TCR复合物是权利要求1-27中任意一项所述的多价TCR复合物。
32.一种用于将治疗剂传送至靶细胞的方法，该方法包括下列步骤(i)提供(a)一种含有多个T细胞受体的合成的多价TCR复合物和/或(b)一种含有具有比非多聚T细胞异二聚体增强的结合能力的多聚化重组T细胞受体异二聚体的合成多价TCR复合物，所述的T细胞受体对MHC-肽复合物具有特异性且所述的多价TCR复合物中含有与之连接的治疗剂；(ii)在使T细胞受体与靶细胞结合的条件下使所述的多价TCR复合物与可能的靶细胞接触。
33.根据权利要求32的方法，其中所述的多价TCR复合物是权利要求1-27中任意一项所述的多价TCR复合物。
全文摘要
本发明涉及一种用于与MHC－肽复合物结合的合成性多价T细胞受体复合物,该多价T细胞受体复合物包括多个特异于MHC－肽复合物的T细胞受体。优选的是T细胞受体是重折叠的重组可溶性T细胞受体。合成性多价T细胞受体复合物可用于传递治疗剂或检测MHC－肽复合物。本发明还提供了这样的使用方法。
文档编号A61K47/48GK1308674SQ9980847
公开日2001年8月15日 申请日期1999年5月19日 优先权日1998年5月19日
发明者B·K·雅各布森, J·M·博尔特 申请人:阿维德克斯有限公司