一株铜绿假单胞菌及其在降解黄曲霉毒素方面的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一株铜绿假单胞菌及其在降解黄曲霉毒素方面的应用。本发明公开的一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas?aeruginosa），其保藏编号为CGMCC?No.8511。本发明公开的铜绿假单胞菌可高效降解黄曲霉毒素，该菌作为黄曲霉毒素降解的生物材料，无论在开发新的生物降解菌剂或者生物降解无菌制剂方面都具有很好的应用前景。
【专利说明】一株铜绿假单胞菌及其在降解黄曲霉毒素方面的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株铜绿假单胞菌及其在降解黄曲霉毒素方面的应用。
【背景技术】
[0002]黄曲霉毒素(Aflatoxin,AFT)是一类主要由黄曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(A.parasiticus)真菌产生的有毒次级代谢产物，具有致癌、致畸、致细胞突变的作用，仅0.294mg/kg剂量就能引起敏感动物的急性中毒死亡(Bondy and Pestka, 2000 ；ffang etal.,2002 ；Rawal, et al.，2010)，其主要的作用靶标是肝脏，是诱发恶性肿瘤原发性肝细胞癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)的主要因素之一，此外还可以引起肾脏和肾上腺的急性病变(Poirier et al., 2000 ；Kensler et al.,2011)。
[0003]黄曲霉毒素的基本结构是二呋喃环和氧杂萘邻酮(香豆素)，前者为基本毒性结构，后者有加强毒性及致癌作用。目前已发现的黄曲霉毒素约有20种，在紫外光下发蓝色光(Blue)的为B族(黄曲霉毒素B1和B2),发绿光(Green)的为G族(黄曲霉毒素G1和G2)。黄曲霉毒素M1是黄曲霉毒素B1 (AFB1)的羟基化衍生物。其中AFB1分布最广、含量最高、毒性最强，其毒性是氰化钾的10倍、砒霜的68倍。
[0004]传统的黄曲霉毒素去毒方法有物理和化学方法，包括氨化法、碱法、高温法、射线辐照法及超滤-渗滤法等，这些方法存在效果不稳定、营养成分损失大、降解产物复杂、降解产物毒性难以确定，以及难以规模化生产等缺点；此外，吸附法在吸附毒素的同时也会吸附营养成分。生物法是利用微生物及其分泌的酶等代谢产物降解黄曲霉毒素的方法，生物法具有效率高、特异性强以及对食品、饲料和环境没有污染的特点，是黄曲霉毒素降解的方向。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一株铜绿假单胞菌及其在降解黄曲霉毒素方面的应用。
[0006]本发明提供的一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),其保藏编号为CGMCC N0.8511。
[0007]—种降解黄曲霉毒素的方法也属于本发明的保护范围，包括如下步骤:用所述的铜绿假单胞菌对黄曲霉毒素进行降解处理。
[0008]上述方法中，所述降解处理的方式为将所述铜绿假单胞菌的菌悬液和/或发酵液和/或代谢产物与含有黄曲霉毒素的样品和/或产品混合；
[0009]所述含有黄曲霉毒素的样品和/或产品具体为含有黄曲霉毒素的农产品加工原料、饲料、食品及环境样品和/或产品。
[0010]上述任一所述的方法中，所述黄曲霉毒素为B族黄曲霉毒素、B族黄曲霉毒素的衍生物和/或G族黄曲霉毒素。
[0011]上述任一所述的方法中，所述B族黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1或黄曲霉毒素B2 ；
[0012]所述G族黄曲霉毒素为黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素G2 ；[0013]所述B族黄曲霉毒素的衍生物为黄曲霉毒素Mp
[0014]上述铜绿假单胞菌和/或其菌悬液和/或发酵液和/或代谢产物在制备降解黄曲霉毒素的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
[0015]上述铜绿假单胞菌和/或其菌悬液和/或发酵液和/或代谢产物在降解黄曲霉毒素中的应用也属于本发明的保护范围。
[0016]上述任一所述的应用中，所述黄曲霉毒素为B族黄曲霉毒素、B族黄曲霉毒素的衍生物和/或G族黄曲霉毒素。
[0017]上述任一所述的应用中，所述B族黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1或黄曲霉毒素B2 ；
[0018]所述G族黄曲霉毒素为黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素G2 ；
[0019]所述B族黄曲霉毒素的衍生物为黄曲霉毒素Mp
[0020]本发明提供的铜绿假单胞菌可高效降解黄曲霉毒素，该菌作为黄曲霉毒素降解的生物材料，无论在开发新的生物降解菌剂还是生物降解无菌制剂方面都具有很好的应用前
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【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1为黄曲霉毒素B1降解效果液相色谱图。
[0022]图2为黄曲霉毒素B2降解效果液相色谱图。
`[0023]图3为黄曲霉毒素G1降解效果液相色谱图。
[0024]图4为黄曲霉毒素G2降解效果液相色谱图。
[0025]图5为黄曲霉毒素M1降解效果液相色谱图。
【具体实施方式】
[0026]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0027]下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028]下述实施例中的定量试验均重复三次，结果取平均值。
[0029]NB液体培养基:由溶剂和溶质组成；溶质为蛋白胨、牛肉膏和NaCl，溶剂为水；蛋白胨在所述NB液体培养基中的浓度为lg/100ml，牛肉膏在所述NB液体培养基中的浓度为
0.3g/100ml, NaCl在所述NB液体培养基中的浓度为0.5g/100ml。
[0030]NA固体培养基:在NB液体培养基中加入琼脂(琼脂与NB液体培养基的比例为
1.5g: 100ml)，得到NA固体培养基。
[0031]实施例1、菌的分离与鉴定
[0032]一、菌的分离
[0033](一)2013年6月，在超净工作台中，将米集的土壤样品放在无囷蒸懼水中震汤15分钟制备菌悬液，摇床转速为180rpm。
[0034](二)将菌悬液用无菌蒸馏水进行梯度稀释后涂布在NA培养基平板上，30°C条件下培养24小时，菌落布满整个平板，用接种环挑取平板上形态、大小、颜色、透明度不同的菌株平板划线纯化，点接纯化后的菌株应用于黄曲霉毒素降解实验，将得到的黄曲霉毒素降解能力最强的一株菌，将其命名为N17-1。
[0035]二、鉴定[0036](一)按照“伯杰细菌鉴定手册”(第八版)和“常见细菌系统鉴定手册”(东秀珠，蔡妙英等编著，北京:科学出版社，2001.2)中描述的方法，对菌株N17-1进行形态特征和生理生化特性鉴定，具体结果如下:
[0037]菌体的形态和生理生化特性:
[0038]呈杆状；革兰氏阴性；硝酸还原:+ ;接触酶:+ ;酪素水解:+ ;氧化酶:+ ;淀粉水解:-；4%NaCl生长:+ ;柠檬酸利用:+ ;精氨酸双水解酶:+ ;喷哚产生:-;色氨酸脱氢酶:_ ；H2S产生:-;脲酶:+ ；VP实验:-;赖氨酸脱酸酶:_。
[0039]Biolog GEN III生长实验表明，菌株N17-1可以利用β -羟基_D，L-丁酸、甘氨酸-L-脯氨酸、N-乙酰-D-葡糖胺、a -D-葡萄糖、D-果糖、D-岩藻糖、肌苷、D-甘露醇、D-阿糖醇、甘油、D-果糖-6-磷酸、明胶、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-组氨酸、L-焦谷氨酸、D-葡糖酸、D-葡萄糖醛酸、葡糖醛酰胺、奎宁酸、P-羟基苯乙酸、丙酮酸甲酯、L-乳酸、柠檬酸、α-酮戊二酸、L-苹果酸、吐温40、Y-氨基丁酸、丙酸和乙酸。
[0040]Biolog GEN III 化学敏感实验表明，菌株 Ν17-1 对 ρΗ6.0、pH5.0、4%NaCl、二甲胺四环素、1%乳酸钠、夫西地酸、D-丝氨酸、醋竹桃霉素、利福霉素SV、林可霉素、盐酸胍、十四烷基硫酸钠、万古霉素、四唑紫、萘啶酸、亚碲酸钾、氨曲南、丁酸钠、四唑蓝等所测定条件不敏感。
[0041](二)16SrDNA 试验
[0042]提取N17-1的总DNA，以其为模板，利用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1.4kb的扩增产物，将扩增产物回收并进行测序，测得的序列如SEQ IDN0.1所
/Jn ο
[0043]根据Gen-Bank 序列同源性比较，菌株 N17-1 与 Pseudomonas sp.KGS (GenBank 登录号 JQ328193.1)同源性为 99%,与 Pseudomonas aeruginosa strain zgkd2 (GenBank 登录号HM030992.1)同源性为99%，初步判定该菌为假单胞菌属细菌(Pseudomonas sp.)。
[0044](三)gyrB实验
[0045]提取N17-1的总DNA，以其为模板，利用细菌gyrB通用引物进行PCR扩增，得到长度约为1.0kb的扩增产物，将扩增产物回收并进行测序，测得的序列如SEQ ID N0.2所示。
[0046]根据Gen-Bank 序列同源性比较，菌株 N17-1 与 Pseudomonas aeruginosa strainM18 (GenBank 登录号 CP002496.1)同源性为 99%。
[0047]基于以上特征,将菌株N17-1鉴定为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。该菌株已于2013年11月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCCjia:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为 CGMCC N0.8511。
[0048]实施例2、铜绿假单胞菌N17-1的培养
[0049]将铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa) N17-1 (CGMCC N0.8511)接种于液体NB培养基中，在温度为37°C和转速为200rpm (旋转半径20mm)的条件下振荡培养24h，得到菌液，用于黄曲霉毒素降解实验。
[0050]实施例3、铜绿假单胞菌N17-1对黄曲霉毒素B1的降解作用
[0051]一、黄曲霉毒素B1的配制
[0052]将Img黄曲霉毒素B1 (AFB1)标准品溶解于2ml色谱纯甲醇中获得浓度为500ppb的黄曲霉毒素B1溶液
[0053]二、取0.4ml实施例2得到的菌液置于1.5ml离心管中，加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素B1至其终浓度为lOOppb，充分混匀后37°C静置72h后，1000Og离心IOmin去除细胞，得上清，记作实验组溶液。以0.4ml不接菌的NB培养基加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素B1作为对照组，记作对照组溶液。
[0054]三、N17-1对黄曲霉毒素B1的降解效果检测
[0055]首先加入100%的甲醇到实验组溶液或对照组溶液(体积比6: 4)分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组溶液和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取(方法参照免疫亲和柱使用说明书)，最后用HPLC(柱后光化学衍生)对净化提取得到的样品进行检测，同时对黄曲霉毒素B2、G1和G2的混合标准品进行HPLC分析。
[0056]HPLC检测条件为流动相甲醇:水=1:1(体积比)；流速lml/min ;色谱柱C18(150mmX4.6mm,0.5 μ m);激发波长 350nm，检测波长 450nm ;柱温:30°C ;进样量 20 μl。
[0057]AFB1降解率(％)=(对照组AFBl含量-实验组AFB1含量)/对照组AFB1含量X 100。
[0058]结果如图1和表1所示。
[0059]图1中，A:黄曲霉毒素BpByG1和G2的混合标准品；Β:对照组；C:实验组。
[0060]结果表明，N17-1对黄曲霉毒素B1有较好的降解效果，降解率为82.84%。
[0061]实施例4、铜绿假单胞菌N17-1对黄曲霉毒素B2的降解作用
[0062]一、黄曲霉毒素B2的配制
[0063]将Img黄曲霉毒素B2 (AFB2)标准品溶解于2ml色谱纯甲醇中获得浓度为500ppb的黄曲霉毒素B2溶液
[0064]二、取0.4ml实施例2得到的菌液置于1.5ml离心管中，加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素B2至其终浓度为lOOppb，充分混匀后37°C静置72h后，1000Og离心IOmin去除细胞，得上清，记作实验组溶液。以0.4ml不接菌的NB培养基加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素B2作为对照组，记作对照组溶液。
[0065]三、N17-1对黄曲霉毒素B2的降解效果检测
[0066]首先加入100%的甲醇到实验组溶液或对照组溶液(体积比6: 4)分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组溶液和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取(方法参照免疫亲和柱使用说明书)，最后用HPLC(柱后光化学衍生)对净化提取得到的样品进行检测，同时对黄曲霉毒素B2、G1和G2的混合标准品进行HPLC分析。
[0067]HPLC检测条件为流动相甲醇:水=1:1 (体积比)；流速lml/min ;色谱柱C18(150mmX4.6mm,0.5 μ m);激发波长 350nm，检测波长 450nm ;柱温:30°C ;进样量 20 μl。
[0068]AFB2降解率(％)=(对照组AFB2含量-实验组AFB2含量)/对照组AFB2含量X 100。
[0069]结果如图2和表1所示。
[0070]图2中，A:黄曲霉毒素BpByG1和G2的混合标准品；Β:对照组；C:实验组。
[0071]结果表明，N17-1对黄曲霉毒素B2有一定的降解效果，降解率为46.77%。
[0072]实施例5、铜绿假单胞菌N17-1对黄曲霉毒素G1的降解作用
[0073]一、黄曲霉毒素G1的配制
[0074]将1mg黄曲霉毒素G1 (AFG1)标准品溶解于2ml色谱纯甲醇中获得浓度为500ppb的黄曲霉毒素G1溶液[0075]二、取0.4ml实施例2得到的菌液置于1.5ml离心管中，加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素G1至其终浓度为lOOppb，充分混匀后37°C静置72h后，1000Og离心IOmin去除细胞，得上清，记作实验组溶液。以0.4ml不接菌的NB培养基加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素G1作为对照组，记作对照组溶液。
[0076]三、N17-1对黄曲霉毒素G1的降解效果检测
[0077]首先加入100%的甲醇到实验组溶液或对照组溶液(体积比6: 4)分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组溶液和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取(方法参照免疫亲和柱使用说明书);最后用HPLC(柱后光化学衍生)对净化提取得到的样品进行检测，同时对黄曲霉毒素B2、G1和G2的混合标准品进行HPLC分析。
[0078]HPLC检测条件为流动相甲醇:水=1: I (体积比)；流速lml/min ;色谱柱(C18150mmX4.6mm,0.5 μ m);激发波长 350nm，检测波长 450nm ;柱温:30°C ;进样量 20 μ I。
[0079]AFG1降解率(％)=(对照组AFG1含量-实验组AFG1含量)/对照组AFG1含量X 100。
[0080]结果如图3和表1所示。
[0081]图3中，A:黄曲霉毒素BpByG1和G2的混合标准品；Β:对照组；C:实验组。
[0082]结果表明，N17-1对黄曲霉毒素G1有很好的降解效果，降解率为98.89%。
[0083]实施例6、铜绿假单胞菌N17-1对黄曲霉毒素G2的降解作用
[0084]一、黄曲霉毒素G2的配制
[0085]将Img黄曲霉毒素G2 (AFG2)标准品溶解于2ml色谱纯甲醇中获得浓度为500ppb的黄曲霉毒素G2溶液
[0086]二、取0.4ml实施例2得到的菌液置于L 5ml离心管中，加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素G2至其终浓度为lOOppb，充分混匀后37°C静置72h后，1000Og离心IOmin去除细胞，得上清，记作实验组溶液。以0.4ml不接菌的NB培养基加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素G2作为对照组，记作对照组溶液。
[0087]三、N17-1对黄曲霉毒素G2的降解效果检测
[0088]首先加入100%的甲醇到实验组溶液或对照组溶液(体积比6: 4)分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组溶液和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取(方法参照免疫亲和柱使用说明书);最后用HPLC(柱后光化学衍生)对净化提取得到的样品进行检测，同时对黄曲霉毒素B2、G1和G2的混合标准品进行HPLC分析。
[0089]HPLC检测条件为流动相甲醇:水=1: I (体积比)；流速lml/min ;色谱柱C18(150mmX4.6mm,0.5 μ m);激发波长 350nm，检测波长 450nm ;柱温:30°C ;进样量 20 μ I。
[0090]AFG2降解率(％)=(对照组AFG2含量-实验组AFG2含量)/对照组AFG2含量X 100。
[0091]结果如图4和表1所示。
[0092]图4中，A:黄曲霉毒素BpByG1和G2的混合标准品；Β:对照组；C:实验组。
[0093]结果表明，N17-1对黄曲霉毒素G2有很好的降解效果，降解率为96.45%。
[0094]实施例7、铜绿假单胞菌N17-1对黄曲霉毒素M1的降解作用
[0095]一、黄曲霉毒素M1的配制
[0096]将Img黄曲霉毒素M1标准品溶解于2ml色谱纯甲醇中获得浓度为500ppb的黄曲霉毒素M1溶液
[0097]二、取0.4ml实施例2得到的菌液置于L 5ml离心管中，加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素M1至其终浓度为lOOppb，充分混匀37°C静置72h后，1000Og离心IOmin去除细胞，得上清，记作实验组溶液。以0.4ml不接菌的NB培养基加入0.1ml浓度为500ppb的黄曲霉毒素M1作为对照组，记作对照组溶液。
[0098]三、黄曲霉毒素M1的检测
[0099]首先加入100%的甲醇到实验组溶液或对照组溶液(体积比6: 4)分别进行萃取，然后使用免疫亲和柱对实验组溶液和对照组溶液萃取后样品的残留毒素进行净化提取(方法参照免疫亲和柱使用说明书);最后用HPLC(柱后光化学衍生)对净化提取得到的样品进行检测。
[0100]HPLC检测条件为流动相甲醇:水=1: I ;流速lml/min ;色谱柱C18(150mmX4.6mm,0.5 μ m);激发波长 350nm，检测波长 450nm ;柱温:30°C ;进样量 20 μ I。
[0101]AFM1降解率(％)=(对照组AFM1含量-实验组AFM1含量)/对照组AFM1含量X 100。
[0102]结果如图5和表1所示。
[0103]图5中，A:黄曲霉毒素M1标准品；Β:对照组；C:实验组。
[0104]结果表明，N17-1对黄曲霉毒素M1有一定的降解效果，降解率为31.88%。
[0105]表1铜绿假单胞菌N17-1对黄曲霉毒素的降解效果
[0106]
【权利要求】
1.一株铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa),其保藏编号为 CGMCC N0.8511。
2.一种降解黄曲霉毒素的方法，包括如下步骤:用权利要求1所述的铜绿假单胞菌对黄曲霉毒素进行降解处理。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于:所述降解处理的方式为将权利要求1所述的铜绿假单 胞菌的菌悬液和/或发酵液和/或代谢产物与含有黄曲霉毒素的样品和/或产品混合。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于:所述黄曲霉毒素为B族黄曲霉毒素、B族黄曲霉毒素的衍生物和/或G族黄曲霉毒素。
5.根据权利要求2-4任一所述的方法，其特征在于:所述B族黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1或黄曲霉毒素B2 ； 所述G族黄曲霉毒素为黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素G2 ； 所述B族黄曲霉毒素的衍生物为黄曲霉毒素Mp
6.权利要求1所述的铜绿假单胞菌和/或其菌悬液和/或发酵液和/或代谢产物在制备降解黄曲霉毒素的产品中的应用。
7.权利要求1所述的铜绿假单胞菌和/或其菌悬液和/或发酵液和/或代谢产物在降解黄曲霉毒素中的应用。
8.根据权利要求6或7所述的应用，其特征在于:所述黄曲霉毒素为B族黄曲霉毒素、B族黄曲霉毒素的衍生物和/或G族黄曲霉毒素。
9.根据权利要求6-8任一所述的应用，其特征在于:所述B族黄曲霉毒素为黄曲霉毒素B1或黄曲霉毒素B2 ； 所述G族黄曲霉毒素为黄曲霉毒素G1或黄曲霉毒素G2 ； 所述B族黄曲霉毒素的衍生物为黄曲霉毒素Mp
【文档编号】A62D3/02GK103710292SQ201410001212
【公开日】2014年4月9日 申请日期:2014年1月2日 优先权日:2014年1月2日
【发明者】赵月菊, 刘阳, 兰茨纳·桑格, 邢福国, 周露, 王龑 申请人:中国农业科学院农产品加工研究所