一种枯草芽孢杆菌微生物肥料及其制备方法与流程

本发明涉及一种微生物肥料及其制备方法，更具体而言，涉及一种枯草芽孢杆菌微生物肥料及其制备方法，属于微生物培养和微生物肥料应用技术领域。

背景技术：

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtillis)属于芽孢杆菌属更进一步的属于革兰氏阳性菌，呈单个细胞形式，无荚膜，通常为(0.7-0.8)×(2-3)微米。

枯草芽孢杆菌是一种益生菌，其具有多种生物功能，可应用于多个技术领域中，例如：其具有繁殖速度快、产生大量内生消化酶、提高饲料营养品质、提高肥效、可作为微生物农药、降解饲料中复杂有机物、促进吸收、增强动物免疫力和抗病力等等，从而在畜牧业、饲料业、农药、肥料、杀菌、石油开采、园林业、蛋白质多肽合成等多个领域中都具有广泛的应用，且其应用领域和新的用途也一直在研究和拓展中。

其中，枯草芽孢杆菌在生物有机肥领域中的应用日益受到人们的关注，因为微生物肥料具有化学肥料所不具备的多种有点，例如不会引起土壤板结、无残留、安全无毒、对水体和环境污染物等等，因此受到了人们的极大关注，引发了研发热情，并取得了诸多成果，例如：

CN102329166A公开了一种活化土壤、可免耕的水溶性复合肥料及其制备方法，由以下重量百分比原料制成：尿素15％、磷酸二氢钾50％、腐殖酸25％、枯草芽孢杆菌菌剂10％；制备步骤为：1)尿素粉碎；2)培养枯草芽孢杆菌菌剂；3)将尿素粉末、腐殖酸、磷酸二氢钾依次添加入连续式反应釜；4)加入枯草芽孢杆菌菌剂进行二次混匀；5)包装入库。其取得了如下的有益效果：既具有速效性又具有长效性，既能为作物直接提供营养还能激活土壤中被固定的营养；既能活化土壤还能抑制土壤病菌；既能增加产量还能改善品质；既能促进根系发育还能提高土壤保水保肥能力；既能有效培肥地力还能减少化学肥料用量；本品水溶解度达到98％以上，可随水冲施或用施肥枪土壤注射，简便易行，省功省资。

CN102391948A公开了一种秸秆发酵复合菌剂，它由下述重量百分比原料配制而成：枯草芽孢杆菌30％，黄绿木霉10％，酿酒酵母12％，米曲霉20％，扩张青霉18％，绿色木霉10％。本发明的菌剂能够加快有机质的分解速度，一周左右就能完全分解农作物秸秆还田，秸秆腐解变黑，达到腐熟；同时加速秸秆中营养元素释放，为后期作物的生长提供更多的养分，维持和提高土壤肥力，提高土壤有机质，改善土壤理化性质，下茬作物产量提高5％以上，可广泛应用于水稻、小麦、玉米等作物秸秆还田。

CN102417413A公开了一种复合微生物肥料，其由枯草芽孢杆菌与其它菌种复合成复合微生物菌剂，复合微生物菌剂再与草炭或分化煤、无机添加物复合而成。与现有的微生物肥料相比，所述复合微生物肥料除具有现有微生物肥料的作用外，其中含有的腐植酸分解菌能降解草炭和分化煤中的腐植酸，从而增加了微生物肥料的肥效，使其促进作物生长、提高作物产量及改良土壤等优点。

CN102515891A公开了一种微生物肥料，包含下列比例的微生物发酵液：光合细菌、乳酸菌、放线菌、康宁木霉菌、枯草芽孢杆菌发酵液体积比为1∶0.8～1∶1.2～1.4：0.6～0.8:1～1.2。所述肥料可以提高肥料的利用效率，并且还能够起到防治植物枯死、病害的作用。

CN102515954A公开了一种黄萎病专用生物有机肥，由生防性枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NCD-2，胶质芽孢杆菌(Bacillus mucilaginosus Krassilnikov)，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)用吸附介质吸附后按6-4∶3-2∶3-2的质量比例混合成复合菌剂，再与水解渣混合而成。还提供了该生物有机肥的生产方法。所述黄萎病专用生物有机肥能显著提高生物肥料的肥效，对作物的病害有明显的防治效果，大大减少了病苗率，同时能比较全面的提供作物生长所需的养分，提高作物产量。

CN102757275A公开了一种用于水产养殖池的生物肥料及其制备方法，所述生物肥料由腐植酸钠、尿素、过磷酸钙、枯草芽孢杆菌和斜发沸石粉组成，按其重量份数计腐植酸钠100～200份、尿素100～200份、过磷酸钙100～200份、枯草芽孢杆菌100～200份、斜发沸石粉200～600份，通过各组分混合制备而成；所述生物肥料通过合理组方可速效肥水，调节水质，改善底质，该生物肥料除供给水生生物直接利用外，还可与水体底质中的有害物质结合，解除毒性，同时提高藻类的新陈代谢，增加水体溶氧；其制备方法简单，适合规模化工业生产的需要。

CN102757277A公开了一种水稻生物肥料及其制备方法以及枯草芽孢杆菌。该制备方法将保藏编号为CGMCC No.6190的枯草芽孢杆菌加到固体物料中发酵至枯草芽孢杆菌数至少为1.2×10¹⁰个/g，且枯草芽孢杆菌芽孢率至少达到60％、杂菌率小于20％，然后将发酵好的固体物料与腐殖酸、农用稀土、腐熟发酵后的禽畜粪便、硅钙镁肥料以及氨基酸肥料混匀即得水稻生物肥料。该发明利用诱变的枯草芽孢菌与鸡粪等腐熟发酵的有机质、腐植酸、硅钙镁肥料、农用稀土、氨基酸肥料等物质混合，形成复合水稻微生物肥料，能够提高水稻分蘖数、提前水稻分蘖期、增加水稻根重、加深水稻叶色、提高水温，促使水稻在冷胁迫下更好的生长。

CN105541423A公开了一种含有枯草芽孢杆菌的微生物肥料，涉及农业技术领域，该微生物肥料的配方由有机肥料和微生物菌组成，通过采用有机肥料与微生物菌作为微生物肥料的组成成分，极大地改善了作物的生长环境，为其不仅提供了生长所需的养分，而且还提高了其适应环境的能力，促使作物在较冷的环境中依然呈现出良好的生长态势。

CN105254424A公开了一种由枯草芽孢杆菌制备的微生物肥料及其制备方法，该枯草芽孢杆菌保藏号为CGMCC No.5091的微生物菌种经过培养得到培养物，所得培养物和草炭粉混合得到微生物菌种剂，所得微生物菌种剂再与常规肥料混合制备而成，其中所述微生物菌种培养物的培养方法如下：1)将1体积菌悬液接入20倍体积的1号培养基中，30-38℃有氧培养8小时；2)将步骤1)得到的培养液加入到约20倍体积的2号培养基中，30-38℃有氧培养8小时；3)将步骤2)得到的培养液加入到约20倍体积的3号培养基中，35-38℃培养8小时，即得可生产用的培养物。

CN104774112A公开了一种有机复合肥料的制备方法，包括将下列组分混合的步骤，枯草芽孢杆菌孢子粉0.3％；米曲霉孢子粉0.4％；有机肥料30％；腐殖酸50％；余量为载体；枯草芽孢杆菌孢子粉和米曲霉孢子粉的制备方法相同，经过斜面培养和种子培养，得到孢子粉。所述有机肥料由于是通过生物降解来获得有机质和其他有效成分，不会造成土壤硬结，避免造成土壤污染。

CN104671848A公开了一种微生物复合肥料及其生产方法，所述微生物复合肥料，由黑曲霉培养物、枯草芽孢杆菌菌剂组成，实验表明：使用本品可提高粮食产量8-30％，提高蔬菜产量10-40％，还可改善蔬菜、粮食的品质和风味。每亩土地使用所述肥料的量为50-100克，是目前国内外使用量较少的微生物复合肥料之一。

CN104311225A公开了一种高效杀菌肥料，其由以下重量份组成：草木灰8-15份，复合微生物菌剂3-7份，硝酸盐4-6份，七水硫酸锌8-14份，有机酸5-9份，磷酸二氢钾4-11份，茶籽壳炭粒3-5份，过磷酸钙5-9份，碳酸氢氨3-8份，氨基酸2-5份，硫酸钾1-4份，枯草芽孢杆菌菌剂5-7份，杀菌剂6-10份。所述肥料具有一定的杀菌作用，同时添加了菌剂，改善了土壤，防止了土壤的板结。

CN104291951A公开了一种改善土壤酸碱度的肥料，其由以下重量份组成：枯草芽孢杆菌2-7份，硅藻土3-6份，磷酸二氢钙6-10份，谷氨酸钠1-5份，泥炭土3-8份，动物毛粉2-5份，四水钼酸铵3-9份，七水硫酸锌5-9份，聚天冬氨酸5-8份，薯类秸秆8-14份，秸秆灰烬1-5份，黄豆粉2-8份，氯化铵3-6份，雪山一枝蒿5-11份，石灰石1-6份。所述肥料能够改善土壤的酸碱度，提高土壤的肥力，改善作物的生长环境。

CN103833427A公开了一种水溶生物肥料，其活性成分为枯草芽孢杆菌BacillussubtilisLiu-3菌体，制备步骤为：1)用接菌环取生长在固体培养基上的BacillussubtilisLiu-3菌1环，接入5mL的液体培养基中，35-37℃，300-400r/min，摇床培养20-24h；2)将得到的一级种子培养液5mL，接入1000mL液体培养基中，35-37℃，300-400r/min，摇床培养20-24h；3)将得到的二级种子培养液1000mL，接入30L液体培养基中，35-37℃，200r/min，发酵培养70-72h，发酵液为每mL含有2亿个菌以上。所述肥料可用于大田作物、果树与各种蔬菜瓜果的栽培等，可以促进植物生长和提高作物的产量，具有可观的经济效益和社会效益。

CN103664259A公开了一种利用鸭粪便发酵生产生物有机肥料的方法，包括以下步骤：步骤一、取等量的枯草芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌等，扩培制备发酵剂；步骤二、向鸭粪便原材料中接入发酵剂，加水后装入窑炉式固体发酵隧道内堆制发酵垛，15-35天后一次发酵腐熟完成；步骤三、将一次发酵腐熟的鸭粪便自然堆置，至常温则二次发酵完成；步骤四、将二次发酵的鸭粪便采用回转圆筒干燥机直火烘干。采用本发明提供的方法对鸭粪便发酵，利用所述各种微生物的协同作用，使鸭粪便转换为利于植物生长利用的生物有机肥料，施入土壤后，土壤有机质含量高，且质量相对较好，可为农作物提供全面的营养，从而提高农作物产量，经济效益较高。

CN102765971A公开了一种氨基酸肥料及其制备方法，按重量份计氨基酸肥料的由以下组分组成，酵素菌1-2份；禽畜粪便20-30份；青蒿渣50-70份；其中酵素菌由枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis.)RB和市售酵素菌组成，枯草芽孢杆菌RB保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC NO.6268；枯草芽孢杆菌RB处理青蒿渣的效力高，制成的氨基酸肥料中养分丰富，富含氨基酸，实现了变废为宝，可为农林业生产提供优质的氨基酸肥料。

CN102515891A公开了一种微生物肥料，包含下列比例的微生物发酵液：光合细菌、乳酸菌、放线菌、康宁木霉菌、枯草芽孢杆菌发酵液体积比为1:0.8-1:1.2-1.4:0.6-0.8:1-1.2。所述肥料可以提高肥料的利用效率，并且还能够起到防治植物枯死、病害的作用。

如上所述，现有技术中公开了包含枯草芽孢杆菌的多种微生物肥料，但对于新型的枯草芽孢杆菌微生物肥料及其制备方法，仍存在继续研究的必要和需求，这目前是微生物肥料领域中的研究热点和重点，更是本发明得以完成的动力所在和基础所倚。

技术实现要素：

为了寻求枯草芽孢杆菌微生物肥料及其制备方法，本发明人进行了大量的深入研究，在付出了创造性劳动后，从而完成了本发明。

具体而言，本发明涉及如下几个方面。

第一个方面，本发明涉及一种枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法，所述方法包括如下步骤：

S1：配制第一液体培养基；

S2：配制第二液体培养基；

S3：菌种培养得到第一培养液；

S4：继续培养得到第二培养液；

S5：固体培养基发酵处理，得到所述枯草芽孢杆菌微生物肥料。

在本发明的枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法中，所述步骤S1具体如下：

S1-1：分别称取如下的基础物：微量元素水溶液40-50ml、维生素E 1-2g、苏氨酸300-400mg、L-脯氨酸200-300mg、葡萄糖3-4.5g、蔗糖2-4g、琼脂5-6g、蛋白胨6-8g、酵母浸膏1.5-3g、10-12g大豆粉和牛肉膏3-5g；

S1-2：将上述基础物加入到去离子水中，充分搅拌，并用去离子水定容至1000ml，即得到所述第一液体培养基。

其中，所述微量元素水溶液是将4g硝酸锌、3.5g硫酸锌、3g硝酸镁、1g氯化钴、2g硝酸铜、2.5g氯化钙、4g氯化锰、8g氯化亚铁和3g氯化铁充分溶解于1000ml蒸馏水中而得到的；然后量取其中的40-50ml，即为上述步骤S1-1中所使用的40-50ml微量元素水溶液。

在本发明的枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法中，所述步骤S2具体如下：

S2-1：同步骤S1-1；

也即别称取如下的基础物：微量元素水溶液40-50ml、维生素E1-2g、苏氨酸300-400mg、L-脯氨酸200-300mg、葡萄糖3-4.5g、蔗糖2-4g、琼脂5-6g、蛋白胨6-8g、酵母浸膏1.5-3g、10-12g大豆粉和牛肉膏3-5g；

S2-2：将所述基础物和25-40ml无机物混合液加入到去离子水中充分搅拌，并用去离子水定容至1000ml且调节pH值为6.4-7.2，即得到所述第二液体培养基。

其中，所述无机物混合液是将5g Na₂SO₄、2g NaCl、12g K₂HPO₄、4g Na₃PO₄、7g NH₄Cl、2.5g硼酸、3g KNO₃和5g KI加入到1000ml蒸馏水中充分搅拌溶解而得到的；然后量取其中的25-40ml，即为上述步骤S2-2中所使用的25-40ml无机物混合液。

其中，步骤S2-2中将pH值调节为6.4-7.2，例如可为6.4、6.6、6.8、7或7.2，最优选为6.8。

该pH值调节对于本领域技术人员来说非常常规的技术手段，在此不再进行详细描述。

本发明人发现，当pH值为6.8时，可以取得最好的技术效果，这应该是该pH值下枯草芽孢杆菌具有最适宜的生长和繁殖环境。

而且，本发明人发现，当在步骤S1的S1-1基础上，继续加入步骤S2-2中额外的无机物混合液时，可以显著促进和改善枯草芽孢杆菌第二培养液(即步骤S4中的第二培养液)中的活菌含量，这应该是当加入无机物混合液，能够在第一培养基的基础上，进一步改善和促进了枯草芽孢杆菌的生长与繁殖(进而也改善了最终的肥料性能)，发明人意欲进行后续的研究。

在本发明的枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法中，所述步骤S3具体如下：

将枯草芽孢杆菌菌株进行斜面试管培养，得到枯草芽孢杆菌菌落，然后使用接种环接1环接种于120ml所述第一液体培养基中，于温度T1和转速为140-160转/分钟下振荡培养30-34小时，从而得到所述第一培养液。

其中，所述斜面试管培养是本领域中的常规技术，在此不再进行详细描述。

其中，本领域技术人员可选择任何已知的枯草芽孢杆菌菌株，例如可使用已经保藏在中国农业微生物菌种保藏管理中心的编号为ACCC10619或ACCC03120等的枯草芽孢杆菌菌株，或保藏在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心的编号为CGMCC No.0954、CGMCC No.1019、CGMCC No.2099等的枯草芽孢杆菌菌株，或者可以商业渠道而购买获得多种枯草芽孢杆菌菌株，在此不再进行详细描述。

其中，温度T1为35-37℃，例如可为35℃、36℃或37℃。

在本发明的枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法中，所述步骤S4具体如下：

按照1.5-1.9:100的体积比，将所述第一培养液接种于所述第二液体培养基中，并降温至温度T2，然后以160-170转/分钟的速度搅拌并通风(即通入空气)，培养18-22小时，从而得到所述第二培养液，完成所述培养方法。

其中，温度T2为28-32℃，例如可为28℃、29℃、30℃、31℃或32℃，且优选T1-T2(即温度T1与温度T2的差值)为5-7℃，最优选为6℃，即最优选T1-T2＝6℃。

发明人发现，温度T1和T2的差值能够显著影响第二培养液中的活菌总数和芽孢率，这应该是合适的温度降低能够在第二液体培养基的协同作用下进一步增强了菌种的繁殖和培养能力，从而取得了更好的技术效果，也提高了最终微生物肥料的性能。

其中，通风的通风比为1:0.7-0.8，例如可为1:0.7、1:0.75或1:0.8。

在本发明的枯草芽孢杆菌微生物肥料的制备方法中，所述步骤S5具体如下：

S5-1：分别称取3重量份棉粕、1重量份麦麸、2重量份花生饼、2.5重量份干蚕沙、10重量份干燥的玉米秸秆粉、0.1重量份红糖、0.6重量份黄豆粉、2重量份鱼骨粉、4重量份干燥的甘蔗渣、0.008重量份纤维素酶、1.8重量份干燥鸡粪、0.1量份氯化铵、1重量份糖蜜和0.08重量黄腐酸钾，混合均匀，然后130-140℃的高温水蒸气充分灭菌，得到基料；

S5-2：向所述基料中淋入去离子水，并充分翻拌，直至基料的水分质量百分含量为40-46％，得到所述固体培养基；

S5-3：在无菌状态下，将所述第二培养液接种于所述固体培养基中，并在36-40℃下进行固体发酵培养50-60小时，期间保持水分质量百分含量一直为43±2％，发酵完成后得到发酵物；将所述发酵物在70-80℃下进行热风干燥，直至水分质量百分含量≤8％，冷却至室温并粉碎过80目筛，即得到所述枯草芽孢杆菌微生物肥料。

其中，在所述步骤S5-3中，所述第二培养液与所述固体培养基的质量比为1:18-24，例如可为1:18、1:20、1:22或1:24。

第二个方面，本发明涉及根据上述制备方法制得的所述枯草芽孢杆菌微生物肥料。

本发明的制备方法通过独特的多个技术特征相互之间的协同作用和相互促进，从而取得了良好的技术效果，可以提供具有高活性、高密度的枯草芽孢杆菌培养液，进而得到了具有优异性能的枯草芽孢杆菌微生物肥料，从而在工业上具有良好的应用前景和生产潜力。

第三个方面，本发明涉及所述枯草芽孢杆菌微生物肥料在农业领域中的用途。

经过研究发现，所述枯草芽孢杆菌微生物肥料具有良好性能，从而可在农业领域，例如庄稼、蔬菜、水果、花卉或苗木等的种植和/或培育中具有良好的应用前景和潜力。

如上所述，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌微生物肥料及其制备方法，所述制备方法通过独特的多个技术特征之间的相互组合和协同，从而得到了具有优异技术效果的最终枯草芽孢杆菌微生物肥料，能够满足农业技术领域的广泛需求，具有良好的应用前景和工业化生产潜力。

具体实施方式

下面通过具体的实施例对本发明进行详细说明，但这些例举性实施方式的用途和目的仅用来例举本发明，并非对本发明的实际保护范围构成任何形式的任何限定，更非将本发明的保护范围局限于此。

制备例1：微量元素水溶液的制备

将4g硝酸锌、3.5g硫酸锌、3g硝酸镁、1g氯化钴、2g硝酸铜、2.5g氯化钙、4g氯化锰、8g氯化亚铁和3g氯化铁充分溶解于1000ml蒸馏水中，从而得到微量元素水溶液。

制备例2：无机物混合液的制备

将5g Na₂SO₄、2g NaCl、12g K₂HPO₄、4g Na₃PO₄、7g NH₄Cl、2.5g硼酸、3g KNO₃和5g KI加入到1000ml蒸馏水中搅拌溶解，从而得到无机物混合液。

制备例3：固体培养基的制备(即步骤S5-1和S5-2)

S5-1：分别称取3重量份棉粕、1重量份麦麸、2重量份花生饼、2.5重量份干蚕沙、10重量份干燥的玉米秸秆粉、0.1重量份红糖、0.6重量份黄豆粉、2重量份鱼骨粉、4重量份干燥的甘蔗渣、0.008重量份纤维素酶、1.8重量份干燥鸡粪、0.1量份氯化铵、1重量份糖蜜和0.08重量黄腐酸钾，混合均匀，然后130-140℃的高温水蒸气充分灭菌，得到基料；

S5-2：向所述基料中淋入去离子水，并充分翻拌，直至基料的水分质量百分含量为43％，得到所述固体培养基。

除非另有说明，否则如下所有的微量元素水溶液、无机物混合液和固体培养基均为相应的上述制备例1-3得到的。

实施例1

S1：配制第一液体培养基

S1-1：分别称取如下的基础物：微量元素水溶液45ml、维生素E 1.5g、苏氨酸350mg、L-脯氨酸250mg、葡萄糖3.75g、蔗糖3g、琼脂5.5g、蛋白胨7g、酵母浸膏2.25g、11g大豆粉和牛肉膏4g；

S1-2：将上述基础物加入到去离子水中，充分搅拌，并用去离子水定容至1000ml，得到所述第一液体培养基；

S2：配制第二液体培养基

S2-1：同步骤S1-1；

S2-2：将所述基础物和32.5ml无机物混合液加入到去离子水中充分搅拌，并用去离子水定容至1000ml且调节pH值为6.8，得到所述第二液体培养基；

S3：菌种培养得到第一培养液

将枯草芽孢杆菌菌株(来自中国农业微生物菌种保藏管理中心的编号为ACCC10619的枯草芽孢杆菌菌株)进行斜面试管培养，得到枯草芽孢杆菌菌落，然后使用接种环接1环接种于120ml所述第一液体培养基中，于温度T1(为36℃)和转速为150转/分钟下振荡培养32小时，从而得到所述第一培养液；

S4：继续培养得到第二培养液

按照1.7:100的体积比，将所述第一培养液接种于所述第二液体培养基中，并降温至温度T2(为30℃)，然后以160转/分钟的速度搅拌并通风(通风比为1:0.75)，培养20小时，从而得到所述第二培养液(将其命名为P1)；

S5：固体培养基培养，得到枯草芽孢杆菌微生物肥料

S5-1至S5-2：见上述制备例3；

S5-3：在无菌状态下，将所述第二培养液接种于所述固体培养基中(第二培养液与固体培养基的质量比为1:21)，并在38℃下进行固体发酵培养55小时，期间保持水分质量百分含量一直为43±2％，发酵完成后得到发酵物；将所述发酵物在75℃下进行热风干燥，直至水分质量百分含量≤8％，冷却至室温并粉碎过80目筛，即得到所述枯草芽孢杆菌微生物肥料，将其命名为F1。

实施例2

S1：配制第一液体培养基

S1-1：分别称取如下的基础物：微量元素水溶液40ml、维生素E 2g、苏氨酸300mg、L-脯氨酸300mg、葡萄糖3g、蔗糖4g、琼脂5g、蛋白胨6g、酵母浸膏3g、10g大豆粉和牛肉膏5g；

S1-2：将上述基础物加入到去离子水中，充分搅拌，并用去离子水定容至1000ml，得到所述第一液体培养基；

S2：配制第二液体培养基

S2-1：同步骤S1-1；

S2-2：将所述基础物和25ml无机物混合液加入到去离子水中充分搅拌，并用去离子水定容至1000ml且调节pH值为6.8，得到所述第二液体培养基；

S3：菌种培养得到第一培养液

将枯草芽孢杆菌菌株(来自中国农业微生物菌种保藏管理中心的编号为ACCC10619的枯草芽孢杆菌菌株)进行斜面试管培养，得到枯草芽孢杆菌菌落，然后使用接种环接1环接种于120ml所述第一液体培养基中，于温度T1(为35℃)和转速为140转/分钟下振荡培养34小时，从而得到所述第一培养液；

S4：继续培养得到第二培养液

按照1.5:100的体积比，将所述第一培养液接种于所述第二液体培养基中，并降温至温度T2(为29℃)，然后以170转/分钟的速度搅拌并通风(通风比为1:0.7)，培养22小时，从而得到所述第二培养液(将其命名为P2)；

S5：固体培养基培养，得到枯草芽孢杆菌微生物肥料

S5-1至S5-2：见上述制备例3；

S5-3：在无菌状态下，将所述第二培养液接种于所述固体培养基中(第二培养液与固体培养基的质量比为1:18)，并在36℃下进行固体发酵培养60小时，期间保持水分质量百分含量一直为43±2％，发酵完成后得到发酵物；将所述发酵物在70℃下进行热风干燥，直至水分质量百分含量≤8％，冷却至室温并粉碎过80目筛，即得到所述枯草芽孢杆菌微生物肥料，将其命名为F2。

实施例3

S1：配制第一液体培养基

S1-1：分别称取如下的基础物：微量元素水溶液50ml、维生素E 1g、苏氨酸400mg、L-脯氨酸200mg、葡萄糖4.5g、蔗糖2g、琼脂6g、蛋白胨8g、酵母浸膏1.5g、12g大豆粉和牛肉膏3g；

S1-2：将上述基础物加入到去离子水中，充分搅拌，并用去离子水定容至1000ml，得到所述第一液体培养基；

S2：配制第二液体培养基

S2-1：同步骤S1-1；

S2-2：将所述基础物和40ml无机物混合液加入到去离子水中充分搅拌，并用去离子水定容至1000ml且调节pH值为6.8，得到所述第二液体培养基；

S3：菌种培养得到第一培养液

将枯草芽孢杆菌菌株(来自中国农业微生物菌种保藏管理中心的编号为ACCC10619的枯草芽孢杆菌菌株)进行斜面试管培养，得到枯草芽孢杆菌菌落，然后使用接种环接1环接种于120ml所述第一液体培养基中，于温度T1(为37℃)和转速为160转/分钟下振荡培养30小时，从而得到所述第一培养液；

S4：继续培养得到第二培养液

按照1.9:100的体积比，将所述第一培养液接种于所述第二液体培养基中，并降温至温度T2(为31℃)，然后以160转/分钟的速度搅拌并通风(通风比为1:0.8)，培养18小时，从而得到所述第二培养液(将其命名为P3)；

S5：固体培养基培养，得到枯草芽孢杆菌微生物肥料

S5-1至S5-2：见上述制备例3；

S5-3：在无菌状态下，将所述第二培养液接种于所述固体培养基中(第二培养液与固体培养基的质量比为1:24)，并在40℃下进行固体发酵培养50小时，期间保持水分质量百分含量一直为43±2％，发酵完成后得到发酵物；将所述发酵物在80℃下进行热风干燥，直至水分质量百分含量≤8％，冷却至室温并粉碎过80目筛，即得到所述枯草芽孢杆菌微生物肥料，将其命名为F3。

第二培养液的性能考察

按照本领域中的常规测试方法，对实施例1-3得到的不同第二培养液在制备得到后，立刻进行菌落计数考察，分别考察了每毫升(ml)发酵物中的活菌数和芽孢率，结果见下表1。

表1

由此可见，本发明制备方法的步骤S4中可得到具有高活菌数和高芽孢率的枯草芽孢杆菌第二培养液，从而为其后续步骤S5的最优异微生物肥料制备提供了良好的基础。

下面对影响步骤S4第二培养液性能和最终枯草芽孢杆菌微生物肥料性能的多个技术特征进行考察。

对比例1-6：培养基的考察

对比例1-3：除分别将实施例1-3的S4中的第二液体培养基替换为第一液体培养基外(即全程使用第一液体培养基进行培养)，其它操作均不变，从而重复操作了实施例1-3，分别得到对比例1-3，将所得第二培养液顺次命名为DP1、DP2和DP3，和将所得的最终枯草芽孢杆菌微生物肥料顺次命名为DF1、DF2和DF3。

对比例4-6：除分别将实施例1-3的S3中的第一液体培养基替换为第二液体培养基外(即全程使用第二液体培养基进行培养)，其它操作均不变，从而重复操作了实施例1-3，分别得到对比例4-6，将所得第二培养液顺次命名为DP4、DP5和DP6，和将所得的最终枯草芽孢杆菌微生物肥料顺次命名为DF4、DF5和DF6。

按照上述相同的方法对DP1-DP6进行菌落计数考察，分别考察了每毫升(ml)发酵物中的活菌数(单位为：×10⁹cfu/ml)和芽孢率，结果见下表2。

其中，为了方便进行对比，将P1-P3的数据一同列出。

表2

其中，P1-P3的数据分别按照相同的顺序进行对应，例如对于芽孢率(％)而言，“97.6、97.1、97.4”意味着P1为97.6、P2为97.1和P3为97.4。所有编号的对应关系均如此(在下面的所有表格中也是具有同样的含义，届时不再一一列出)，在此不再一一赘述。

由此可见，在不同步骤中，培养基的种类选择和组分选择可以对最终结果产生不可预测的影响；DP4-DP6的活菌数要显著优于DP1-DP3，但芽孢率却相差无几。这进一步证明了只有先后使用本发明的独特第一液体培养基和第二液体培养基，才能取得最好的技术效果。

对比例7-10：步骤S2-2中pH的考察

分别采用下表所示的步骤S2-2中的pH值(其它操作均不变)，从而分别重复了实施例1-3，得到对比例7-10(将所得的最终枯草芽孢杆菌微生物肥料顺次命名为DF7、DF7、DF8、DF9和DF10)，所使用pH值、对应实施例、最终所得第二培养液的命名以及相同方法测试的活菌数(单位为：×10⁹cfu/ml)和芽孢率数据见下表3。其中，为了方便进行对比，将P1-P3的数据一同列出。

表3

其中，“--”表示实施例1-3的对应关系即分别为自身。

由此可见，步骤S2-2中的pH值调节非常重要，当为6.8时可以取得最好的技术效果，偏离该值越大，则活菌数和芽孢率降低越明显(见DP7-DP10)，这证明pH值的确定具有非显而易见性，且效果不可预料。

对比例11-16：步骤S3中T1-T2差值的考察

分别采用下表所示的步骤S3中的具体T1、T2和T1-T2的差值(其它操作均不变)，从而分别重复了实施例1-3，得到对比例11-16，其中所使用的T1、T2和T1-T2、对应实施例和最终所得第二培养液的命名见下表4(其中T1、T2和T1-T2的单位均为℃)。

表4

按照相同方法测试活菌数(单位为：×10⁹cfu/ml)和芽孢率，数据见下表5。其中，为了方便进行对比，将P1-P3的数据一同列出。

表5

由此可见，步骤S3中T1和T2的差值对于最终结果同样有着非常显著的影响，当差值为6℃时，可以取得最好的技术效果，而当为5℃或7℃时，则效果降低明显，而且对于同样的偏离值(1℃)，DP11-DP13的活菌数要显著优于DP14-DP16，但芽孢率却劣于DP14-DP16，无法实现活菌数和芽孢率的同时最优，这也证明了只有差值为6℃时才能取得最好的平衡性能，达到两者的最优效果。

由此可见，只有采用本发明制备方法中的步骤S1-S4，才能得到具有最好效果的第二培养液，从而为后续步骤S5中枯草芽孢杆菌肥料的制备奠定了基础，并保证了其具有最好的技术效果(见下面的诸多数据证明)。

最终肥料的性能考察

A、菌落计数的考察

按照本领域中的常规测试方法，对各个实施例和对比例得到的不同枯草芽孢杆菌肥料在制备得到后，立刻进行菌落计数考察，分别考察了每克发酵物中的活菌数(单位为：亿/克)和芽孢率，结果见下表6。

其中，相同组别的多个肥料的数值均取其平均数。

表6

由此可见：1、本发明方法得到的F1-F3具有很高的活菌数和芽孢率；2、而当一直使用第一液体培养基或第二液体培养基时，活菌数和芽孢率均有显著降低，尤其是一直使用第二液体培养基时降低更明显(见DF4-DF6)；3、步骤S2-2中的pH值调节非常重要，当为6.8时可以取得最好的技术效果，偏离该值越大，则活菌数和芽孢率降低越明显(见DF7-DF10)，这证明pH值的确定具有非显而易见性，且效果不可预料；4、步骤S3中T1和T2的差值对于最终结果同样有着非常显著的影响，当差值为6℃时，可以取得最好的技术效果，而当为5℃或7℃时，则效果降低明显，而且对于同样的偏离值(1℃)，DF11-DF13的活菌数要显著优于DF14-DF16，但芽孢率却劣于DF14-DF16，这证明只有差值为6℃时才能取得最好的平衡性能。

B、耐高温性的考察

各个实施例和对比例在得到不同的枯草芽孢杆菌肥料后40分钟，分别在不同的温度(70℃、80℃、90℃和100℃)下恒温保持20分钟，然后再次测量其活菌数，并与初始活菌数进行计算，从而得到高温后的存活率，结果见下表7。

其中，相同组别的多个肥料均取其平均数。

表7

由此可见：1、本发明方法得到的F1-F3具有优异的抗高温性能，这在储存时防止自身发酵而降低活性具有重要意义；2、而所有对比例的肥料耐高温性能，尤其是在高于80℃时具有明显的降低，更尤其是DF7-DF8和DF11-DF16降低更为明显，此时的菌落耐高温性能显著降低，这应该是由于步骤S2中pH值改变和步骤S3中的温度差值改变而导致了其菌群发育存在缺陷所致。

C、储存稳定性的考察

将各个实施例和对比例在得到不同的枯草芽孢杆菌肥料后，常温下避光保存一定的时间，并分别考察不同时间时的活菌数，并与初始活菌数进行计算，从而得到不同储存时间后的存活率，结果见下表8。

其中，相同组别的多个肥料均取其平均数。

表8

由此可见：1、本发明方法得到的F1-F3具有优异的储存稳定性，从而可以储存更长时间；2、而对比例肥料的储存稳定性则有明显的降低，尤其是DF4-DF8和DF11-DF13降低最为显著，这证明步骤第一和第二液体培养基的交叉使用、步骤S2中pH值选择和步骤S3中的温度差值改变都能不可预测地影响最终性能。

由上述A-C中的数据可见，本发明方法得到的微生物肥料具有优异的多种性能，在肥效、耐高温和储存稳定性方面均能取得最好的效果，从而可应用在庄稼、蔬菜、水果、花卉或苗木等的种植和/或培育中，在农业领域具有良好的应用前景和潜力，具体见如下。

种植培养性能考察

I、玉米种植增产考察

按照每100平方米作为一块实验地(玉米品种为良玉99)，划分为对照组、化学组、微生物肥料组，具体如下：

对照组：不使用任何肥料。

化学组：施用正常的化学肥料，即N、P、K肥，可使用5kg氯化铵、5kg硫酸钾和3kg磷酸铵进行施肥。

微生物肥料组：分别使用5kg本发明实施例或对比例的微生物肥料(每个实验地仅使用一种微生物肥料)，并辅加化学组1/4量的相同比例的N、P、K肥。

按照正常的田间管理并收获后，折算成亩产产量，结果见下表9。

表9

由此可见，本发明的微生物肥料F1-F3具有最为优异的增产效果，相对于化学组增产了>10％，其它对比肥料虽然要明显地低于F1-F3，但仍显著优于化学组，也取得了良好的增产效果。

II、兰花栽培考察

收集腐殖土(有机质2.9％，硝态氮187.2mg/kg，有效磷100.3mg/kg，有效钾87.5mg/kg，pH值为6.2)作为培育基土，对照组仅仅使用该基土，微生物肥料组则分别使用质量比10:1的所述基土与各个微生物肥料的混合物(每株兰花仅使用一种微生物肥料)，进行同样的栽培模式和日常管理。

在兰花幼苗栽培后每2天或3天记录其生长性状，分别考察在30天、60天和140天后的生长形态(例如叶片颜色和厚度、整体高度、茁壮程度等指标)，结果见下表10。

表10

其中，以对照组的生长形态作为对比基准，将综合形态定义为“+”，然后将微生物肥料组与其进行对比，根据改善的程度而定义为“++”或“+++”，即生长形态的优良程度为：+++>++>+。

由此可见，本发明的F1-F3具有最佳的形态改善，能够使得兰花更为茁壮、叶片更肥厚、颜色更墨绿，而其它对比微生物肥料则随着时间的延长，对于形态的改善要差于F1-F3，尤其是DF4-DF8，在第60天时已经差于F1-F3。

综上所述，本发明提供了一种枯草芽孢杆菌微生物肥料及其制备方法，所述制备方法通过独特的多个技术特征之间的相互组合和协同，从而得到了具有优异技术效果的最终枯草芽孢杆菌微生物肥料，能够满足农业技术领域的广泛需求，具有良好的应用前景和工业化生产潜力。

应当理解，这些实施例的用途仅用于说明本发明而非意欲限制本发明的保护范围。此外，也应理解，在阅读了本发明的技术内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动、修改和/或变型，所有的这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的保护范围之内。