日本人戊型肝炎病毒多核苷酸探针和引物,检测芯片、试剂盒,以及检测方法

专利名称：日本人戊型肝炎病毒多核苷酸探针和引物,检测芯片、试剂盒,以及检测方法
技术领域：
本发明涉及戊型肝炎病毒的新型检测方法。本发明涉及为确立这种新型检测方法中重要的由日本人身上分离出的新型戊型肝炎病毒株和新型的重症戊型肝炎株，以及来自它们的多核苷酸。
背景技术：
在感染患者的肝脏中增殖的戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus；以下记作「HEV」，不是由血液，而是随粪便排泄出。因此，HEV的感染形式主要是经口感染。为此，水系污染时常发生，有时也见到局部地区发生。由于这样的感染形式，由HEV引发的戊型肝炎，主要是经常多发在亚洲和非洲等卫生环境恶劣区域。而在日本和欧美等发达国家内，这种HEV感染却极少，偶而发现的大多是戊型肝炎案例，多见于在流行地渡假旅游归国的旅游人员。因此，「戊型肝炎＝进口感染症」的想法已形成一般共识。
HEV，在1990年，由美国GenLabs公司的ライエス等，在世界上首次进行基因克隆，随后，已明确合成HEV基因组的全碱基序列。他们进行解析的HEV株是墨西哥株和缅甸株。后来，接着明确印度株、巴基斯坦株、尼泊尔、缅甸株、中国株和美国株等基因碱基序列。然而，「日本株」的报导却未见到。
以前诊断HEV感染采用以下方法。即，根据上述各种已知的HEV株碱基序列，使用设定的引物进行PCR法检测病毒基因的方法，和根据已知HEV株的氨基酸序列，将合成肽和表达蛋白质用作抗原，检测与其相对抗体的方法等。
假如在检查对象中存在与已知HEV株属于不同系统的未知HEV株时，使用以前的技术，有可能检测不出它的病毒。
发明公开本发明的目的是提供一种能广泛检测属于多种系统HEV的方法。本发明的另一目的是提供一种为广泛检测属于多种系统HEV的多核苷酸，和一种为确定被检测HEV系统的多核苷酸。
本发明的另一目的是提供来自日本固有的新型HEV株的多核苷酸和来自新型HEV重症肝炎株的多核苷酸，以及由这些碱基序列编码的多肽。
本发明的另一目的是通过利用以上新型HEV的基因信息和以前公知的HEV基因信息，实现药物设计的方法。
发明者们根据最初从日本人患者身上分离出的HEV株，即HEV Japan JRA1株、JKN-Sap株、JMY-Haw株、JKK-Sap株和JAK-Sai株，由重症肝炎病例分离出的新型HEV株的HEV Japan JSN-EH株，以及确定它们的病毒基因组的序列，完成了本发明。
根据本发明的第1种方案，提供的多核苷酸探针是为检测戊型肝炎病毒多核苷酸的，至少含有8个核苷酸连续序列的多核苷酸探针，具有以下特征(1)至少由8个核苷酸形成的连续序列，用于与上述戊型肝炎病毒的多核苷酸进行杂交，根据这种杂交检测戊型肝炎病毒；(2)该至少8个核苷酸的连续序列是从序列号11、序列号44、序列号45、序列号46、序列号47和序列号48以及它们的互补链中选出的序列获得的；根据本发明的第2种方案，提供的一对乃至数对的PCR用引物，是为将戊型肝炎病毒的多核苷酸进行扩增的1对乃至数对的PCR用引物，该1对乃至数对的PCT引物各自单独含有至少8个核苷酸的连续序列，具有以下特征；(1)至少由8个核苷酸形成的连续序列是用于与上述戊型肝炎病毒的多核苷酸进行杂交，根据这种杂交将戊型肝炎病毒的部分多核苷酸进行扩增的序列；(2)该至少8个核苷酸的连续序列是从序列号11、序列号44、序列号45、序列号46、序列号47和序列号48，以及它们的互补链中选出的序列获得的。
根据本发明的第3种方案，提供检测样品中戊型肝炎病毒的存在的方法，包括如下步骤(1)由对象获得样品(2)使第1种方案中记载的多核苷酸探针与由上述(1)得到的样品进行反应、(3)检测由上述(2)反应生成的双链、(4)从上述(3)的检测结果，判断上述样品中是否存在戊型肝炎病毒。
根据本发明的第4种方案，提供检测样品中戊型肝炎病毒的存在的方法，包括如下步骤
(1)由对象获得样品、(2)将第2方案中记载的一对PCR用引物和聚合酶与由上述(1)得到的样品，在适宜获得扩增的条件下进行反应、(3)检测由上述(2)反应得到的扩增产物存在、(4)由上述(3)的检测结果，判断上述样品中是否存在戊型肝炎病毒。
根据本发明的第5种方案，提供确定样品中戊型肝炎病毒基因型的方法，包括以下过程(1)使样品与权利要求12记载的一对PCR用引物和聚合酶，在可适宜扩增的条件下进行反应、(2)确定由上述(1)反应得到的扩增产物长度，(3)由上述(2)的结果，判断上述样品中存在的戊型肝炎病毒的基因型。
根据本发明的第6种方案，提供具有第1种方案中记载多核苷酸探针的探针化验试剂盒。
根据本发明的第7种方案，提供具有第2种方案中记载PCR用引物的探针化验试剂盒。
根据本发明的第8种方案，提供固定了第1种方案中记载的多核苷酸探针的检测碱基序列用芯片。


图1是戊型肝炎病毒株系统树的示意图。
图2是HEV JRA1基因地图的示意图。
图3A和图3B是HEV JRA1的部分碱基序列和墨西哥株的部分碱基序列的比较示意图。
图4A和图4B是继图3A和图3B的HEV JRA1的部分碱基序列和墨西哥株的部分碱基序列的比较示意图。
图5A和图5B是继图4A图4B的HEV JRA1的部分碱基序列和墨西哥株的部分碱基序列的比较示意图。
图6是本发明方案的引物和探针示意图。
图7是HEV JSN-FN的部分碱基序列和墨西哥株的部分碱基序列的比较示意图。
图8是继图7，HEV JSN-FN的部分碱基序列和墨西哥株的部分碱基序列的比较示意图。
图9是继图8，HEV JSN-FN的部分碱基序列和墨西哥株的部分碱基序列的比较示意图。
图10是继图9，HEV JSN-FN的部分碱基序列和墨西哥株的部分碱基序列的比较示意图。
图11是继图10，HEV JSN-FN的部分碱基序列和墨西哥株的部分碱基序列的比较示意图。
图12是继图11，HEV JSN-FN的部分碱基序列和墨西哥株的部分碱基序列的比较示意图。
图13是各种HEV株的ORF区域比较示意图。
图14是HEV株的系统树示意图。
图15是各种HEV株的ORF1序列比较示意图。
图16是继图15的各种HEV株的ORF1序列比较示意图。
图17是继图16的各种HEV株的ORF1序列比较示意图。
图18是继图17的各种HEV株的ORF1序列比较示意图。
图19是来自某患者血清样品中存在的HEV的RNA，和肝功能检查数值变化的示意图。
图20是对按照本发明方案使用引物所得非A、B、C急性肝炎患者的样品，检测HEV结果的示意图。
图21是根据本发明的方案，对某患者连续检测HEV结果的示意图。
图22是根据本发明的方案，以电泳检测扩增的HEV结果的示意图。
图23A到图23E是探针的种类和HEV基因型和吸光度的关系示意图。
实施发明的最佳方案I.用语本文中使用的「多核苷酸」术语，是为简便起见对多核苷酸和寡核苷酸的总称，所谓「多核苷酸」是指利用磷酸酯键将2个以上核苷结合形成的物质。在核苷中含有脱氧核苷和核糖核苷，但不限于这些。所谓「寡核苷酸」是指数个到数十个核苷的磷酸酯(即，核苷酸)用磷酸二酯键聚合的物质，包括寡核糖核苷酸和寡脱氧糖核苷酸，但不限于这些。本发明的方案的多核苷酸，可以是由HEV JRA1株分离的病毒基因组RNA，也可以是原本的DNA等。所谓本发明中的「多核苷酸」也指肽核酸、吗啉代核酸、甲基磷酸酯核酸、S-寡核酸等人工合成核酸。
本文中使用的「多肽」术语，是表示由2个以上的氨基酸形成的肽、寡肽和蛋白质。并不限定这些，包括合成肽和表达蛋白质两种，可以是只由氨基酸形成的单纯蛋白质，也可以是含有除氨基酸以外的构成成分的复合蛋白质。
本文中使用的「对象」术语，虽然可以是包含人类、狗、猫、牛、山羊、猪、绵羊、及猴等任意的哺乳动物个体，但最好的对象是人类。
本文中使用的「样品」术语，是指从生物个体上采取的血液、血清、淋巴液和组织等生物试样。「样品」也可以是根据需要，对生物试样进行均化和提取等必要的任意前处理，得到的试样。这种前处理，可由本领域人员根据作为对象的生物试样适当选择。
本文中使用的「可读框」是指对多肽进行编码的多核苷酸序列区域。该区域的意思是编码序列的一部分或编码序列的全部分。
本文中使用的「戊型肝炎病毒」术语是指通过消化道，以饮用水为媒介，主要发生在亚洲和非洲的流行性非甲非乙型肝炎的主要成因病毒。是RNA病毒，分类于杯状病毒科杯状病毒属。本说明书中的HEV术语，是总括表示属于一般使用的分类基因型I、II、III和IV病毒的术语。根据本发明的方案时，可以对虽然属于HEV但还没有分离和/或鉴定株进行检测和/或鉴定或分型。因此，此处使用的HEV术语中，也可含有未知HEV和可根据本发明的方案检测和/或鉴定或分型的病毒。此处所说的「HEV」包括野生型、变异株、和HEV的近缘株等。特别是对序列号1中所示JRA1的5′端侧约2500碱基序列具有约50％以上，好的60％以上，更好65％以上同源性的株。
II.新型戊型肝炎病毒株本发明者们着眼于虽说在日本是稀少的，即使没有海外旅游经历的人中也往往能见到的戊型肝炎发病，假设存在HEV日本固有株。在此假定下，对有些日本人急性肝炎患者试验HEV的基因克隆。结果成功地分离出5株认为属于新型系统的HEV株。
这些新型HEV株，本发明者们合计命名了5种株，即，HEV Japan JRA1株(Hepatitis E virus Japan JRA1、以下记作JRA1株、NCBI accessionno.AP003430)、HEV Japan JKN-Sap株(Hepatitis E virus、以下记作JKN-Sap株、NCBI accession no.AB074918)、HEV Japan JMY-Haw株(Hepatitis E virus.以下记作JMY-Haw株，NCBI accession no AB074920)、HEV Japan JKK-sap株(Hepatitis E virus.以下记作JKK-Sap株、NCBI accession no.AB074917)和HEV Japan JAK-Sai株(Hepatitis E virus，以下记作JAK-Sai株，NCBIaccession no.AB0714915)。各个病毒的来源，JKK-sap、JKN-Sap和JMY-Haw3株来自住在北海道的急性戊型肝炎患者，JAK-Sai株来自住在琦玉的急性戊型肝炎患者，JRA1株来自东京的患者。
本发明者们从重症肝炎病例分离出新型HEV株的HEV JSN-FH株(HepatitisE virus。以下记作JSN-FH株)。
将JRA1株的基因组RNA序列中可读框1(以下记作ORF1)示于序列号1，全长示于序列号48。
JSN-FH株的基因组RNA序列除去5′端侧的非编码序列的一部分的准全长示于序列号11。JSN-FH株的基因组RNA序列的ORF1和ORF2编码的氨基酸序列，分别示于序列号12和序列号13。
将JKN-Sap株、JMY-Haw株、JAK-Sai株和JKK-Sap株的基因组RNA序列的ORF1的部分，分别示于序列号16、序列号17、序列号20和序列号21。将JKN-Sap株、JMY-Haw株、JAK-Sai株和JKK-Sap株的基因组RNA序列全长，分别示于序列号44、序列号45(准全长)、序列号46(准全长)和47(准全长)。
2.HEV JRA1株(1)HEV JRA1株本发明者们将序列号1中记载的JRA1株的碱基序列，和从世界各地得到的各种已知株比较中，如图1记载的系统树所示，确定属于新型基因型。
与已知株的差异，在基因组5′端约2500碱基中特别显著。如图2所示，在包括HEV-JRA1的一般戊型肝炎病毒基因型中，可读框(以下缩写为ORF)含有ORF1、ORF2和ORF3三个。在ORF1含有该5′端约5000碱基。其下游的基因组区域，即，在含有ORF2和ORF2区域的其他区域。与ORF1相比，株间的保守性相对较高。
该ORF1区域中5′端的约2500碱基序列，示于下述序列表中序列号7的有关JRA1株的部分碱基序列，与ライエス等专利中公开的碱基序列中具有最高同源性的Mexico株(美国专利号5789559的SEQ IDNO-10、NCBI accession no.M74506、示于序列号49)进行比较，其碱基序列的一致度在70％以下，两者序列的比较示于图3A，图3B、图4A、图4B、图5A和5B中。在图3A、图3B、图4A、图4B、图5A和5B中，将上段中HEV-JRA1株的序列，与下段中Mexico株序列的一部分并列示出。其同源性在2432碱基为69.9％。
因此，通过明确这种JRA1株的特异的新型序列，在以前没有打算对其检测，因此检测也是很困难的JRA1株，可很容易地，而且正确地进行检测。进而，关于以前难以检测的其近缘株也能同样进行检测。根据这种新型戊型肝炎病毒株的新型基因组序列确定，本发明的方案中，以下作更详细的说明。
(2)多核苷酸根据本发明的方案1时，提供在JRA1株中是特异的，而且具有新型序列的多核苷酸。例如，这样的序列可以是由5138碱基形成的序列号1的碱基序列表示的多核苷酸。也可以是由该多核苷酸中任何区域的碱基序列表示的多核苷酸片段。例如，可以是由2442碱基形成的序列号7的碱基序列表示的多核苷酸。还可以是这些序列的互补链，也可以是构成该多核苷酸和其互补链的多核苷酸一部分的多核苷酸片段。
上述的多核苷酸也可以是其中的1个或数个核苷酸缺失、置换、或附加修饰的多核苷酸。
根据本发明的方案1时，提供由具有序列号1～7中记载的碱基序列或其互补链，或其任何片段的多核苷酸片段形成的引物和探针。这些引物和探针，例如，在检测对象中用作为检测HEV的各种扩增，例如用作PCR扩增等的引物，或者在所谓的DNA芯片中用作使用的探针。这时，该多核苷酸最好是10～30个核苷酸。多核苷酸片段的长度过长时，难以识别1个核苷酸的不同。多核苷酸的基本长度过短时，很难确定试样中含有的多核苷酸碱基序列。
例如，这样的引物和探针，包括为总括地检测HEV的引物和探针，及为有选择地检测HEV的各种基因型的引物和探针。
图6中示出了JRA1株的碱基序列信息的一部分与在与其相当部位中的已知株的碱基序列信息进行比较的实例。通过对这样的碱基序列进行比较，可明确以下区域，即，为设定可用于总括地检测HEV的引物和探针的高度保守区域，和为有选择地检测HEV的各种基因型的高度变异区域。
此处使用的所谓「高度保守区域」，是指HEV-JRA1株的碱基序列和以前株的碱基序列具有很高同源性的区域，例如，具有90％以上，好的95％以上，更好具有100％的同源性。此处使用的所谓「高度变异区域」是指在HEV-JRA1株中特异的碱基序列，与以前株的序列同源性很低的区域，例如，只有80％以下，好的75％以下，更好70％以下同源性的区域。
图6中示出了检测全部HEV用的引物和探针的设定候补区域实例的从HEV-JRA1株的序列号1的111位到124倍，和与其相当的以前株的区域。例如，作为检测全部HEV用的引物和探针，可将含有序列号2～5中记载的碱基序列或其互补链的多核苷酸用作引物或探针，但是，可用作检测全部HEV用的引物和探针的序列号1的区域，并不限定于此。
同样，图6中示出了有选择的HEV检测用引物和探针的设定候补区域实例的JRA1株的序列号1的353位到371位，和与其相当的以前株的区域。例如，作为有选择的HEV检测用引物和探针，可使用含有序列号1和7中记载的碱基序列或其互补链的多核苷酸，例如含有序列号6或其互补链的多核苷酸作为引物或探针，但可用作有选择的HEV检测用引物和探针的序列号1和7的区域并不限定于此。
根据本发明的方案时，可提供将序列号1～7的多核苷酸或其片段作为其一部分含有的多核苷酸。这样的多核苷酸可以是具有与从启动子、增强子、上游活化序列、沉默基因、上游抑制序列、弱化子、Poly-A尾、核转移信号、ISRE、耐药物性因子、信号肽的基因、跨膜区域的基因、荧光素、绿色荧光蛋白质、藻青蛋白、含有辣根过氧化酶的标记蛋白质的基因等基因中至少选出1种的多核苷酸连接而组成的多核苷酸，也可以是含有其他任意碱基序列的多核苷酸。
(3)多肽根据本发明的方案时，提供由序列号8中记载的氨基酸序列表示的多肽。发明者通过临床的研究，证明该多肽是HEV-JRA1患者早期产生的多肽，对该多肽的抗体也是HEV-JRA1患者早期产生的抗体。因此，也可将该多肽和/或该抗体用作HEV-JRA1的检测用标记。这样的多肽和抗体可利用其自身公知的方法获得。在这种多肽的片段和含其的多肽、以及序列号8中记载的氨基酸序列中，有1个或数个肽缺失、置换、或附加修饰的多肽也包括在本发明范围内。
若根据本方案，例如，在其自身上结合抗体用作检测该抗体的抗体检测用多肽时，若是合成肽，可含有由序列号8中含有的连续的15～50氨基酸残基表示的多肽。若是表达蛋白，可含有序列号8中含有的连续的150～250氨基酸残基表示的多肽。
3.HEV Japan JSN-FH株(1)HEV Japan JSN-FH株如上述，JSN-FH株是从重症肝炎病例分离出的新型HEV株。对重症肝炎和通常的急性肝炎，其治疗方法完全不同。因此，若对重症肝炎早期进行诊断，例如，可在感染后立刻诊断，救活率会增高。然而，在重症肝炎患者中HEV病毒的表达量非常低。因此，在以前，几乎没有从重症肝炎患者分离出HEV的先例，况且，很难研究全长中的序列。尽管这种状况，本发明者们还是成功地从重症肝炎患者分离出HEV，进而确定了该基因组的大概全长(或准全长)。
从重症肝炎患者分离出的HEV基因组，作为全体像也具有唯一的序列。对于由亚克隆得到的一个克隆也曾经报导过一次，认为是点突变(pointmutation)。该变异是在对核壳蛋白进行编码的可读框(ORF2)内产生终止密码子的变异，通常的戊型肝炎病毒株的ORF2是将由编码的660氨基酸形成的翻译产物长度缩短成211氨基酸的变异。即，ORF2的第212号密码子变成了TAA、TAG或TGA中的任何一个终止密码子。
在乙型肝炎的情况下，用对前核·核(Precore-core)区域进行编码的翻译产物以不是全长的变异株感染时，可知该患者形成重症肝炎的概率很高。
图7～图12中示出了JSN-FH株和墨西哥株(M74506)的碱基序列比较。将上段中HEV JSN-FH株的序列与下段中墨西哥株(M74506)的序列并行示出。其同源性在2631碱基为69.4％。
因此，通过明确这种JSN-FH株中特异的新型序列，在以前没有打算对其检测而且因此也很难进行检测的JSV-FH株，可限容易地而且很正确地进行检测。进而关于以前很难检测的其近缘株同样也能进行检测。并暗示出在患者中检测出JSN-FH株时，随后就可能发展成重症肝炎。
(2)多核苷酸根据本发明的方案1时，提供了在JSN-FH株中是特异的，而且具有新型序列的多核苷酸。例如，这样的序列可以是由7234碱基形成的序列号11的碱基序列表示的多核苷酸。也可以是由该多核苷酸中任何区域的碱基序列表示的多核苷酸片段。例如，也可以是由238碱基形成的序列号22的碱基序列表示的多核苷酸。进而，也可以是这些序列的互补链，也可以是构成该多核苷酸和其互补链的多核苷酸一部分的多核苷酸片段。
特别是，作为用于检测在其ORF2中是否是具有终止密码子的株的多核苷酸，也可提供具有序列号9和10中记载碱基序列的多核苷酸或其互补链，或具有其任何片段的多核苷酸片段。并由此也可提引物和探针。序列号9和10中记载的碱基序列是JSN-FH株的ORF2的一部分序列。序列号9中记载的碱基序列是可特异检测出无终止密码子株的序列。序列号10中记载的碱基序列是可特异检测出具有终止密码子株的序列。含有为使含有该部分的碱基扩增的碱基序列的引物也在本发明范围内。对由对象采取的试样中所含核酸的ORF2中没有以全长获得翻译产物的序列进行检测，将其为基础，检测对象受ORF3中具有这种终止密码子的病毒株进行感染，可诊断出感染早期就受到重症肝炎病毒感染。
上述的多核苷酸也可以是其中的1个或数个核苷酸缺失、置换、或附加修饰的多核苷酸。
进而，根据本发明的方案1时，提供由具有序列号11和22中记载碱基序列或其互补链，或其任何片断的多核苷酸片段形成的引物或探针。这些引物和探针，例如，可用检测对象中检测HEV的各种扩增，例如PCR扩增的引物，也可用作所谓DNA芯片中使用的探针。这时，该多核苷酸最好是10～30个核苷酸。当多核苷酸片段的长度过长时，很难识别1个核苷酸的不同。多核苷酸的基本长度过短时，很难确定试样中所含多核苷酸的的碱基序列。
根据本发明的方案时，提供将序列号11、22、9和10的多核苷酸或其片段作为其一部分含有的多核苷酸。这样的多核苷酸可以是具有与从启动子、增强子、上游活化序列、沉默基因、上游抑制序列、弱化子、Poly-A尾、核转移信号、ISRE、耐药物性因子、信号肽的基因、跨膜区域的基因、荧光素、绿色荧光蛋白质、藻青蛋白、含有辣根过氧化酶的标记蛋白质的基因等基因中至少选出1种的多核苷酸连接而组成的多核苷酸，也可以是含有其他任意碱基序列的多核苷酸。
(3)多肽根据本发明的方案时，提供由序列号12和序列号13中记载的氨基酸序列表示的多胝。序列号12中记载的氨基酸序列是与JSN-FH株的基因组序列的ORF1区域相对应的序列。序列号13中记载的氨基酸序列是与JSN-FH株的基因组序列的ORF2区域相对应的序列。
也可将多肽和/或该抗体用作JSN-FH的检测用标记。这样的多肽和抗体可利用其自身公知的方法获得。在这种多肽的片段和含该片段的多肽，及序列号12或序列号13中记载的氨基酸序列中，1个或数个肽缺失、置换或附加修饰的多肽也包含在本发明范围内。
根据本方案，例如，在其自身上结合抗体，用作检测该抗体的抗体检测用多肽时，若是合成肽，可含有由序列号12或13中所含的连续的15～50氨基酸残基表示的多肽。若是表达蛋白，可含有由序列号12或13中所含的连续的150～250氨基酸残基表示的多肽。
由序列号12表示的ORF1是对复制病毒粒等所需要的各种酶蛋白进行编码的区域。因此，不仅对序列号12的一级结构，对其二级结构和/或三级结构的数据，例如，可利用X射线衍射等其自身公知的方法获得，也可将该数据作为基础进行药物设计。这种药物设计自身和利用该药物设计得到的药剂也包含在发明范围之内。
也可用其自身公知的方法进行制造来自由序列号13表示的ORF2的、缩短的核壳蛋白的特异抗体。若利用使用这种抗体的抗原抗体反应，用于从对象采取的样品，可很容易地诊断HEV感染。
也可根据其自身公知的方法制作识别核壳蛋白的抗体的抗体。使用这样的抗体，使用从对象采取的样品，也能很容易地诊断HEV感染。
4.新型HEV株和以前的HEV株比较图13表示对各种ORF位于基因组序列的什么位置，在HEV缅甸B1株(M73218)、HEV墨西哥株(M74506)、HEV美国US-1株(AF060669)、HEV日本JRA1(AP003430)、基因型4，和HEV日本JSN-FH之间的比较结果。在各个株名后记在括号内的号是NCBI accession no.。本说明书中记载的各株名的「HEV」作了省略(例如，将HEV USA US-1株，记作「USA US-1株」)。
各株名的右邻括号内示出的罗马数字表示各株所属的基因型。如图13所示，JSN-FH株，在ORF2内存在终止编码子TGA。
图14中示出了将ORF1的326nt区域作为基础，制作成含有本发明5种新型株的7种日本固有株和日本以外国家中见到的HEV株的系统树(根据neighbor-joining method)。如其中所示，JMM-Sai分型在I型内，JKN-Sap、JHA-Sap和JMY-Haw分型在III型内，JSY-Sap、JKK-Sap和JAK-Sai分型在IV型内。
图15～图18中，关于ORF1区域的碱基序列信息，为了比较本发明的方案1的日本固有株5种{Japan JRA1株(序列号15)，JKN-Sap株(序列号16)、JMY-Haw株(序列号17)、JKK-Sap株(序列号21)和JAK-Sai株(序列号20)}和来自重症肝炎患者的株(JSH-FH株，序列号22)、及以前公知的外国株{USAUS-1(AF060669、序列号18)、猪(Swine)HEV(AF082843、序列号19)、中国型4(AJ272108，序列号23)、缅甸B1(M73218、序列号24、中国维吾尔(ChinaUigh)(D11093、序列号25)、中国河北(M94177、序列号26)、中国新疆(D11092、序列号27)、尼泊尔(AF051830、序列号28)、印度FH株(X98292、序列号29)、巴基斯坦SAR55(M80581、序列号30、墨西哥(M74506、序列号31))并列示出。
从图15～图18中，示出了株名和株名右的括号内示出的NCBI auession no.在其右侧示出了碱基序列信息。记在序列左右的号，表示将转录开始部位取为1时各个核苷酸的号。将最上段的JRA1株作为标准，对于其他株的特定位置的碱基种类与该位置的JRA1株的碱基种类等同时，表示「.」，不同时，记下该碱基的种类。在最下段，表示记住的数个配位中序列的保守性。即，特定位置所有株的序列相等时，最下段表示「*」，即使1个株不同时，表示为「.」。
这样的新型株及其碱基序列全在本发明范围之内。
(2)多核苷酸根据本发明的方案1，在JKN-Sap、JMY-Haw、JKK-Sap和JAK-Sai株中，都是特异的，而且提供了具有新型序列的多核苷酸。例如，这样的序列，可以是由表示JKN-Sap、JMY-Haw、JKK-Sap和JAK-Sai株的基因组序列的序列号44、序列号45、序列号46和序列号47的碱基序列表示的多核苷酸。也可以是这些序列的互补链，也可以是构成该多核苷酸及其互补链多核苷酸一部分的多核苷酸片段。
也可以是由该多核苷酸任何区域的碱基序列表示的多核苷酸片段。也可以是由对ORF1区域进行编码的碱基序列的序列号16、序列号17、序列号20和序列号21的碱基序列表示的多核苷酸。也可以这些序列的互补链，也可以是构成该多核苷酸和其辅链多核苷酸一部分的多核苷酸片段。
例如，含有使含有序列号16、序列号17、序列号20和序列号21碱基序列的碱基扩增用的碱基序列引物也是本发明范围内的。
上述多核苷酸也可以是其中1个或数个肽缺失、置换或附加修饰的多核苷酸。
根据本发明的方案1时，可提供由具有序列号44、序列号45、序列号46和序列号47中记载的碱基序列或其互补链、或具有其任何片段的多核苷酸片段形成的引物和探针。这些引物和探针，例如，可以用作检测对象中为检测HEV的各种扩增，如PCR扩增等的引物，或者用作所谓DNA芯片中使用的探针。这时，该多核苷酸最好是10～30个核苷酸。多核苷酸片段过长时，很难识别1个核苷酸的不同。基本上多核苷酸的长度过短时，很难确定试样中所含多核苷酸的碱基序列。
根据本发明的方案时，可提供将序列号44、序列号45、序列号46和序列号47，及序列号16、序列号17、序列号20和序列号21的多核苷酸或其片段作为其一部分含有的多核苷酸。这样的多核苷酸可以是具有与从启动子、增强子、上游活化序列、沉默基因、上游抑制序列、弱化子、Poly-A尾、核转移信号、ISRE、耐药物性因子、信号肽的基因、跨膜区域的基因、荧光素、绿色荧光蛋白质、藻青蛋白、含有辣根过氧化酶的标记蛋白质的基因等基因中至少选出1种的多核苷酸连接而组成的多核苷酸，也可以是含有其他任意碱基序列的多核苷酸。
(3)多肽根据本发明的方案时，可提供由JKN-Sap、JMY-Haw、JKK-Sap和JAK-Sai株中特异的序列号44、序列号45、序列号46和序列号47、及序列号16、、17、20和21中记载的多核苷酸序列进行编码的氨基酸序列表示的多肽。进而可提供由JKN-Sap、JMY-Haw、JKK-Sap和JAK-Sai株中表示各特异ORF1区域的氨基酸序列的序列号50、序列号52、序列号54和序列号56，和表示ORF2区域的氨基酸序列的序列号51、序列号53、序列号55和序列号57的氨基酸序列，表示的多肽和其片段。
来自ORF1区域编码氨基酸序列的多肽，为了药物设计可以利用。
来自ORF2区域编码氨基酸序列的多肽，也可为了制作检测各株的抗体使用，也可将其自身作为抗原进行检测而使用。也可利用它制作疫苗。
若根据本方案，例如，在其自身上结合抗体用作检测该抗体的抗体检测用多肽时，若是合成肽，可含有由来自各个新型株的碱基序列的0RF2区域表示的氨基酸序列，例如由序列号51、序列号53、序列号55或57中含有的连续的15～50氨基酸残基表示的多肽。若是表达蛋白，可含有由序列号51、53、55或57中含有的连续的150～250氨基酸残基表示的多肽。
也可将该多肽和/或该抗体用作HEV JKN-Sap、JMY-Haw、JKK-Sap和JAK-Sai检测用标记。这样的多肽和抗体可利用其自身公知的方法获得。在这样的多肽片断和含该片段的多肽、及从序列号50～57中记载的氨基酸序列中，1个或数个核苷酸缺失、置换或附加修饰的多肽也包含在本发明范围内。
根据本方案，例如，在其自身上结合抗体用作检测该抗体的抗体检测用多肽时，若是合成肽，可含有由序列号8中含有的连续的15～50氨基酸残基表示的多肽。若是表达蛋白，可含有由序列号8中含有的连续的150～250氨基酸残基表示的多肽。
5.检测全部HEV用的引物和探针如上述，通过发现新型的HEV株对其序列特定，可提供对包括未知株的更广泛的HEV能一次扩增的引物，即，万能引物(即，检测全部HEV用的引物)、和对包括未知株的更广泛的HEV能一次检测的探针(即，检测全部HEV用的探针)。关于这样的万能引物以下进行说明。
图15～图18中，列出了属于型I、II、III和IV的代表性HEV株的ORF1序列。表中株名右的括号内记号是NCBI accession no.。记在序列左右的号，表示将转录开始部位取为1时各个核苷酸的号。
所谓「万能引物」或「万能探针」是指含有可全部检测未知株中所含HEV的碱基序列核酸的多核苷酸片段。例如，这种万能引物的碱基序列，可从图15～18所示序列中选择。例如，这样的序列最好是高度保守区域。
此处使用的所谓「高度保守区域」，表示HEV-JRA1株的碱基序列与以前株的碱基序列同源性很高的区域，例如，具有90％以上，好的95％以上，更好100％同源性的区域。
图15～18中，示出了将JSN-FH株的碱基序列信息的一部分与其相当部位中已知株的碱基序列信息进行比较的实例。通过这种碱基序列比较，可明确对全部检测HEV设定引物和探针的有用的高度保守区域，和可选择地检测HEV的各种基因型的高度变异区域。
图15～图18中示出了检测全部HEV用的引物和探针的设定候补区域实例。图15中的(1)区域，即，HEV-JRA1株的序列号15的19位到37位、与其相当的以前株的区域；图16中的(4)区域，即，HEV-JRA1株的序列号15的111位到127位，与其相当的以前株的区域；图17中的(5)区域，即，HEV-JRA1株的序列号15的174位到181位，与其相当的以前株的区域；图17中的(6)区域，即，HEV-JRA1株的序列号15的213位到220位，与其相当的以前株的区域，是高度保守区域的最好例。
全部HEV检测用的引物，最好将具有图15的(1)区域中所含序列的6碱基到100碱基、更好15碱基到25碱基的多核苷酸用作有义引物。与这种有义引物的同时，好的将具有图15的(4)、(5)和/或(6)区域中所含序列的6碱基到100碱基、更好15碱基到25碱基的多核苷酸用作有义引物。
图15和16的(7)区域，即，HEV JRA1株的序列号15的48位到100位，与其相当的以前株的区域，也可用作检测全部HEV用的引物群。这时，(7)区域的全长序列，不一定全需要，可使用从(7)区域中选择的6碱基到25碱基，最好15碱基到22碱基的连续序列。例如，全部HEV检测用的最好引物实例，如下所示5′-gcagaccacrtatgtgktcg-3′(序列号32)、5′-ccacrtatgtggtcgaygcc-3′(序列号33)、5′-acmarctgscgrggytgcat-3′(序列号34)、5′-cgytgratwggrtgrttcca-3′(序列号35)、5′-tgktcgaygccatggaggc-3′ (序列号36)、5′-tgktcgaygccatggaggc-3′ (序列号37)、5′-aygccatggaggcccaycag-3′(序列号38)、5′-ckracyaccacagcattcgc-3′(序列号39)和5′-ggcckracyaccacagcatt-3′(序列号40)和。
此处，说明书中的「a」或「A」表示腺嘌呤，「c」或「C」表示胞嘧啶，「g」或「G」表示鸟嘌呤，「t」或「T」表示胸腺嘧啶、「r」或「R」表示G或A、「y」或「Y」表示T或U或U、「w」或「W」表示A或T或U。
这些检测全部HEV用的引物组，例如，分成以下2个阶段在解析中使用更好。例如，将上述序列号32和序列号33用作有义引物，进而，将序列号34和序列号35用作反义引物，在第1次扩增中使用。接着，将上述序列号36、序列号37和序列号38作为有义引物，进而，将序列号39和序列号40作反义引物，进而第2次扩增。这样，可获得来自广泛未知HEV变异株的多核苷酸片段。进而将得到的扩增产物利用碱基电泳等自身公知的方法进行解析。之后，对得到的多核苷酸片段进行分型。
将上述序列用作探针时，检测全部HEV用探针，可以将从该序列含有图15的(1)区域内所含连续的序列的6个碱基到100个碱基，更好从12个碱基到25个碱基的多核苷酸作用探针。同样也可将从该序列含有图15的(4)、(5)和/或(6)区域所含连续序列的6碱基到100碱基，更好从12碱基到25碱基的多核苷酸用作探针。
虽然以上示出了检测全部HEV用的引物实例，但并不仅限于此。
6.分型用的核苷酸序列如上所述，若选择高度保守区域序列，可得到检测全部HEV用引物和探针，利用它可检测全部的病毒。对其，另一方面，若选择高度变异区域的序列，可得到有选择的HEV检测用引物和探针。进而通过使用这样的序列，可有选择地检测和/或鉴定病毒。
此处使用的所谓「高度变异区域」，表示在HEV JRA1株中特异的碱基序列中，与以前株的序列同源性很低，例如，只有80％以下，好的75％以下，更好70％以下同源性的区域。
图15、16、17和18中示出了有选择的HEV检测用引物和探针的设定候补形成区域实例。例如，图15的(2)区域，即，HEV-JRA1株的序列号15的52位到69位，与其相当的以前株的区域；图16中(3)区域，即，HEV-JRA1株的序列号15的77位到95位，与其相当的以前株的区域，都是高度变异区域的最好实例。
例如，图15的(2)区域是根据基因型其碱基序列改变的区域。进而，该(2)区域，每个基因型分成3部分。即，将图中付与「III」记号的部分中含有的株为III型，付与「IV」的部分为IV型，付与「I，II」的部分是包括I型和II型的部分。对于图16的(3)区域也一样。每个这样的基因型，利用不同的特定部位的碱基种类，可进行对要解析的HEV分型。
将上述序列用作探针时，可选择的HEV检测用探针，可将从该序列中含有图15的(2)区域的连续序列6碱基到100碱基，更好从12碱基到25碱基的多核苷酸用作探针。同样，也可将从该序列中含有图16的(3)区域的连续序列的6碱基到100碱基，更好12碱基到25碱基的多核苷酸用作探针。
在将上述序列用作引物时，可选择的HEV检测用引物，可将从该序列含有图15的(2)区域所含的连续序列的6碱基到100碱基，更好从12碱基到25碱基的多核苷酸用作引物。同样，也可将从该序列含有图16的(3)区域所含的连续序列的6碱基到100碱基，更好从12碱基到25碱基的多核苷酸用作引物。或者，选择可对至少含有图15的(2)区域和/或图16的(3)区域的多核苷酸进行扩增的引物。
5.HEV病毒检测方法根据本发明的另一方案时，本发明提供了试样中HEV病毒的检测方法。
此处使用的所谓「试样」是指从生物体采取的血液、血清、淋巴液和组织等，从粪便和尿等排泄物的生物试样，以及从河流和地下水等环境中采取的水和土等环境试样的未处理试样，根据需要，进行均匀和提取等必要的任意前处理的。这样的前处理，由技术人员根据成为对象的试样进行选择。
根据本发明的方案时，HEV病毒检测方法使用上述的引物，可根据利用其自身公知的扩增反应，例如利用聚合酶链反应(一般称作PCR，以下记作PCR)的方法进行。例如，典型的是逆转录PCR、逆转录nested PCR，或其变法，例如，反PCR、5′RACE、3′RACE。
例如，这样的检测方法可按如下进行。首先，向含有戊型肝炎病毒基因组的试样中混合所要求的引物，在适宜PCR条件下，例如，设定温度变化的条件，95℃4分钟之后连续进行30个循环{95℃30秒、55℃30秒、72℃45秒}，然后在最后，以72℃7分钟进行PCR反应。接着，将产物利用电泳、DNA芯片等方法进行解析，通过检测来自戊型肝炎病毒的基因组片段，可检测出戊型肝炎病毒。例如，若是电泳，通过研究有无来自HEV基因组的条带，可检测出来自戊型肝炎病毒的基因组片段。
根据本发明的再一个方案时，HEV病毒检测方法可按如下方法进行，即，使用上述探针，利用其自身公知的杂交反应的检测方法。这时，也可利用所要求的标记物质对该探针进行标记。
通过使用上述的检测全部HEV用引物和探针，可检测全部的病毒，通过使用可选择的HEV检测用引物和探针，可有选择地检测病毒。
例如，通过组合使用了高度保守区域的检测体系，能提高HEV感染的诊断精度。另一方面，使用了高度变异区域的基因型特异检测体系也可有助于感染途径的解明和流行病学研究。也可用来检测输血用血液中的该病毒。还可用来检测来自环境试样中的该病毒。
根据本发明的方案时，该病毒的检测，不仅达到上述核酸的水平，而且也能达到氨基酸的水平。例如，以序列号8等表示的氨基酸序列，和上述多核苷酸一样，可用作HEV存在的标记物。例如，为了全部诊断包括人类在内的生物中的该病毒感染，为了特异诊断基因型等，都可使用。同样，上述的任何氨基序列也可用于这样的目的。
根据上述的本发明的来自HEV-JRA1的基因和多核苷酸是新型物质，使用这些多核苷酸或根据它制作的多肽和抗体来检测HEV的方法，在检测试样中的病毒基因组和病毒抗体等方面，具有高于以往技术的实用性。下述列举实施例具体示出本发明的实用性。
为了提高HEV的检测方法和HEV感染的诊断技术，最好使这种新株的基因碱基在序列信息反映在检测体系和诊断体系内。
8.碱基序列检测用芯片根据本发明的方案时，可提供具有上述多核苷酸的碱基序列检测用芯片。例如，这些是荧光检测用DNA芯片和电流检测型DNA芯片等，但不限于这些。通过使用将上述多核苷酸或其互补链作为探针配置的碱基序列检测用芯片，进行病毒检测，检测方法既简便又有效。碱基序列检测用芯片可按以下顺序制作。
(a)荧光检测用碱基序列检测用芯片的制作根据上述本发明的方案，将多核苷酸或具有其一部分序列的多核苷酸、或具有与这些序列互补的序列的多核苷酸固定在基板上。基板，例如可使用玻璃基板和硅基板等以前使用的任何基板。固定方法，可使用点测位仪(Spotter)等方法，使用一般的半导体技术的方法等，使用本技术领域人员公知的方法，进行固定。
(b)电流检测型碱基序列检测用芯片的制作根据上述本发明的方案，将多核苷酸或具有其一部分序列的多核苷酸、或具有与这些序列互补助序列的多核苷酸，通过共价键、离子键、物理吸附或化学吸附等，固定在基板上，如电极基板上。电流检测型DNA芯片的实例，是平成8年10月24日注册的特许号第2573443号中的基因检测装置，但不限于此。本发明引用该文献作为本发明的一部分。
根据本发明的方案，使用具有多核苷酸类的探针和基因序列检测用芯片，进行病毒检测，可既简便又有效地进行其检测。
9.蛋白质芯片根据本发明的方案1时，可提供能简便实施上述检测方法的蛋白质芯片。这种蛋白质芯片，是将识别上述多肽的抗体作为探针而配置的。利用这种蛋白质芯片，可简便有效地检测试样中的HEV。对于蛋白质芯片，有荧光检测用蛋白质芯片(一般也称作荧光色素型蛋白质芯片)、和电流检测型蛋白质芯片(一般也称作电位型蛋白质芯片)等，并不限于此。以下示出了其制作顺序实例。
(a)荧光检测用蛋白质芯片的制作预先制备该多肽的单克隆抗体，将其固定在基板上。基板，例如可以是玻璃基板和硅基板等以前使用的任何基板。固定方法，使用点测位仪等方法等、利用一般的半导体技术的方法等，也可选择其自身公知的任何方法。为进行检测的标记物，可使用荧光物质、放射性同位素和色素等。
(b)电流检测型蛋白质芯片的制作预先制作多肽的单克隆抗体，将其相对于一般电流检测型DNA芯片用的基板，进行固定制造。
根据本发明的方案，若使用具有上述抗体的蛋白质芯片进行病毒检测，该检测可简便有效进行。
改变上述抗体，制作将上述多肽固定在基板上的芯片，用该芯片，也可用于对该多肽进行检测的抗体。
10.诊断体系使用根据上述的本发明形态的新型HEV株及多核苷酸和多肽，可诊断对象是否感染了HEV，和/或感染的是那一基因型，和/或对象是否感染了重症HEV。
这样的诊断方法，例如，首先，用其自身公知的方法从对象采取样品根据需要进行样品精制和核酸扩增，进行精制得到核酸试样。接着，使用根照本发明的多肽，例如，通过检测有无标记的序列的扩增，检测有无杂交，可进行最终目的诊断。将根据上述本发明的多肽用作抗体检测用多肽，通过利用抗原抗体反应，进行最终目的诊断。
11.预防用疫苗根据本发明的方案1，可提供对HEV的疫苗。这样的疫苗，可用来自含有对根据本发明新型HEV病毒碱基序列进行编码的核酸的来自HCV的免疫原性多肽的1种或多种的多肽进行调制。例如，可使用上述任何新型株的ORF2区域的多肽。制造含有免疫原性多肽的疫苗，可使用其自身公知的任何方法。
12.药物设计来自上述新型HEV的基因信息，可用于抗病毒剂的开发和改进。例如，使用一般称作「宿主基因组药物从头设计」的其自身公知的药物设计法，可按以下方法进行。
(1)利用表达蛋白质的X射线晶体解析和/或NMR解析，实际测量对HEV基因组的ORF1进行编码的多个酶蛋白质的三维结构。或者，只根据氨基酸序列信息，在计算机上进行模拟得到酶蛋白质的三维结构。以这些信息为基础探索可成为药物靶点的区域(以下记作「受体区域」)的候补。
(2)将以下化合物(以下记作「配体」)各自的三维结构输入计算机，即，已判明抑制HEV ORF1蛋白质酶活性的药物，已合成但抑制效果仍不清楚的化合物、已知结构式仍未合成的化合物，和具有新型结构式的虚构化合物。
(3)使用上述(2)的计算机，通过进行三维的拟合解析，确定上述(1)中得到的受体区域候补和上述(2)中得到的配体，是否能发生三维结合。由此选择与受体区域的有效组合。或者，为具有更有效的拟合状态，利用计算机对配体侧的分子进行模拟改造。
(4)利用上述(3)的步骤获得(即由上述步骤选择或改造的)的配体，得到有效抑制或阻止HEV增殖的抗病毒剂。
HEV是富有多样性的病毒。因此，为了对这种HEV全部株(或者，尽可能多的株)开发和/或改进能发挥等同有效性的抗病毒剂，必须获得现存全部(或尽可能多的)HEV株的碱基序列信息。根据上述的本发明一个侧面，对于获得这种碱基序列信息，可提供有利的效果。
这样的利用，对来自上述任何新型HEV的任何ORF1都可进行。根据这样的方法获得的药物也包含在本发明范围之内。
13.检测试剂盒本发明还可提一套适宜的试剂盒，根据使用目的，将上述本发明任何形态的多核苷酸、多核苷酸片段、多核苷酸探针、多核苷酸引物、多肽、抗原和抗体，以适当的试剂盒提供。例如，多核苷酸和多核苷酸等，为了制造碱基序列检测用芯片，也可将基板和/或各种试剂和/或标记物质等组合，形成一套试剂盒。也可将多核苷酸探针与反应容器和/或缓冲液用盐类和/或其他必要的试剂等组合形成一套试剂盒。例如，在多核苷酸引物时，与反应容器和/或缓冲液用盐类和/或其他必要的试剂，如聚合酶和/或底物等组合形成一套试剂盒。然而根据本发明提供的试剂盒并不仅限于上述组合，根据需要可提供种种用剂和组合的试剂盒。对于使用目的也不仅限于此，也可形成对上述任何目的的试剂盒。这样的试剂盒也包含在本发明范围之内。
以下虽然记载了有关的根据本发明的HEV基因组的检测实例，这种记载仅仅是以例示为目的，并不对本发明范围构成限制。
例1，利用RT-PCR法检测HEV基因组RNA1.引物在本例的RT-PCR中，使用具有从来自序列表中序列号1或2记载HEV-JRA1的碱基序列中选出具有下述碱基序列的4种寡核苷酸引物#HE5-1(5′-TCGATGCCATGGAGGCCCA-3′)(有义，与序列表1的nt19-37对应)(下线部相当于序列表中序列号2)#HE5-2(5′-GCCYTKGCGAATGCTGTGG-3′)(有义，与序列表1的nt105-123对应)(Y＝C或T；K＝G或T)(下线部相当于序列表中序列号3)#HE5-3(5′-TCRAARCAGTARGTGCGGTC-3′)(反义，与序列表1的nt450-469对应)(R＝A或G；)(下线部相当于序列表中序列号4)#HE5-4(5′-CATAGCCTCSGCRACATCAG-3′)(反义，与序列表1的nt541-560对应)(S＝G或C；R＝A或G)(下线部相当于序列表中序列号5)2.检测方法首先，从来自患者的50μL血清用SMITEST EX R&D(Genome ScienceLaboratories)提取核酸。对于该核酸添加反义引物#HE5-4，通过在聚合酶MMLV-RT(Stratagene)的存在下，37℃下反应30分钟，进行cDNA合成(即，从RNA向DNA的逆转录反应)。
接着，对合成的cDNA，用上述4种引物和Fast Start Tag DNA Polymerase(Roche公司)进行nested PCR。温度变化的条件设定，在95℃4分钟之后连续30个循环{95℃30秒、55℃30秒、72℃45秒}，最后72℃7分钟。使用琼脂糖凝胶，对PCR反应产物进行电泳，研究有无365bp长度的来自HEV基因组的带。
3.结果和讨论图7所示是对从日本人急性肝炎患者经时采取的血清样品，利用上述方法检测HEV基因组RNA的结果。图7图中示出了以肝炎过程为象征的肝功能检测数值的变化。图中缩写如下，AST表示天冬氨酸转氨酶，ALT表示丙氨酸转氨酶，Total bilirubin表示总胆红素。图7的照片表示与该图对应时刻从该患者得到的血清中获得PCR产物的电泳结果(即，RT-PCR利用逆转录聚合酶链反应法)。横轴为入院后的天数。
在该病例中，如图7，从发病初期在连续27天以上在血清中连续检测HEV RNA。这是覆盖以前常识的新见解。因为，可以认为在以前的常识中，从HEV RNA出现在血液中到AST、ALT和Total bilirubin达到峰值的时间极短(Purcell，R.H.In FieldsVirology，eds.Fields，B.N.，Knipe，D.M，&Howley，P.M.Lippincott-Raven，Philadelphia，1996，3rd Ed.，Vol.2，pp.2831-2843)。这样的结果暗示出得到根据本发明可以构建的灵敏度极高的HEV基因组RNA的检测体系，进而，暗示出使用这样的检测体系所解析的临床数据，对于有关HEV感染理论的理解会带来更深远的效果，具有相当的实用性。
例2，新型HEV株的分离对7例急性戊型肝炎患者进行试验。分离出的JHA-Sap、JKK-Sap、JKN-Sap、JMY-Haw和JSY-Sap5个实例是住在北海道的患者，分离出的JAK-Sai和JMM-Sai2个实例是住在琦玉县的患者。各个患者的病症，就时间和场所两方面与其他患者无关连性，与局部地区流行也无关连。6例患者最近未出国旅行。只有分离出JMY-Haw的患者，该患者在患病症的1个月前去夏威夷旅行过。来自患者的血清样品，在急性期采取，到进行病毒学解析，保持在-20℃以下冻结。
HEV序列，按照高桥等人的方法(Takahashi K，Iwata K，Watanabe N，etal.Virology 2001；2879-12)，在该方法中加进了若干改进。核酸样品是使用市售核酸提取用试剂盒(SMITEST EX-R&D；Genome Science Laboritories)从25ml血清中提取的。用莫洛尼小鼠白血病病毒逆转录酶(stratagene社制)在37℃30分钟内合成第1股cNDA。作为反义引物，使用HE5-4(5′-CATAGCCTCSGCRACATCAG-3′；NT541-560)和HE5-5(5′-CATYGCCTCSGCAACATCGG-3′；nt541-560；各个核苷酸的位置相当于HEV-JRA1株的该位置核苷酸)的混合物。接着，对cDNA，进行nested聚合酶连锁反应(以下记作PCR)。为了第1轮PCR，使用Fast Start Tag DNA Polymerase(Roche公司)、外侧有义引物HE5-1(5′-TCGATGCCATGGAGGCCCA-3′；nt19-37)、和外侧反义引物HE5-4/HE5-5(序列参照上述)的混合物。接着，为了第2轮PCR，使用内侧有义引物HE5-2(5′-GCCYTKGCGAATGCTGTGG-3′；nt105-123)、内侧反义引物HE5-3(5′-TCRAARCAGTARGTGCGGTC-3′；nt450-569)、和HE5-6(5′-TYAAAACAGTAGGTTCGATC-3′；nt450-469)的混合物，温度变化的条件设定是在95℃4分钟之后连续30个循环{95℃30秒、55℃30秒、72℃45秒}，最后是72℃7分钟。
据此，对326-nt区域从HEV染色体的ORF1进行扩增。接着使用DyeTerminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(PerKin-Elmer AppliedBiosystems社)和373A DNA测序仪(Applied Biosystem公司)，进行测序。
将这些从来自日本人分离株得到的序列与从各种国藉患者得到的分离株的序列进行比较。比较中，使用计算机软件GENETYX-MAC version 10.1(SoftwareDevelopment社)。
图14表示上述的比较结果。将其与326-ntORF1序列比较时，7个日本固有株，分成大的3个组。JMM-Sai序列与其他6个分离株具有73.0％到75.7％的同源性。JKN-Sap、JHA-Sap和JMY-Haw在组内具有95.4％～98.8％的同源性，其他组的分离株只有73.0％～79.1％的同源性。JSY-Sap、JKK-Sap和JAK-Sai相互具有89.0％～99.7％的同源性，对于其他4个株，只有74.8％～72.8％的同源性典型的JRA1株的全长基因组对这些分离株也只有不足90％的同源性。
例3，HEV的全部检测首先，从数名患者采血。从来自各患者50μL血清的SMITEST EX R&D(GenomeScience Latoratories)中提取核酸。对这些核酸，作为有义引物添加5′-gcagaccacrtatgtgktcg-3′(序列号32)和5′-ccacrtatgtggtcgaygcc-3′(序列号33)，和作为反义引物添加5′-acmarctgscgrggytgcat-3′(序列号34)和5′-cgytgratwggrtgrttcca-3′(序列号35)。将这些在聚合酶MMLV-RT(stratagene)的存在下，在37℃反应30分钟，进行cDNA合成(即，从RNA向DNA的逆转录反应)。
对于合成的各个cDNA，具有作为有义引物的5′-tgktcgaygccatggaggc-3′(序列号36)、5′-tgktcgaygccatggaggc-3′(序列号37)和5′-aygccatggaggcccaycag-3′(序列号38)、和作为反义引物的5′-ckracyaccacagcattcgc-3′(序列号39)和5′-ggcckracyaccacagcatt-3′(序列号40)，使用Fast Start Tag DNA Polymerase(Roche社)进行nested PCR。温度变化的条件设定是在95℃4分钟后连续30次循环{95℃30秒、55℃30秒、72℃45秒}，最后是72℃7分钟。PCR反应产物，用琼脂糖凝胶进行电泳。
结果，利用如上述本例的方法，对37例中8例得到扩增产物。关于利用电泳得到带的8例，将得到带模拟示于图22。如图22所示，于不同的位置观察各样品得到的带。由此暗示出进行几种组合这8个例使用的数种引物，对样品中的HEV基因组都起作用，可进行扩增。即，暗示出从HEV阳性患者检测出的HEV基因型不同。
对于非甲乙丙型急性肝炎患者37例样品，分别进行扩增反应。将扩增结果，利用以前方法获得的结果和利用本例方法得到的结果，汇总示于图20。图20中「采血日」的项目，示出了从各患者采血的日期，其右邻的罗马字母是患者名字的首字母。图中「Sample No」是院内通用的样品号。图中「以前」的项目表示用以前的引物扩增时，有无HEV病毒的检出，「本例」的项目表示利用本例方法有无HEV的检出。在这些试验中，检测出HEV时，记作「+」，没有检测出时，记作「-」。如图20所示，在用以前的引物进行同样扩增和电泳时，关于没有检测出的病毒株，利用本例方法可检测出。
例4对1个患者的追踪调查关于患有急性戊型肝炎的患者，不断地测定其血液中存在的病毒。测定方法，使用根据上述例3中示出的方法的按照本发明形态的方法，和例3中示出的以前方法。结果示于图21。图中最左侧的项目表示采血日。其右邻的数字是该患者入院日开始的天数。图中「Sample No」是院内通用的样品号。图中「以前」的项目表示使用以前的引物扩增时有无检测出HEV病毒，「本例」的项目表示利用本例的方法有无检测出HEV。在这些试验中，检测出HEV时记作「+」，未检测出时记作「-」。
根据本发明的方案，使用引物时的一方，可检测出比利用以前的方法检测出更少的病毒。
例5，HEV的分型以下使用如下探针固定化板，对例3中得到的各个扩增产物进行分型。
(1)探针固定化板在市售的微型滴定板的孔中，分别将53mer的探针(5′-aaggctcctggcrtyactactgcyatwgagcaggcwgctctrgcwgcggccaa-3′)、HEV-I，II用探针(5′-ctcctggcatcactactgc-3′)和HEV-III用探针(5′-ctcctggcattactactgc-3′)、HEV-IV用探针(5′-ctcctggcgtcactactg-3′)形成固相。
(2)利用杂交分析进行分型对于上述(1)中准备的探针固定化板，添加例3中得到的各个扩增产物，进行杂交。接着测定各个孔的吸光度(O.D)。
结果示于图23A～图23E。图23A的图、图23B的图、图23C的图、图23D的图和图23E的图，分别示出了对具有不同基因型的HEV，即JRA1株、JKN-Sap株、JKK-Sap株、JKK-Sap株、JAK-Sai株、JMM-Sai株进行分型的结果。各图的横轴，从左开始依次是HEV-I、II固相孔、HEV-III固相孔、HEV-IV(54mer引物)固相孔。基因型III的情况，只由HEV-III用探针形成固相孔的O.D高于其他的孔。基因型IV的情况，只用HEV-IV用探针形成固相孔的O.D高于其他的孔。基因型I的情况，V-I，II固相孔的O.D高于其他的孔。将这些指标作为基础，使用该探针对患者血清中的病毒进行分型。其结果示于图20中的「genotype」项目内。如从该结果知道的那样，可以证明，使用按照本发明形态的探针，能很容易地对从患者采取的HEV进行分型。
此处引用的文献，其全部内容引入本说明书内。
进一步的利益和变更，本技术领域中的人员是很容易想到的。因此，其更宽范围内，本发明不受此处示出且记载的详细和代表形态所限定。因此，在不脱离由权利要求范围和它们的等同物所限定的全体发明思想的精神和范围下，下进行种种变更。
序列表序列表<110>株式会社东芝<120>日本人戊型肝炎病毒多核苷酸探针和引物，检测芯片、试剂盒，以及检测方法<130>02S0741P<140>PCT/JP02/06365<141>2002-6-25<150>JP2001-191837<151>2001-6-25<160>57<210>1<211>5138<212>DNA<213>戊型肝炎病毒JRA1<400>1ggcagaccac gtatgtggtc gatgccatgg aggcccacca gttcattaag gctcctggca 60ttactactgc catagagcag gctgctctgg ctgcggccaa ctccgccttg gcgaatgctg 120tggtggttcg gccgtttttg tctcgcgtac aaaccgagat ccttattaat ttgatgcaac 180cccggcagtt ggttttccgc cctgaggtgc tttggaacca tcctattcag agggttatac 240acaatgaatt agaacagtac tgccgggccc gggccggtcg ttgcctggag attggggctc 300atccaagatc tattaatgat aaccccaatg ttttgcaccg gtgttttctc aggccggtcg 360gtagggacgt ccagcgctgg tattctgccc ccacccgcgg ccctgcagcc aactgccgcc 420gctctgcatt gcgtggcctc ccccctgtcg accgcactta ctgttttgat ggattttcca 480gttgtgcttt cgccgcagag accggcgtgg ccctttactc tctacatgac ctttggccag 540ctgatgttgc ggaggctatg gcccgccatg gaatgacacg tctttatgct gcactccacc 600tccctcccga ggtgttgtta ccacccggta cttaccacac aacctcgtat cttctgatcc 660atgacggcaa ccgtgctgtt gtgacttatg aaggtgatac tagtgcaggt 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权利要求
1.一种多核苷酸探针，含有用于检测戊型肝炎病毒的多核苷酸的至少8个核苷酸的连续序列，其特征是(1)该至少8个核苷酸形成的连续序列是，与上述戊型肝炎病毒的多核苷酸进行杂交，用于通过这种杂交检测戊型肝炎病毒的序列，(2)该至少8个核苷酸的连续序列，可由序列号11、序列号44、序列号45、序列号46、序列号47和序列号48中记载的碱基序列及它们的互补链中选出的序列中获得。
2.根据权利要求1记载的多核苷酸探针，其特征是上述至少8个核苷酸的连续序列是由对HCV的非结构蛋白和核壳蛋白进行编码的核苷酸序列或其序列的互补链中获得。
3.具有权利要求1记载的多核苷酸探针的探针检验试剂盒。
4.根据权利要求1记载的多核苷酸探针，其特征是至少8个核苷酸的连续序列，是从序列号15的19位到37位，序列号15的52位到69位、序列号15的77位到95位、序列号15的111位到127位、序列号15的174位到181位、序列号15的213位到220位、序列号15的48位到100位，及它们的互补序列中选出。
5.根据权利要求1记载的多核苷酸探针，其特征是上述戊型肝炎病毒是重症戊型肝炎引发性，上述(2)中选出的至少8个核苷酸的连续序列，可从序列号11中记载的碱基序列获得。
6.根据权利要求1记载的多核苷酸探针，其特征是上述戊型肝炎病毒是重症戊型肝炎，上述(2)中选出的上述至少8个核苷酸的连续序列是从序列号9和序列号10中选择的。
7.一种检测样品中戊型肝炎病毒存在的方法，其特征是包括如下步骤(1)由对象获得样品，(2)将上述(1)得到的样品与权利要求1记载的多核苷酸探针进行反应、(3)检测由上述(2)反应生成的双链，(4)从上述(3)的检测结果，判定上述样品中是否存在戊型肝炎病毒。
8.一种检测样品中存在重症戊型肝炎病毒的方法，其特征是包括如下步骤(1)由对象获得样品，(2)将上述(1)得到的样品和权利要求6中记载的多核苷酸探针进行反应、(3)检测由上述(2)反应生成的双链，(4)从上述(3)的检测结果，判定上述样品中是否存在戊型肝炎病毒。
9.一种确定样品中戊型肝炎病毒基因型的方法，其特征是具有如下步骤(1)使样品与权利要求1记载的多核苷酸探针反应，(2)检测由上述(1)反应生成的双链，(3)从上述(2)的检测结果，判定上述样品中存在戊型肝炎病毒的基因型。
10.将权利要求1记载的多核苷酸探针固定化的碱基序列检测用芯片。
11.将权利要求6记载的多核苷酸探针固定化的碱基序列检测用芯片。
12.一种1对至数对PCR用引物，是用于对戊型肝炎病毒的多核苷酸进行扩增的1对至数对PCR用引物，该1对至数对PCR引物各自独立，至少具有8个核苷酸的连续序列，其特征如下(1)由该至少8个核苷酸形成的连续序列是与上述戊型肝炎病毒的多核苷酸进行杂交，用于通过这种杂交，对戊型肝炎病毒的多核苷酸的一部分进行扩增的序列，(2)该至少8个核苷酸连续的序列是从序列号11、序列号44、序列号45、序列号46、序列号47和序列号48及它们的互补链中选出的序列中获得。
13.根据权利要求12记载的1对至数对PCR用引物，其特征是上述至少8个核苷酸连续序列是从HCV的核壳蛋白进行编码的核苷酸序列或其序列的互补链中获得。
14.具有权利要求12中记载1对至数对的PCR用引物的PCR检验试剂盒。
15.根据权利要求12记载的1对至数对PCR用引物，其特征是上述至少8个核苷酸的连续序列是从序列号15的19位到37位、序列号15的52位到69位、序列号15的77位到95位、序列号15的111位到127位、序列号15的174位到181位、序列号15的213位到220位，序列号15的48位到100位、及它们的互补序列中选出的。
16.根据权利要求12记载的1对至数对PCR用引物，其特征是上述戊型肝炎病毒是重症戊型肝炎，上述(2)中选择的至少8个核苷酸的连续序列是从序列号11记载的碱基序列中获得的。
17.根据权利要求12记载的1对至数对的PCR用引物，其特征是上述戊型肝炎病毒是重症戊型肝炎，上述(2)中选择的至少8个核苷酸的连续序列，是从序列号9和序列号10中选出的。
18.一种检测样品中戊型肝炎病毒存在的方法，其特征是包括以下步骤(1)由对象获得样品，(2)在获得适当扩增的条件下，使由上述(1)得到的样品、权利要求12记载的一对至数对的PCR用引物和聚合酶进行反应，(3)检测由上述(2)反应得到的扩增产物的存在，(4)从上述(3)的检测结果，判定上述样品中是否存在戊型肝炎病毒。
19.一种检测样品中重症戊型肝炎病毒存在的方法，其特征是包括以下步骤(1)由对象获得样品，(2)在获得适当扩增的条件下，使由上述(1)得到的样品、权利要求17记载的1对至数对的PCR用引物和聚合酶进行反应，(3)检测由上述(2)反应得到的扩增产物的存在，(4)从上述(3)的检测结果，判定上述样品中是否存在戊型肝炎病毒。
20.一种确定样品中戊型肝炎病毒基因型的方法，其特征是(1)在获得适当扩增的条件下，使样品和权利要求12记载的一对PCR用引物和聚合酶进行反应(2)确定由上述(1)反应获得的扩增产物长度(3)由上述(2)的结果，判定上述样品中存在戊型肝炎病毒的基因型。
全文摘要
一种多核苷酸探针，其特征是用于检测戊型肝炎病毒的多核苷酸的至少含有8个核苷酸连续序列的多核苷酸探针，至少由8个核苷酸形成的连续序列是与上述戊型肝炎病毒的多核苷酸进行杂交，由此检测戊型肝炎病毒的序列。
文档编号C07H21/04GK1455814SQ02800130
公开日2003年11月12日 申请日期2002年6月25日 优先权日2001年6月25日
发明者高桥和明, 三代俊治, 太田裕彦, 桥本美智惠, 前久保博士 申请人:株式会社东芝