专利名称：：抑制亨廷顿基因表达的组合物和方法
技术领域：
：本申请涉及双链核糖核酸(dsRNA)及其在调节RNA干扰以抑制亨廷顿基因表达的用途。
背景技术：
：最近，已发现双链RNA(double-strandedRNA，dsRNA)分子以称为RNA干扰(RNAinterference,RNAi)的、高度保守的调控机制阻抑基因的表达。WO99/32619(Fireetal.)公开了长度至少为25个核苷酸的dsRNA在秀丽隐杆线虫(C.e/egmw)中抑制基因表达的应用。也已经发现dsRNA在其他生物体中降解耙脂A，其中包括植物(参见，例如WO99/53050，Waterhouseetal.;和WO99/61631,Heifetzetal.)、果蝇(参见，例如Yang,D.,etal.,Curr.Biol.(2000)10:1191-1200)和哺乳动物(参见WO00/44895，Limmer和DE10100586.5，Kreutzeretal.)。其天然机制已经成为开发用于治疗由基因异常调节或者基因突变表达而造成的疾病的新型药用试剂的焦点。亨廷顿病是进行性神经变性疾病，其特征是运动障碍、认知损失(cognitiveloss)和精神病表现(MartinandGusella，N.Engl.J.Med.315:1267-1276(1986)。其以常染色体显性模式遗传，并影响欧洲起源的大部分人群中大约1/10,000的个体(Harper,P.S.etal.,inHuntington'sdisease,W.B.Saunders,Philadelphia,1991)。亨廷顿病的标志是特征性的舞蹈运动障碍，其通常在寿命的40到50岁时具有轻微的、隐藏的发生并直至死亡前10-20年期间逐渐恶化。偶尔，亨廷顿病出现在年轻人中，并通常表现出更严重的症状，包括强直和更快的发病期。亨廷顿病在年轻时发生与该疾病等位基因的父源传播的优势相关。亨廷顿病的神经病理学也表现出选择性损失神经元的特征性模式，在大脑的尾状核和壳核区域(caudateandputamenregion)最严重。还不能解释亨廷顿病中的神经元死亡的生化基础，因此没有可以有效延缓或阻止该破坏性疾病的发生和进展的治疗。尽管亨廷顿病的具体机制仍然难以理解，但己经发现亨廷顿病是由在称为IT15或亨廷顿(Huntingtin(HD))的基因上扩展谷氨酸重复引起的常染色体显性的神经变性疾病。尽管该基因广泛表达并是正常发育所必需，但因为一些仍知之甚少的原因，亨廷顿病的病理学局限在大脑中。亨廷顿基因产物在患者和对照中以相似的水平表达，并且该疾病的遗传学提示多聚谷氨酸重复的扩展可能通过与其他细胞蛋白的相互作用诱导了功能的有毒性获得。如今没有用于亨廷顿病的治疗方法。通常可通过以下方法仅仅部分地抑制舞蹈样运动和焦虑行为抗精神病药(例如每日口服100-900mg氯丙嗪或者每日口服10-卯mg氟哌啶醇)或者利血平(开始每日口服O.lmg，并逐渐加大用量直到出现嗜睡、低血压或震颤的副作用)。尽管在RNAi和亨廷顿病治疗领域有显著的进步，但仍需要使用细胞自身的RNAi机制来选择性有效沉默HD基因的试剂，其具有高生物活性和体内稳定性，并且能够有效抑制靶亨廷顿基因的表达。发明概述本发明提供了双链核糖核酸(dsRNA)，以及使用这样的dsRNA用于在细胞或哺乳动物中抑制HD基因的表达的组合物和方法。本发明也提供了用于治疗由HD基因的突变体形式的表达所引起的疾病的组合物和方法。本发明的dsRNA包含RNA链(反义链)，其具有长度小于30个核苷酸并且与HD基因mRNA转录本的至少部分基本上互补的区域。在实施方案中，本发明提供了用于抑制HD基因表达的双链核糖核酸(dsRNA)分子。所述dsRNA分子包含至少2个彼此互补的序列。所述dsRNA包含有义链和反义链，所述有义链包含第一序列，所述反义链包含第二序列。所述反义链包含与编码亨廷顿蛋白的mRNA的至少一部分基本上互补的核苷酸序列，并且该互补区域的长度少于30核苷酸。所述dsRNA与表达HD基因的细胞接触时会抑制HD基因的表达至少20°/。。例如，本发明的dsRNA分子可由dsRNA的第一序列和第二序列构成，所述第一序列选自表l、2、7、8或10的有义序列，所述第二序列选自表1、2、7、8或10的反义序列。本发明的dsRNA分子可由天然存在的核苷酸所组成，或者由至少一个修饰的核苷酸所组成，所述修饰的核苷酸例如为2'-0-甲基修饰的核苷酸、含有5'-硫代磷酸基团的核苷酸和与胆甾醇基衍生物或十二垸酸双癸酰胺基团连接的末端核苷酸。可选地，该修饰的核苷酸可选自下组2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁定的核苷酸、脱碱基核苷酸(abasicnucleotide)、2'-氨基修饰的核苷酸、2'-垸基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和含有非天然碱基的核苷酸。优选，所述dsRNA的第一序列选自表2的有义序列，第二序列选自表2的反义序列。在另一个实施方案中，本发明提供了包含一种本发明的dsRNAs的细胞。所述细胞优选是哺乳动物细胞，例如人类细胞。在另一个实施方案中，本发明提供了用于在生物体中抑制HD基因的表达的药用组合物，包含一种或多种本发明的dsRNA和药用可接受的载体。在另一个实施方案中，本发明提供了在细胞中抑制HD基因的表达的方法，其包括以下步骤(a)将双链核糖核酸(dsRNA)引入细胞，其中所述dsRNA包含至少2条彼此互补的序列。所述dsRNA包含有义链和反义链，所述有义链包含第一序列，所述反义链包含第二序列。所述反义链包含与编码HD基因的mRNA的至少一部分基本上互补的互补区域,并且其中所述互补区域的长度小于30个核苷酸,并且其中所述的dsRNA当与表达所述HD基因的细胞接触时则抑制所述HD的表达至少20%，和(b)维持步骤(a)中产生的细胞至足够获得所述HD基因的mRNA转录本降解的时间,据此抑制所述HD基因在所述细胞中的表达。在另一个实施方案中，本发明提供了用于治疗、预防或控制亨廷顿病的方法，其包括对需要此种治疗、预防或控制的患者施用治疗有效量或预防有效量的本发明的一种或多种dsRNA。在另一个实施方案中，本发明提供了用于在细胞中抑制HD基因表达的载体,其包含可操作地连接到核苷酸序列的调控序列，所述核苷酸序列编码本发明的一种dsRNA的至少一个链。在另一个实施方案中，本发明提供了细胞，所述细胞包含用于在细胞中抑制HD基因表达的载体。所述载体包含可操作地连接到核苷酸序列的调控序列，所述核苷酸序列编码本发明的一种dsRNA的至少一个链。图1.表2提供了dsRNAs在HeLa细胞中抗内源人HDmRNA表达的体外活性。图2.所选的dsRNAs在HeLa细胞中降低内源性人HD蛋白形成的活性。图3.所选的dsRNAs在37°C的脑脊液(CSF)中的稳定性。图4.dsRNAsAL-DP画5997、AL画DP-6000、AL-DP-6001禾BAL-DP-7100在大鼠CSF中的长时间稳定性。发明详述本发明提供了双链核糖核酸(dsRNA)，以及使用这样的dsRNA在细胞或哺乳动物中抑制HD基因表达的组合物和方法。本发明也提供了使用dsRNA在哺乳动物中治疗由HD基因或其突变体形式的表达所引起的疾病的组合物和方法。dsRNA通过已知的RNA干扰(RANi)过程指导mRNA的序列特异性降解。该过程发生在广泛多种生物体中，其中包括哺乳动物和其他脊椎动物。本发明的dsRNA包含RNA链(反义链)，其具有长度小于30个核苷酸并且与HD基因的mRNA转录本的至少一部分基本上互补的区域。使用这些dsRNAs实现与亨廷顿病有关的基因的mRNAs靶向降解。使用基于细胞的和动物的分析,本发明证明非常低剂量的这些dsRNA可特异而有效地调节RNAi，产生HD基因的表达的显著抑制。因此，包含这些dsRNAs的本发明的方法和组合物可用于治疗亨廷顿病。以下详细的描述公开了如何制备和使用dsRNA和包含dsRNA的组合物来抑制靶HD基因的表达，以及用于治疗由这些基因表达引起的疾病和紊乱的组合物和方法。本发明的药用组合物包含具有反义链的dsRNA以及药用可接受的载体，所述反义链包含长度小于30个核苷酸并且与HD基因的RNA转录本(人HDmRNA(NM-002111),小鼠HDmRNA(NM—010414)以及大鼠HDmRNA(U18650))的至少一部分基本上互补。因此，本发明的某些方面提供了包含本发明的dsRNA和药用可接受载体的药用组合物、使用所述组合物抑制HD基因表达的方法和使用所述药用组合物治疗由HD基因的突变体形式表达所引起的疾病的方法。I.定义为了方便，以下提供了本说明书、实施例和所附的权利要求中使用的特定术语和短语的意思。如果在本说明书的其他部分中术语的使用与在本部分中提供的其定义有明显的差异，则以本部分中的定义为准。"G"、"C"、"A"和"U"每一个通常代表分别包含鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶作为碱基的核苷酸。然而，应当理解到术语"核糖核苷酸"或"核苷酸"也可以指如下文详细描述的修饰的核苷酸或代用品替换部分(moiety)。本领域技术人员非常清楚鸟嘌呤、腺嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶可被其他部分替换，而没有实质改变寡核苷酸的碱基配对特性，所述寡核苷酸包含拥有此类替换部分的核苷酸。例如但不局限于，包括次黄嘌呤作为其碱基的核苷酸可与包括胸腺嘧啶、胞嘧啶或尿嘧啶的核苷酸碱基配对。因此，在本发明的核苷酸序列中，包括尿嘧啶、鸟嘌呤或腺嘌呤的核苷酸可由包括例如次黄嘌呤的核苷酸替换。包括这样的替换部分的序列是本发明的实施方案。与亨廷顿病(IT-15)有关的基因位于4号染色体短臂的末端。在此基因的编码区域发生突变并产生不稳定的扩展的三核苷酸重复(胞嘧啶核苷-腺嘌呤核苷-鸟嘌呤核苷)，产生具有扩展的谷氨酸序列的蛋白质。该蛋白质(命名为亨廷顿(Himtingtin))的正常功能和异常功能是未知的。异常的亨廷顿蛋白似乎在转基因小鼠的神经元核中积聚，但这种积聚与神经元死亡之间的因果关系还不确定。在本文中使用的"亨廷顿(Huntingtin)"或"HD"表示任何与亨廷顿病的发展和维持相关的亨廷顿蛋白质、肽或多肽。术语"亨廷顿(Huntingtin)"或"HD"也指编码任何亨廷顿蛋白质、肽或多肽的核酸序列，例如亨廷顿RNA或亨廷顿DNA(参见例如VanDellenetal.，Jan.24，2004，Neurogenetics)。例如，所用的HDmRNA是人HDmRNA(NM-002111)、小鼠HDmRNA(NM—010414)和大鼠HDmRNA(U18650)。如在本文中使用的"耙序列"指mRNA分子(所述mRNA分子是在HD基因转录期间形成的)的核苷酸序列的连续部分，包括初级转录产物的RNA处理中的产物mRNA。如本文中所用的，术语"包括链的序列"指包括核苷酸链的寡核苷酸，其由使用标准核苷酸命名法参考的序列进行了描述。如本文中使用的，术语"互补"，除非另有说明，当用于描述与第二核苷酸序列相关的第一核苷酸序列时，如同本领域技术人员所理解的，均指包含第一核苷酸序列的寡核苷酸或多核苷酸在特定的条件下与包含第二核苷酸序列的寡核苷酸或多聚核苷酸杂交并形成双链体结构的能力。这样的条件例如可以是严紧条件，其中严紧条件包括400mMNaCl、40mMPIPESpH6.4、lmMEDTA、50°C或70°C处理12-16小时，随后洗涤。可使用其他条件，例如可在生物体内遇到的生理相关条件。本领域技术人员能够根据杂交的核苷酸的最终用途确定对两个序列的互补测试最适用的一组条件。其中包含含有第一核苷酸序列的寡核苷酸或多聚核苷酸与含有第二核苷酸序列的寡核苷酸或多聚核苷酸在第一和第二核苷酸序列全长上的碱基配对。这样的序列可在本文中被引述为对彼此"完全互补"。然而，当第一序列在本文中被引述为对第二序列的"基本上互补"时，则这两个序列可完全互补，或者它们在杂交时可形成一个或多个，但优选的不多于4、3、或2个错配碱基对，而保留在对其最终应用最相关的条件下的杂交能力。然而，当两个寡核苷酸经设计在杂交时形成一个或多个单链突出部分(singlestrandoverhang)时，此类突出部分根据互补的确定不被视为错配。例如包括长度为21个核苷酸的一个寡核苷酸和长度为23个核苷酸的另一个寡核苷酸的dsRNA，其中含有21个核苷酸序列的较长寡核苷酸与较短的寡核苷酸"完全互补"，对于本发明的目的而言也可称为完全互补。如本文中所用的，"互补"序列也包括或完全形成于非沃森-克里克碱基对(non-Watson-Crickbasepairs)和/或非天然和修饰的核苷酸形成的碱基对，只要能够满足上述关于它们杂交的能力所需要的条件。本文中，术语"互补的"、"完全互补的"和"基本上互补的"可根据dsRN的有义链和反义链，或者dsRNA的反义链和耙序列之间的碱基匹配来使用，其可根据它们使用的上下文来理解。如本文中所用的，与信使RNA(mRNA)的"至少一部分基本上互补的"多核苷酸指与目标mRNA(例如编码HD的mRNA)的连续部分基本上互补的多核苷酸。例如，如果该序列与编码HD的mRNA的非中断部分基本上互补，那么多核苷酸与HDmRNA的至少一部分是互补的。术语"双链RNA"或"dsRNA"，如本文中所用的，指具有双链体结构的核糖核酸分子或核糖核酸分子复合物，所述双链体结构包含如上所定义的2条反向平行的并且基本上互补的核酸链。形成所述双链体结构的两条链可以是一个较大RNA分子的不同部分，或者他们是单独的RNA分子。当两条链是一个较大分子的一部分，并因此通过一个链的3'末端和个别的另一个链的5'末端之间的不中断核苷酸链连接而形成双链体结构时，该连接RNA链称为"发卡环"。当两条链通过除一个链的3'末端和个别的另一个链的5'末端之间的不中断核苷酸以外的其他方法共价连接而形成双链体结构时，该连接结构称为"连接体"。所述RNA链可具有相同或不同数量的核苷酸。碱基对的最大数量是dsRNA中最短链的核苷酸数量。除所述双链体结构外，dsRNA可包含一个或多个核苷酸突出部分(nucleotideoverhangs)。如本文所用的，"核苷酸突出部分"指未配对核苷酸，或指当所述dsRNA的一条链的3'末端长出另一条链的5'末端时，从dsRNA的双链体机构突出来的核苷酸，反之亦然。"平的"或"平末端"表示在dsRNA的该末端没有未配对的核苷酸，即，没有核苷酸突出部分。"平末端的"dsRNA是在其全长上都是双链的dsRNA，即，在该分子的任何一端都没有核苷酸突出部分。术语"反义链"指dsRNA的一条链，其包含与靶序列基本上互补的区域。如本文中所用的，术语"互补区域"指反义链上的基本上与序列互补的区域，所述序列例如是本文中定义的耙序列。当互补的区域不与耙序列完全互补时，如果有错配，最容忍在末端区域有错配，优选在末端区域或如在5'和/或3'末端的6、5、4、3或2个核苷酸的区域内。术语"有义链"，如本文中所用的，指dsRNA的一条链，其包含与所述反义链的区域基本上互补的区域。"引入细胞"，当指dsRNA时，表示促进将其摄取或吸收入细胞，如本领域技术人员所理解的。dsRNA的吸收或摄取可通过不受协助的扩散或主动的细胞过程，或者通过辅助试剂或设备而发生。该术语的意思不局限于体外的细胞；也可将dsRNA"引入细胞"，其中该细胞是存活的生物体的一部分。在这种情况下，引入细胞包括递送入生物体。例如，对于体内递送，可将dsRNA注射入组织位点或系统地施用。体外引入细胞包括本领域已知的方法，例如电穿孔和脂质体转运。术语"沉默"和"抑制……表达"只要其指HD基因，在本文中就指HD基因的表达至少部分地得到抑制，如从HD基因转录的mRNA的量的减少所显示的，所述mRNA可分离自第一细胞或第一组细胞，所述细胞转录HD基因，并且已经处理使得与第二细胞或第二组细胞相比HD基因的表达受到抑制，所述第二细胞或第二组细胞与第一细胞或第一组细胞基本上相同，但没有经过这样处理(对照细胞)。抑制的程度通常以下述方式表示对照细胞中的mRNA—处理细胞中的mRNA100%对照细胞中的mRNA可选地，抑制的程度可以根据与HD基因转录在功能上相关的参数的降低来给出，例如，细胞所分泌的由HD基因编码的蛋白的量，或者显示特定表型(例如细胞凋亡)的细胞的数量。理论上来讲，可在任何组成型或遗传工程表达该靶的细胞中，通过任何合适的分析来确定HD基因的沉默。然而，当需要参考以确定是否给定的siRNA在一定程度上抑制HD基因的表达并因此包括在本发明内时，在以下实施例中提供的分析可作为这样的参考。例如，在某些情况下，通过施用本发明的双链寡核苷酸，抑制HD基因的表达至少为大约20%、25%、35%或50%。在优选的实施方案中，通过施用本发明的双链寡核苷酸，抑制HD基因的表达至少为大约60%、75%或80%。在更优选的实施方案中，通过施用本发明的双链寡核苷酸，抑制HD基因的表达至少为大约85%、90%或95%。在最优选的实施方案中，通过施用本发明的双链寡核苷酸，抑制HD基因的表达为至少大约98。/0、99%或更高。如本文中所用的，术语"治疗"指对患者应用或施用治疗剂，或者对来自患者的分离组织或细胞系应用或施用治疗剂，所述患者患有紊乱，例如疾病或病症、疾病的症状、或者疾病的倾向性，所述应用或施用的目的是治疗、治愈、缓解、减轻、改变、补救、改善、提高或影响该疾病、基本的症状或疾病的倾向性。"患者"可以是人，也可以是非人类动物。治疗指亨廷顿病的任何一种已知症状的减少，例如痴呆和精神障碍，其变化范围从情感冷淡和易怒至完全的双向障碍或精神分裂样疾病。运动表现包括极端的忽然运动(flickingmovements)、轻快步伐(liltinggait)、运动不安(不能维持运动动作，例如吐舌头)、面部扭曲(facialgrimacing)、运动共济失调和肌张力障碍。如在本文中使用的，短语"治疗有效量"和"预防有效量"指在治疗、预防或控制亨廷顿病或该疾病的已知症状中提供治疗益处的量。治疗有效的具体的量易于由普通医疗从业者确定，并且依赖本领域已知的因素而变动,例如亨廷顿病的类型、患者的病史和年龄、亨廷顿病的阶段和其他抗亨廷顿病的药剂的施用。如本文所用的，"药用组合物"包括药用有效量的dsRNA和药用可接受的载体。如本文所用的，"药用有效量"、"治疗有效量"或简单的"有效量"指有效地产生预期的药理学、治疗性或预防性结果的RNA的量。例如，如果当与疾病或紊乱相关的可测量的参数有至少25%的减少，即认为给定的临床治疗是有效的，那么用于治疗该疾病或紊乱的药物的治疗有效量是实现该参数减少至少25%所需的量。术语"药用可接受的载体"指用于施用治疗剂的载体。此类的载体包括但不局限于盐溶液、缓冲盐溶液、葡萄糖、水、甘油、乙醇及其组合物。该术语特别排除细胞培养基。对于口服施用的药物，药用可接受的载体包括但不局限于药用可接受的赋形剂,例如惰性稀释剂、崩解剂、结合剂、润滑剂、甜味剂、增味剂、着色剂和防腐剂。适宜的惰性稀释剂包括碳酸钠和碳酸钙、磷酸钠和磷酸钙、以及乳糖，同时玉米淀粉和藻朊酸是适宜的崩解剂。结合剂包括淀粉和明胶，而如果有润滑剂通常是硬脂酸镁、硬脂酸或滑石。如果需要，药片可涂敷例如甘油单硬脂酸或甘油二硬脂酸的材料，以延缓在胃肠道内的吸收。如在本文中使用的"转化的细胞"是已经引入载体的细胞，从所述载体上可表达dsRNA分子。II.双链核糖核酸(dsRNA)在一个实施方案中，本发明提供了用于在细胞或哺乳动物中抑制HD基因的表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其中所述dsRNA包括含有互补区域的反义链，所述互补区域与在HD基因的表达中形成的mRNA的至少一部分互补，并且其中该互补区域的长度小于30个核苷酸，并且其中当与表达所述HD基因的细胞接触，所述dsRNA抑制所述HD基因的表达至少20%。所述dsRNA包含两个RNA链，其充分互补以杂交而形成双链体结构。所述dsRNA的一条链(反义链)包含与靶序列基本上互补，并且优选完全互补的互补区域，所述耙序列来自在HD基因的表达期间形成的mRNA的序列，另一条链(有义链)包含与该反义链互补的区域，从而这两条链在合适的条件下混合时杂交并形成双链体结构。优选，所述双链体结构的长度是15-30、更优选18-25，再更优选19-24，并且最优选21-23个碱基对。同样，对所述靶序列互补的区域的长度是15-30、更优选18-25，再更优选19-24，并且最优选21-23个碱基对。本发明的dsRNA还包含一个或多个单链核苷酸突出部分。所述dsRNA可通过本领域已知的、如下文所讨论的标准方法来合成，例如通过使用自动DNA合成仪，其例如可商购自Biosearch,AppliedBiosystems，Inc。在优选的实施方案中，所述HD基因是人HD基因。在具体的实施方案中，所述dsRNA的反义链包括表1、2、7、8或10的反义序列，而第二序列选自表l、2、7、8或10的有义序列。在其他的实施方案中，所述dsRNA包括选自表1、2、7、8或10提供的序列中的至少一条核苷酸序列。在其他的实施方案中，所述dsRNA包括选自该组的至少2条序列，其中所述至少2条序列中的一条与所述至少2条序列中的另一条互补，并且所述至少2条序列中的一条与在HD基因的表达中产生的mRNA的序列基本上互补。优选，所述dsRNA包括两种寡核苷酸，其中一种寡核苷酸描述于表1、2、7、8或10中，而第二种寡核苷酸描述于表l、2、7、8或10中。本领域技术人员非常清楚包括20-23个碱基对，特别是21个碱基对的双链体的dsRNA已经得到赞誉在诱导RNA干扰中特别有效(Elbashiretal.，EMBO2001，20:6877-6888)。然而，其他人发现更短或更长的dsRNA也是有效的。在上述的实施方案中，通过在表l、2、7、8或10中提供的寡核苷酸序列的性质，本发明的dsRNA可包括最小长度是21nt的至少一条链。合理的预测，包括在表l、2、7、8或10中的一条序列的一端或两端只减少几个核苷酸的短dsRNAs，其效果与上文所描述的dsRNAs相似。因此，包含表l、2、7、8或10中一条序列的15、16、17、18、19和20个核苷酸或更多连续的核苷酸的部分序列的dsRNA，在如下文所述的FACS分析中，它们抑制HD基因表达的能力与含有全序列的dsRNA相比具有不超过5、10、15、20、25或30%的抑制作用。本发明的dsRNA包含一个或多个对靶序列的错配。在优选的实施方案中，本发明的dsRNA包含不多于3个错配。如果所述dsRNA的反义链包含对靶序列的错配，则优选该错配区域不处于互补区域的中心。如果所述dsRNA的反义链包含对耙序列的错配，则优选该错配限制在任何一个末端的5个核苷酸内，例如从互补区域的5'或3'端开始的5、4、3、2或l个核苷酸。例如，对于与HD基因的某一区域互补的23个核苷酸的dsRNA链，所述dsRNA优选不包含在中心13个核苷酸内的任何错配。在本发明中所描述的方法可用于确定包含对靶序列错配的dsRNA是否有效抑制HD基因的表达。对具有错配的dsRNAs在抑制HD基因的表达中的有效性的考虑是重要的，特别是当已知HD基因中特定的互补区域在人群中具有多态性序列变化时。在一个实施方案中，所述dsRNA的至少一端具有1至4个，优选1或2个核苷酸的单链核苷酸突出部分。具有至少一个核苷酸突出部分的dsRNAs比其平端对应物具有意想不到的出众抑制特性。而且，本发明人发现只有一个核苷酸突出部分增强了所述dsRNA的干扰活性，而且没有影响到其整体的稳定性。已证明只具有一个突出部分的dsRNA特别稳定，并在体内以及多种细胞、细胞培养基、血液和血清中有效。优选，所述单链突出部分位于该反义链的3'末端，或位于该有义链的3'末端。所述dsRNA也可具有平末端，优选，位于该反义链的5'端。这样的dsRNA具有改善的稳定性和抑制活性，从而可以以低剂量施用，即每天相对接受者体重少于5mg/kg。优选，所述dsRNA的反义链在3'端具有核苷酸突出部分，且5'端是平的。在另一个实施方案中，突出部分中的一个或多个核苷酸为核苷三磷酸所取代。在另一个实施方案中，将所述dsRNA进行化学修饰以增强稳定性。本发明的核酸可通过本领域已建立的方法合成和/或修饰，例如在"Currentprotocolsinnucleicacidchemistry",Beaucage,S丄.etal.(Edrs.),JohnWiley&Sons,Inc.,NewYork,NY,USA中描述的方法，其由此通过引用方式并入本文。化学修饰可包括但不局限于2'修饰、引入非天然碱基、共价结合至配体和以三磷酸键替换磷酸键。在此实施方案中，通过至少1种，优选2种化学键的连接增强所述双链体结构的整体性。可通过多种已知技术中的任何技术来实现化学连接，例如通过引入共价键、离子键或氢键；疏水相互作用、范德华力或堆积相互作用；通过金属-离子协同作用，或通过使用嘌呤类似物。优选地，可用于修饰所述dsRNA的化学基团不限制性地包括亚甲蓝；双功能基团，优选二-(2-氯乙基)胺；N-乙酰-N'-(p-乙醛酰苯甲酰基)胱胺；4-硫脲嘧啶和补骨脂素。在一个优选的实施方案中，连接体是六聚乙二醇。在此情况下，通过固相合成产生所述dsRNA，并且根据标准方法(例如Williams,DJ.,andK.B.Hall,Biochem.(1996)35:14665-14670)并入所述六聚乙二醇。在一个具体实施方案中，反义链的5，端和有义链的3'端通过六聚乙二醇连接体进行化学连接。在另一个实施方案中，所述dsRNA的至少一个核苷酸包括硫代磷酸或二硫代磷酸基团。在所述dsRNA的末端的化学键优选通过三螺旋键形成。表2提供了本发明的修饰的RNAi试剂的实例。在某些实施方案中，可通过一种或几种键合基团形成化学键，其中这样的键合基团优选是聚-(oxyphosphinicooxy-1，3-丙二醇)-和/或聚乙二醇链。在其他的实施方案中，可通过嘌呤类似物代替嘌呤引入至双链结构中来形成化学键。在另外的实施方案中，可通过将氮杂苯单位(azabenzeneunits)引入至双链体结构中来形成化学键。仍然在另外的实施方案中，通过将分支核苷酸类似物代替核苷酸引入至双链体结构中来形成化学键。在某些的实施方案中,通过紫外线诱导化学键。在另一个实施方案中，可修饰所述两个单链的一端或两端的核苷酸以阻止或抑制细胞酶类的活性，例如但不局限于某些核酸酶。抑制细胞酶类活性的技术是本领域己知的，其中包括，但不局限于2，-氨基修饰、2，-氨基糖修饰、2'-F糖修饰、2'-F修饰、2，-烷基糖修饰、不带电荷的主链修饰、吗啉代修饰、2'-0-甲基修饰和氨基磷酸酯(参见，例如Wagner,Nat.Med.(1995)1:1116-8)。因此，dsRNA上的核苷酸的至少一个2，-羟基基团被化学基团所替代，优选地被2'-氨基或2'-甲基所替代。而且，至少一个核苷酸被修饰成锁定的核苷酸。此类锁定的核苷酸包含亚甲基桥，其将核糖的2'-氧与核糖的4'-碳相连。包含锁定的核苷酸的寡核苷酸已有记载(Koshkin,A.A.,etal.,Tetrahedron(1998),54:3607-3630andObika,S.etal"TetrahedronLett.(1998),39:5401-5404)。将锁定的核苷酸引入寡核苷酸中改善了对互补序列的亲和力，并且将熔融(解链)温度提高了几度(Braasch,D.A.andD.R.Corey,Chem.Biol.(2001),8:1-7)。将配体轭合到dsRNA上可增强其细胞吸收。在某些情况下，将疏水配体轭合到dsRNA上来促进其直接穿过细胞膜。可选地，轭合到所述dsRNA上的配体是用于受体介导的内吞作用的基质。这些方法已用于协助反义寡核苷酸的细胞穿入。例如，已将胆固醇轭合到多种反义寡核苷酸上从而产生与它们的未轭合类似物相比更有活性的化合物。参见M.ManoharanAntisense&NucleicAcidDrugDevelopment2002,12,103。其他轭合到寡核苷酸上的亲脂性化合物包括l-芘丁酸、1,3-二-0-(十六烷基)甘油和薄荷醇。受体介导的内吞作用的配体的一个实例是叶酸。叶酸通过叶酸受体介导的内吞作用进入细胞。具有叶酸的dsRNA化合物能通过叶酸受体介导的内吞作用有效地被转运入细胞。Li及其同事报道了将叶酸结合到寡核苷酸的3'末端使该核苷酸的细胞摄取提高了8倍(Li，S.;Deshmukh,H.M.;Huang,L.Pharm.Res.1998，15,1540)。其他轭合到寡核苷酸上的配体包括聚乙二醇、糖的集簇物、交联剂、卟啉轭合体和递送肽。在某些情况下，将阳离子配体轭合到寡核苷酸上经常可改善对核酸酶的抗性。阳离子配体的代表性实例是丙胺和二甲基丙胺。有趣的是,当将阳离子配体分散到整个寡核苷酸上时，据报道反义寡核苷酸保留其对mRNA的高结合亲和力。参见M.ManoharanAntisense&NucleicAcidDrugDevelopment2002，12,103，并且在本文中加以引用。本发明的轭合配体的dsRNA可通过使用具有悬垂反应功能性(pendantreactivefunctionality)的dsRNA来合成，例如将连接分子结合到所述dsRNA上。该反应性的寡核苷酸可直接与市售配体、合成而具有任意的多种保护基团的配体或具有与其结合的连接部分的配体直接反应。在一些优选的实施方案中通过使用与配体适当地连接并进一步与固体支持材料结合的核苷单体，本发明的方法促进了轭合配体的dsRNA的合成。任选地结合到固体支持材料上的此类配体-核苷轭合物，可根据本发明方法的一些优选实施方案，通过所选的血清-结合配体与位于核苷或寡核苷酸5'位置的连接部分的反应来制备。在某些情况下，具有结合到dsRNA的3'末端的芳烷基配体的dsRNA通过首先将单体构建单元(monomerbuildingblock)经长链氨垸基结合到控制的孔-玻璃的支持物(controlled-pore-galsssupport)上而制备。然后,通过标准固相合成技术将核苷酸结合到已经与固体支持物结合的单体构建单元上。单体构建单元可以是核苷或其他适于固相合成的有机化合物。可通过固相合成的已知技术方便、常规地制作本发明的轭合物中所用的dsRNA。用于此类合成的设备由几个供货商出售，包括，例如AppliedBiosystems(FosterCity,CA)。可另外地或可选地应用本领域已知的用于此类合成的任何其他方法。使用相似的技术制备其他寡核苷酸，例如硫代磷酸酯和垸基化的衍生物，也是已知的。关于合成特定的修饰寡核苷酸的教导可见以下美国专利美国专利号5,138,045和5,218,105描述了轭合聚氨的寡核苷酸；美国专利号5,212,295描述了用于制备具有手性磷连接的寡核苷酸的单体;美国专利号5,378,825和5,541,307描述了主链被修饰的寡核苷酸；美国专利号5,386,023，描述了主链被修饰的寡核苷酸和其通过还原耦合的制备;美国专利号5,457,191描述了基于3-单去氮嘌呤环系统的修饰的核碱基和其合成的方法;美国专利号5,459,255描述了基于N-2取代嘌呤的修饰的核碱基;美国专利号5,521,302描述了用于制备具有手性磷酸基的寡核苷酸的过程；美国专利号5,539,082描述了肽核酸；美国专利号5,554,746描述了具有P-内酰胺主链的寡核苷酸；美国专利号5,571,902描述了合成寡核苷酸的方法和材料；美国专利号5，578，718描述了具有烷硫基的核苷，其中此类基团可用作结合到该核苷的多种位置中的任何部分的连接体;美国专利号5，587，361和5,599,797描述了具有高手性纯度的硫代磷酸键的寡核苷酸;美国专利号5,506,351描述了用于制备2'-0-鸟嘌呤核苷和相关化合物的过程，包括2,6-二氨基嘌呤化合物；美国专利号5,587,469描述了具有N-2取代的嘌呤的寡核苷酸；美国专利号5,587,470描述了具有3-去氮嘌呤寡核苷酸；美国专利号5,223，168和美国专利号5,608,046两者都描述了轭合的4'-去甲基核苷类似物；美国专利号5,602,240和5,610,289描述了主链-修饰的寡核苷酸类似物；美国专利号6，262，241和5,459,255特别描述了合成2'-氟-寡核苷酸的方法。在本发明的轭合配体的dsRNA和具有配体分子的序列特异性核苷中，寡核苷酸和寡核苷可在合适的DNA合成仪上使用下述材料来组装标准的核苷酸或核苷前体，或者已经具有连接部分的核苷酸或核苷轭合前体，已经具有配体分子的配体-核苷酸或核苷-轭合前体(其)，或者具有非核苷配体的构建单元。当使用己经具有连接部分的核苷酸轭合前体时，通常完成序列特异性连接的核苷的合成，其后所述配体分子与连接部分反应以形成轭合配体的寡核苷酸。具有多种分子(例如甾类、维生素、脂质和报告分子)的寡核苷酸辄合物在之前已有描述(参见Manohamnetal.，PCTApplicationWO93/07883)。在优选的实施方案中，本发明的寡核苷酸或连接的核苷通过自动合成仪，除了市售的并在寡核苷酸合成中常规使用的标准的和非标准的亚磷酰胺以外，还使用来自配体-核苷轭合物的亚磷酰胺来合成。在寡核苷酸的核苷中并入2'-0-甲基、2'-0-乙基、2'-0-丙基、2'-0-烯丙基、2'-0-氨烷基或2'-脱氧-2'-氟基团赋予该寡核苷酸增强的杂交特性。另外，包含硫代磷酸酯主链的寡核苷酸具有增强的核酸酶稳定性。因此，本发明的功能化的、连接的核苷可扩大为包括硫代磷酸酯主链或2'-0-甲基、2'-0-乙基、2'-0-丙基、2'-0-烯丙基、2'-0-氨垸基或2'-脱氧-2'-氟基团之一或两者o在某些优选的实施方案中，使用DNA合成仪制备在5'末端具有氨基基团的本发明的功能化核苷序列，并且随后使其与所选配体的活性酯衍生物反应。活性酯衍生物是本领域技术人员所熟知的。代表性的活性酯包括N-羟基琥珀酰亚胺酯、四氟苯酚酯、五氟苯酚酯和五氯苯酚酯。氨基基团和活性酯的反应产生寡核苷酸，其中所选的配体通过连接基团结合到5'位置。在5'末端的氨基基团可通过使用5'-氨基修饰物C6试剂来制备。在优选的实施方案中，可通过使用配体一核苷亚磷酰胺将配体分子轭合到寡核苷酸的5'位置，其中该配体通过连接体直接和间接连接到5'—羟基基团上。此类配体-核苷亚磷酰胺通常用在自动合成程序的最后以提供在5，末端具有该配体的轭合配体的寡核苷酸。在本发明的方法的一个优选实施方案中，轭合配体的寡核苷酸的制备开始于合适的前体分子的选择，在其之上构建该配体分子。通常，所述前体是常用核苷的适当保护的衍生物。例如，用于合成本发明的轭合配体的寡核苷酸的合成前体包括但不局限于在该分子的核碱基部分被保护的2'-氨基烷氧基-5'-ODMT-核苷、2'-6-氨基烷基氨基-5'-ODMT-核苷、5'-6-氨基垸氧基-2'-脱氧-核苷、5'-6-氨基烷氧基-2-保护的-核苷、3'-6-氨基垸氧基-5'-ODMT-核苷和3'-氨基烷基氨基-5'-ODMT-核苷。合成此类连有氨基的受保护的核苷前体的方法是本领域普通技术人员已知的。在许多情况下，在本发明的化合物的制备期间使用保护基团。如本文中所用的，术语"受保护的"表示所指定的部分具有附加其上的保护基团。在本发明的一些优选实施方案中，化合物包含一种或多种保护基团。在本发明的方法中可应用广泛多种的保护基团。通常，保护基团对特定的反应条件保留化学功能性的惰性，并且可在分子的这种功能性上附加或移除,而基本上不损坏该分子的剩余部分。代表性的羟基保护基团，例如由Beaucageetal.(Tetrahedron,1992,48:2223-2311)公开。其它的羟基包括基团，以及其它代表性的保护基团公开于GreeneandWuts,ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis,Chapter2，2ded.、JohnWiley&Sons,NewYork,1991禾卩OligonucleotidesAndAnaloguesAPracticalApproach,Ekstein，F.Ed.，IRLPress,N.Y,1991中。羟基保护基团的实例包括，但不局限于叔丁基、叔丁氧基甲基、甲氧基甲基、四氢吡喃基、1-乙氧基乙基、l-(2-氯乙氧基)乙基、2-三甲基硅乙基、对氯苯基、2,4-二硝基苯基、苄基、2，6-二氯苄基、二苯基甲基、p,p，-二硝基苯苄基、对硝基苄基、三苯基甲基、三甲基硅垸基、三乙基硅烷基、叔丁基二甲基硅烷基、叔丁基二苯基硅垸基、三苯基硅垸基、苯甲酰甲酸酯、乙酸酯、氯代乙酸酯、三氯代乙酸酯、三氟代乙酸酯、pivaloate、安息香酸酯、对苯甲酸苯酯、9-芴甲基碳酸酯、甲磺酸酯和甲苯磺酸酯。用碱处理选择性地除去对酸处理稳定的氨基保护基团，并用于制备对取代选择性可用的反应氨基基团。此类基团的实例是Fmoc(E.AthertonandR.C.SheppardinThePeptides,S.Udenfriend,J.Meienhofer,Eds.,AcademicPress,Orlando,1987，volume9，p.l)和由Nsc基团示例的各种取代的磺酰乙基氨基甲酸酯(sulfonylethylcarbamates)(Samukovetal.,TetrahedronLett.,1994,35:7821;VerhartandTesser,Rec.Trav.Chim.Pays-Bas，1987,107:621)。其它氨基保护基团包括，但不局限于氨基甲酸酯保护基团，例如2-三甲基硅乙氧基羰基(Teoc)、l-甲基-l-(4-联苯基)乙氧基羰基(Bpoc)、叔丁氧基羰基(BOC)、烯丙氧基羰基(Alloc)、9-芴甲氧羰基(Fmoc)和苄氧基羰基(Cbz)、酰胺保护基团，例如甲酰基、乙酰基、三卤代乙酰基、苯甲酰基和硝基苯乙酰基；磺酰胺保护基团，例如2-硝基苯磺酰；以及亚胺和环酰亚胺保护基团，例如邻苯二甲酰亚氨基和二硫琥珀酰基(dithiasuccinoy1)。许多固体支持物可从市场购得，并且本领域技术人员易于选择在固相合成歩骤中所用的固体支持物。在某些实施方案中，使用通用的支持物。通用支持物可制备具有位于寡核苷酸的3'末端的不常见的或修饰的核苷酸的寡核苷酸。通用支持物500(UniversalSupport500)和通用支持物II(UniversalSupportII)是可从GlenResearch,22825DavisDrive,Sterling,Virginia购得的通用的支持物。有关通用支持物的进一步细节，参见Scottetal.，InnovationsandPerspectivesinsolid-phaseSynthesis,3rdInternationalSymposium,1994,Ed.RogerEpton，MayflowerWorldwide,115-124];Azhayev,A.V.Tetrahedron1999，55,787-800;以及AzhayevandAntopolskyTetrahedron2001，57，4977-4986。另外，据报道当寡核苷酸通过更容易进行碱性水解的顺式-1，2-乙酰氧基磷酸基(syn-1,2-acetoxyphosphategroup)结合到固体支持物上时，所述寡核苷酸可在更温和的条件下从通用支持物上裂解。参见Guzaev，A.I.;Manoharan,M.J.Am.Chem.Soc.2003，125,2380。所述核苷通过含磷的和不含磷的共价核苷间键合而连接。出于鉴定的目的，此类轭合核苷可表征为具有配体的核苷或配体-核苷轭合物。在其序列中具有轭合至核苷的芳烷基配体的连接核苷，与没有轭合的类似dsRNA的化合物相比时，显示出增强的dsRNA活性。本发明的轭合芳垸基-配体的寡核苷酸包括寡核苷酸和连接核苷的轭合物，其中所述配体直接结合至核苷或核苷酸而没有连接基团的中间作用。所述配体可优选通过连接基团，在该配体的羰基、氨基和氧基位置结合。典型的连接基团是酯、酰胺和氨基甲酸酯基团。用于本发明的轭合配体的寡核苷酸的修饰寡核苷酸的具体实例优选包括含有修饰的主链或非天然核苷间键合的寡核苷酸。如在本文中定义的，具有修饰的主链或非天然核苷间键合的寡核苷酸包括在主链保留磷酸的寡核苷酸和在主链没有磷酸的寡核苷酸。对于本发明的目的，在糖间主链中不具有磷原子的修饰的寡核苷酸也被视为寡核苷。下文描述了具体的寡核苷酸化学修饰。不需要对给定化合物的所有位置进行统一的修饰。相反地，可将多于一个的修饰并入单个dsRNA化合物或者甚至是其单个核苷酸中。优选修饰的核苷间键合或主链包括，例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酸三酯、氨垸基磷酸三酯、甲基和其他烷基磷酸酯(包括3，-烯基磷酸酯和手性磷酸酯)、亚磷酸酯、氨基磷酸酯(包括3'-氨基磷酸酯和氨垸基氨基磷酸酯)、硫代氨基磷酸酯、硫代烷基磷酸酯、硫代垸基磷酸三酯和具有正常3'-5'键合的硼代磷酸酯、这些化合物2'-5'连接的类似物以及和具有反向极性(invertedpolarity)的类似物，其中核苷单位的临近对以3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'连接。也包括多种盐、混合的盐和无酸形式。涉及制备上述含有磷酸-原子键合的美国专利包括，但不局限于美国专利号3,687,808、4,469,863、4,476,301、5,023,243、5,177,196、5,188,897、5,264,423、5,276，019、5，278,302、5，286，717、5，321,131、5，399,676、5，405，939、5,453，496、5,455,233、5,466,677、5，476，925、5,519,126、5,536,821、5,541,306、5,550,111、5,563,253、5,571,799、5,587,361、5,625,050和5,697,248，其中每个并入本文作为参考。其内不含磷原子的优选的修饰的核苷间键合或主链(例如寡核苷)具有通过短链烷基或环烷基糖间键合、混合的杂原子和链烷基或环垸基糖间键合、或者一种或多种短链杂原子或杂环糖间键合而形成的主链。这些包括具有吗啉键合(部分从核苷的糖基部分形成)的主链；硅氧烷主链；硫化物、亚砜和砜主链；甲酰基和硫代甲酰基主链；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基主链；含链烯主链；氨基磺酸酯主链；亚甲基亚氨基和亚甲肼基主链；磺酸酯和磺酰胺主链；酰胺主链和其他具有混合的N、O、S和CH2组分的主链。涉及制备上述寡核苷的代表性美国专利包括但不局限于美国专利号5,034,506、5,166,315、5,185,444、5,214,134、5，216，141、5,235,033、5，264，562、5,264,564、5,405,938、5,434,257、5,466,677、5,470,967、5,489,677、5,541,307、5，561，225、5,596,086、5,602,240、5,610,289、5,602,240、5,608,046、5,610,289、5,618,704、5,623,070、5,663,312、5,633,360、5,677,437和5,677,439，其中每一个并入本文作为参考。在其他优选的寡核苷酸模拟物中，所述核苷酸单位的糖基和核苷间键合两者，即主链，被新的基团所取代。保留所述核碱基单位以与合适的核酸靶化合物杂交。将已被证明具有优秀的杂交特性的这样的寡核苷酸，其为寡核苷酸模拟物，称为肽核酸(peptidenucleicacid,PNA)。在PNA化合物中，用含酰胺的主链，特别是氨基乙基甘氨酸主链，替代寡核苷酸的糖主链。保留所述核碱基并直接或间接结合于该主链的酰胺部分的原子。教导PNA化合物制备方法的代表性美国专利包括但不局限于美国专利号5,539,082;5,714,331和5,719,262，这些专利通过引用方式并入本文。PNA化合物的进一步教导可见于Nielsenetal.,Science,1991,254,1497中。本发明的一些优选的实施方案使用具有硫代磷酸酯基的寡核苷酸和具有杂原子主链的寡核苷，特别是上述引用的美国专利号5,489,677的—CH2—NH—O—CH2—、—CH2—N(CH3)—O—CH2—[称为亚甲基(甲基亚胺基)或MMI主链]、一CH2—0—N(CH3)--CH2--、一CH2—N(CH3)—N(CH3)—CH2—禾口—O—N(CH3)—CH2—CH2—[其中天然磷酸二酯主链表示为--O—P—O—CH2—]和上述引用的美国专利号5,602,240的酰胺主链。具有上述引用的美国专利号5,034,506的吗啉主链结构的寡核苷酸也是优选的。本发明的轭合配体的寡核苷酸中使用的寡核苷酸可另外地或可选地包括核碱基(本领域中简称为"碱基")修饰物或者替代物。如本文中所用的，未修饰的或天然的核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其他合成的和天然的核碱基，如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)，5-羟甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基以及其他垸基的衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他垸基衍生物，2-硫脲嘧啶，2-硫胸腺嘧啶和2-硫胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮基尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫脲嘧啶、8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫代垸基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤,8-偶氮基鸟嘌呤和8-偶氮基腺嘌呤，7-去氮鸟嘌呤(deazaguanine)和7-去氮腺嘌呤(7-deazaadenine)以及3-去氮鸟嘌呤和3-去氮腺嘌呤。其它核碱基包括美国专利号3,687,808中公开的核碱基、ConciseEncyclopediaOfPolymerScienceAndEngineering,第858-859页,Kroschwitz,J.I.,ed.JohnWiley&Sons,1990中公开的核碱基、Englischetal.,AngewandteChemie,InternationalEdition,1991，30，613中公开的核碱基和Sanghvi,Y.S.,第15章，AntisenseResearchandApplications,第289-302页，Crooke，S.T.andLebleu,B.，ed.,CRCPress,1993中公开的核碱基。某些上述核碱基对提高本发明的寡核苷酸的结合亲和力特别有用。这些核碱基包括5-取代的嘧啶、6-偶氮基嘧啶以及N-2、N-6和0-6取代的嘌呤，包括2-氨丙基腺嘌呤、5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已发现5-甲基胞嘧啶取代使核酸双链体的稳定性提高了0.6-1.2T(同上，第276-278页)，其是目前优选的碱基取代，当与2'-甲氧乙基糖基修饰组合时，甚至更特别优选。涉及制备某些上述修饰的核碱基以及其它修饰的核碱基的代表性美国专利包括但不局限于上述的美国专利号3,687,808，以及美国专利号4,845,205、5,130,302、5,134,066、5,175,273、5,367,066、5,432,272、5,457,187、5,459,255、5,484,908、5,502,177、5,525,711、5,552,540、5,587,469、5,594,121、5,596,091、5,614,617、5,681,941和5,808,027，其中每一个通过引用方式并入本文。在某些实施方案中，本发明的轭合配体的寡核苷酸中所用的寡核苷酸可另外地或可选地包括一个或多个取代的糖基部分。优选的寡核苷酸包括以下在2，位置中的一个OH、F、O-、S-或N-烷基，O-、S-或N-烯基，或者O、S-或N-炔基，其中所述烷基、烯基和炔基可以是被取代和不被取代的d-C,o烷基或CVd。烯基和炔基。特别优选的是0[(CH2)nO]mCH3、0(CH2)nOCH3、0(CH2)nNH2、0(CH2)nCH3、0(CH2)nONH2和0(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m是1至大约10。其它优选的寡核苷酸包括以下在2'位置中的一个d-do低级烷基、取代的低级垸基、垸芳基、芳烷基、O-烷芳基或O-芳垸基、SH、SCH3、OCN、Cl、Br、CN、CF3、OCF3、SOCH3、S02CH3、ON02、N02、N3、NH2、杂环烷基、杂环垸芳基、氨基烷氨基、聚垸氨基、取代的硅垸基、RNA剪切基团、报告基团、插入剂、用于改善寡核苷酸的药代动力学特性的基团或用于改善寡核苷酸药效特性的基团，以及其它具有相似特性的取代基。优选的修饰包括2'-甲氧基乙氧基[2'-0—CH2CH2OCH3，也称为2'-0-(2-甲氧基乙基)或2'-MOE](Martinetal.，Helv.Chim.Acta,1995,78,486)，即烷氧基烷氧基基团。另一优选的修饰包括2'-二甲基氨基氧基乙氧基，即0(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2'-DMAOE，其描述在1998年1月30日提交的美国专利号6,127,533中，其内容通过引用方式并入本文。其它优选的修饰包括2'-甲氧基(2'-0--CH3)、2'-氨基丙氧基(2'-OCH2CH2CH2NH2^n2'-氟(2'-F)。也可在所述寡核苷酸的其它位置产生相似的修饰，特别是3'末端核苷酸或2'-5'连接的寡核苷酸的糖基的3'位置。如在本文中使用的术语"糖取代基"或"2'-取代基团"，包括结合到有氧原子或没有氧原子的呋喃核糖基部分的2'位置的基团。糖取代基包括但不局限于氟、O-垸基、O-垸氨基、O-烷基烷氧基、保护的O-烷氨基、O-垸氨基烷基、0-垸基咪唑和式(O-烷基)m的聚醚，其中m是1至大约10。这些聚醚中优选的是线性和环状聚乙二醇(PEGs)和包含PEG的基团，例如冠醚以及Ouchietal.(DrugDesignandDiscovery1992,9:93)、Ravasioetal.(J.Org.Chem.1991,56:4329)禾口Delgardoet.al.(CriticalReviewsinTherapeuticDrugCarrierSystems1992,9:249)公开的基团，其中每一个通过引用方式将其全部内容并入本文。其它糖基修饰由Cook(Anti-HuntingtindiseaseDrugDesign,1991,6:585-607)所公开。氟、o-垸基、o-垸氨基、o-烷基咪唑、o-烷氨基垸基和烷基氨基取代描述于美国专利6,166,197中，其名称为"具有2'和5'取代的嘧啶核苷的寡聚化合物(OligomericCompoundshavingPyrimidineNucleotide(s)with2'and5'Substitutions)"在此通过引用将其全部内容并入本文。适用于本发明的其它糖取代基包括2'-SR和2'-NR2基，其中每一个R独立地是氢、保护基或者取代的或非取代的垸基、烯基或炔基。2'-SR核苷公开于美国专利号5,670，633中，在此通过引用将其全部内容并入本文。2'-SR单体合成纤维的并入公开在Hammetal.(J.Org.Chem.,1997,62:3415-3420)中。2'-NR核苷公开于Goettingen,M.,J.Org.Chem.,1996,61,6273-6281和Polushinetal.,TetrahedronLett.,1996,37,3227-3230中。适用于本发明的其它代表性2，-取代基团包括具有式I或式II之一的基团E是d-d。烷基、N(Q3)(Q4)或N=C(Q3)(Q4);每一个Q3和Q4独立地是H、Crd。烷基、二垸氨基烷基、氮保护基、栓系的和未栓系的轭合基(tetheredoruntetheredconjugategroup)、固相支持物的连接体；或者Q3和Q4—起形成氮保护基团或环结构，该环结构任选地包括至少一个附加的选自N和O的杂原子；是1-10的整数；q2是l-10的整数；q3是0或1;q4是O、1或2;每一个Z,、Z2和Z3独立地是CrC7环烷基、C5-C,4芳基或C3-d5杂环，其中在所述杂环基团中的杂原子选自氧、氮和硫；Z4是OM,、SM!或N(M^;每一个Mi独立地是H、d-CV烷基、C广Q卤代烷基、C(=NH)N(H)M2、C(=0)N(H)M2或OC(=0)N(H)M2;M2是H或d-C8垸基；并且z5是Ci-Cto烷基、Ci-ck)卣代烷基、C2-Ci。烯基、C2画Ckj快基、Q画Cm芳基、N(Q3)(Q4)、OQ3、卤素、SQ3或CN。式I的代表性2'-0-糖取代基公开于美国专利号6,172,209中，其名称为"加帽的2，-O-乙氧基寡核苷酸(Capped2'-OxyethoxyOligonucleotides)"，在此通过引用将其全部内容并入本文。式II的代表性2'-0-糖取代基公开于美国专利号6，271，358中，其名称为"构象再改造的、RNA靶向的2'修饰的寡核苷酸(RNATargeted2'-ModifiedOligonucleotidesthatareConformationallyPreorganized)，，，在此通过引用将其全部内容并入本文。在核糖环上具有O-取代基的糖基也适用于本发明。环O的代表性取代基包括，但不局限于S、CH2、CHF禾nCF2，参见例如Secristetal.,Abstract21，Program&Abstracts,TenthInternationalRoundtable,Nucleosides,NucleotidesandtheirBiologicalApplications,ParkCity,Utah,Sep.16-20,1992。寡核苷酸也可具有糖基模拟物，例如环丁基部分，其代替呋喃戊糖。涉及制备此类修饰的糖基的代表性美国专利包括，但不局限于美国专利号4,981,957、5,118,800、5,319,080、5,359,044、5,393,878、5,446,137、5,466,786、5,514,785、5,519,134、5,567,811、5,576,427、5,591,722、5'597，卯9、5,610,300、5,627,05315、639,873、5,646,265、5,658,873、5,670,633、5,700,920和5,859,221，将它们通过引用并入本文。也可在寡核苷酸的其它位置上进行另外的修饰，特别是3'末端核苷酸的糖基的3'位置。例如，本发明的轭合配体的寡核苷酸的其它修饰包括将一个或多个其它非配体部分或轭合物化学连接到寡核苷酸上，所述非配体部分或轭合物增强该寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取。此类部分包括但不局限于脂质部分，例如胆固醇部分(Letsingeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86,6553)，胆酸(Manoharanetal.，Bioorg.Med.Chem.Lett.,1994，4,1053)，硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(hexyl-s-tritylthiol)(Manoharanetal.,Ann.N.Y.Acad.Sci"1992，660，306;Manoharanetal"Bioorg.Med.Chem.Let"1993,3，2765)，硫代胆固醇(Oberhauseretal.，Nucl.AcidsRes.,1992,20,533)，脂肪链，例如十二烷二醇(dodecandiol)或H~—烷残基(Saison-Behmoarasetal.,EMBO丄，1991,10，111;Kabanovetal"FEBSLett.,1990,259,327;Svinarchuketal"Biochimie,1993,75,49)，磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙胺1,2-二-0-十六垸基-夕卜消旋-甘油-3-H-磷酸酯(Manoharanetal.,TetrahedronLett,1995,36,3651;Sheaetal"Nucl.AcidsRes.,1990,18，3777)，聚胺或聚乙二醇链(Manoharanetal.，Nucleosides&Nucleotides,1995，14,969)，或者金刚烷乙酸(Manoharanetal.:TetrahedronLett,1995,36,3651)，棕榈基部分(Mishraetal.,Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229)，或者十八胺或己胺-羰基-氧基胆固醇部分(Crookeetal.,J.Pharmacol.Exp.Ther.,1996，277,923)。涉及制备此类寡核苷酸轭合物的代表性美国专利包括但不局限于美国专利号4,828,979、4,948,882、5,218,105、5,525,465、5,541,313、5,545,730、5,552,538、5,578,717、5,580,731、5,580,731、5,591,584、5,109,124、5,118,802、5,138,045、5,414,077、5,486,603、5,512,439、5,578,718、5,608,046、4,587,044、4,605,735、4,667,025、4,762,779、4,789,737、4,824,941、4,835,263、4,876,335、4,904,582、4,958,013、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,082,830、5,112,963、5,214,136、5,245,022、5,254,469、5,258,506、5,262,536、5,272,250、5,292,873、5,317,098、5,371,241、5,391,723、5,416,203、5,451,463、5,510,475、5,512,667、5,514,785、5,565,552、5,567,810、5,574,142、5,585,481、5,587,371、5,595,726、5,597,696、5,599,923、5,599,928和5,688,941,其中每一个并入本文作为参考。本发明也包括使用了寡核苷酸的组合物，其对于寡核苷酸内的具体位置基本上是手性纯的。基本上手性纯的寡核苷酸的实例包括，但不局限于具有硫代磷酸酯基的寡核苷酸，其具有至少75%Sp或Rp(Cooketal.,U.S.Pat.No.5,587,361)，以及具有基本上手性纯(Sp或Rp)的垸基磷酸酯基、氨基磷酸酯基或磷酸三酯连接的寡核苷酸(Cook,美国专利号5,212,295和5,521,302)。在某些情况下，可由非配体基团修饰所述寡核苷酸。已将许多非配体分子轭合到寡核苷酸上以增强该寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄取，并且可在科学文献中得到实施此类轭合的方式。此类非配体部分包括脂质部分，例如胆固醇(Letsingeretal"Pro"Natl.Acad.Sci.USA,1989，86,6553)，胆酸(Manoharanetal.，Bioorg.Med.Chem.Lett.，1994,4，1053)，硫醚，例如己基-S-三苯甲基硫醇(Manoharanetal.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，1992，660,306;Manoharanetal.，Bioorg.Med.Chem.Let.，1993，3,2765)，硫代胆固醇(Oberhauseretal.，Nucl.AcidsRes.,1992,20,533)，脂肪链，例如十二烷二醇或H-—烷残基(Saison-Behmoarasetal.,EMBOJ.,1991,10，111;Kabanovetal,,FEBSLett"1990，259,327;Svi腦huketal.,Biochimie,1993，75,49)，磷脂，例如二-十六烷基-外消旋-甘油或三乙胺1,2-二-0-十六垸基-外消旋-甘油-3-H-磷酸酉旨(Manoharanetal.,TetrahedronLett"1995,36，3651;Sheaetal.，Nucl.AcidsRes.,1990,18,3777)，聚胺或聚乙二醇链(Manoharanetal.,Nucleosides&Nucleotides,1995，14,969)，或者金刚烷乙酸(Manoharanetal.，TetrahedronLett"1995，36，3651)，棕榈基部分(Mishraetal"Biochim.Biophys.Acta,1995,1264,229)，或者十八胺或己胺-羰基-氧基胆固醇部分(Crookeetal.,J.Pharmacol.Exp.Ther.，1996，277，923)。教导制备此类寡核苷酸轭合物的代表性美国专利已在上文中列出。典型的轭合方案包括在序列的一个或多个位置合成具有氨基连接体的寡核苷酸。随后使用合适的偶联或激活反应试剂使该氨基与被轭合分子反应。所述轭合反应可与结合到固体支持物上的寡核苷酸进行或寡核苷酸裂解之后在液相中进行。通过HPLC对寡核苷酸轭合物的纯化通常得到纯的轭合物。可选地，可将被轭合分子转化为构建单元，例如亚磷酰胺，其通过该分子中的醇基或通过附着具有醇基的连接体(其可被亚磷酸酯化)而实现。重要的是，这些方法中的每一个可用于合成轭合配体的寡核苷酸。可使用偶联剂或在激活配体作为NHS或五氟苯酯(pentfluorophenolateester)后，将连接氨基的寡核苷酸与所述配体偶联。可将氨基己醇连接体附着于羧基上，其后通过末端醇官能基的亚磷酸酯，来合成配体亚磷酰胺。其它连接体，例如半胱胺，也可用于与合成的寡核苷酸中的氯乙酰基连接体进行轭合。III.包含dsRNA的药用组合物在一个实施方案中，本发明提供了包含以上描述的dsRNA和在以下描述的药用可接受载体的药用组合物。包含dsRNA的药用组合物用于治疗与HD基因的表达和活性相关的疾病或紊乱。在另一个实施方案中，本发明提供了包含经设计耙向HD基因的不同区域的至少2种dsRNA的药用组合物和药用可接受的载体。在此实施方案中，如以上部分中所描述制备单个dsRNAs，其通过引用并入本文。一个dsRNA具有与HD基因的至少一部分基本上互补的核苷酸序列；制备其他dsRNAs时，其每一个都具有与HD基因的不同部分基本上互补的核苷酸序列。可将所述多种dsRNAs组合到相同的药用组合物中，或分别配制。如果分别配制，则这些分别包含单个dsRNAs的组合物可包含相同或不同的载体，并使用相同或不同的施用途径来施用。然而，包含单个dsRNAs的药用组合物可在当日或治疗期间内基本上同时、依次或以预定时间间隔施用。本发明的药用组合物以足以抑制HD基因表达的剂量施用。本发明人发现由于其功效已得以改善，包含本发明的dsRNA的组合物可以以惊人的低剂量施用。最大剂量为每天每公斤接受者体重给予5mg的dsRNA足以抑制或完全压制HD基因的表达。通常，dsRNA的合适剂量在每天每公斤接受者体重0.01-0.5微克的范围内，优选在每天每公斤接受者体重0.1-200微克的范围内，更优选在每天每公斤接受者体重0.1-100微克的范围内，再更优选在每天每公斤接受者体重1.0-50的微克范围内，最优选在每天每公斤接受者体重1.0-25微克的范围内。所述药用组合物可每天施用一次，或者所述dsRNA在当日以合适的间隔按2、3、4、5、6或更多亚剂量施用。在此情况下，包含在每个亚剂量中的dsRNA必须相应的更少以达到总的每日剂量。也可复合所述剂量单位用于几天内的递送，例如使用常规的持续释放制剂，其提供了几天期间内的dsRNA的持续释放。持续释放制剂是本领域已知的。在此实施方案中，所述剂量单位包含每曰剂量的相应倍数。本领域技术人员可认识到某些因素影响到有效治疗受试者所需的剂量和时间，其中包括但不局限于疾病或紊乱的严重性、之前的治疗、受试者的总体健康状况和/或年龄，以及其他已有疾病。而且，对受试者使用治疗有效量的组合物的治疗包括单次治疗或一系列治疗。对包括在本发明中的个别dsRNAs有效剂量和体内半衰期的估算可使用常规的方法或基于使用合适的动物模型的体内测试来进行，如其在本文其他部分所描述的。小鼠遗传学的进展已经产生了许多用于研究多种人类疾病如亨廷顿病的小鼠模型。此类模型用于在体内测试dsRNA,以及用于确定治疗有效的剂量。本发明包括的药用组合物可通过本领域已知的任何方式施用，包括但不局限于口服或胃肠外途径，包括颅内(包括薄壁组织内和脑室内)、鞘内、硬脑膜外、静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下、透皮、气道(气雾剂)、鼻内、直肠内、阴道内和局部(topical)(包括口腔和舌下)施用。在优选的实施方案中，所述药用组合物通过静脉内、鞘内或颅内输注或注射施用。对于肌肉内、颅内、鞘内、皮下和静脉内使用，本发明药用组合物通常以灭菌的水溶液或混悬液的形式提供，所述溶液或混悬液被缓冲到合适的pH和渗透压。合适的水性载体包括荣格式溶液(Ringer，ssolution)和等渗氯化钠。在优选的实施方案，所述载体仅仅由水性缓冲液组成。在此情况下，"仅仅"表示不存在可能影响或调节表达HD基因的细胞中dsRNA摄取的辅助试剂或包衣(或包膜)物质。此类物质包括,例如，胶束结构(micellarstructure),例如下文描述的脂质体或衣壳。令人惊奇的是，本发明人发现仅包含裸露的dsRNA和生理可接受溶剂的组合物被细胞所摄取，其中所述dsRNA有效抑制HD基因的表达。尽管将dsRNA引入细胞需要显微注射、脂质转染、病毒、类病毒、衣壳(capsid)、类壳体(capsoids)或其他辅助试剂，但令人惊讶的是，这些方法和试剂不是dsRNA体内摄取所必需的。本发明的水性混悬液包含悬浮剂(例如纤维素衍生物、藻酸钠(sodiumalginate)、聚乙烯-吡咯烷酮和黄芪胶)和湿润试剂(例如卵磷脂)。水性混悬液的合适防腐剂包括对羟基苯甲酸乙酯和对羟基苯甲酸丙酯。本发明可用的药用组合物也包括胶囊(或包衣、包膜)制剂以防止dsRNA从机体快速消除，例如控制释放的制剂，其包括植入体和微囊递送系统。可使用生物可降解的、生物相容性的聚合物，如乙烯-醋酸乙烯共聚物、聚酸酐、聚乙醇酸、胶原蛋白、聚原酸酯和聚乳酸。制备此类制剂的方法对本领域技术人员而言是显而易见的。所述材料也可从AlzaCorporation和NovaPharmaceuticals,Inc处购得。脂质体混悬液(包括靶向具有抗病毒抗原的单克隆抗体的感染细胞的脂质体)也可用作药用可接受载体。这些可根据对本领域技术人员已知的方法来制备，例如在美国专利号4,522,811;PCT公布WO91/06309和欧洲专利申请EP-A-43075中公布的方法，其通过引用方式并入本文。使用先前描述的小干扰RNA载体，本发明也提供了用于将小干扰RNA递送至大脑的耙标位置的设备、系统和方法。递送所设想的途径是通过使用植入的、留置导、薄膜组织内导管，其提供了直接注射包含本发明的dsRNA的小剂量流体至局部脑组织中的方法。递送的另一个设想的途径是通过使用植入导管、留置、薄膜组织内导管，其提供了直接注射包含本发明的dsRNA的小剂量流体至脑脊液中的方法。可将这些导管的近末端连接于经手术固定到患者头盖骨的、植入的、大脑内的进入孔，或连接于位于患者躯干上的植入药物泵。可选地，可使用可植入的递送设备，例如可植入的泵。本发明范围内的递送设备的实例包括Model8506调研设备(由Minneapolis,Minn.Medtronic,Inc.制造)，其可植入于头盖骨的皮下，并提供进入孔，治疗剂可通过该进入孔被递送至大脑。递送通过立体定向植入的聚亚氨酯导管进行。能够与Model8506进入孔一同发挥作用的2个导管模型包括Medtronic,Inc.的Model8770脑室导管用于递送至大脑内室，其公开在美国专利号6,093,180中，其通过引用方式并入本文，和Medtronic,Inc.的IPA1导管用于递送至大脑组织本身(即器官内(intraparenchymal)递送)，其公开在美国专利号09/540,444和09/625，751中，其通过引用并入本文。后者的导管在其末端具有多个出口以通过导管线路递送治疗性试剂至多个位点。除了上述设备，可通过很多种设备实现本发明的小干扰RNA载体的递送，包括但不局限于美国专利号5,735,814、5,814,014和6,042,579中所述，所有这些都通过引用方式并入本文。通过本发明的教导，本领域技术人员能够认识到这些设备和其它设备和系统适用于治疗本发明的神经退行性变性疾病的小干扰RNA载体的递送。在一个实施方案中，所述方法还包括在大脑外植入泵的步骤，所述泵偶联到所述导管的近末端，操作该泵以递送预定剂量的至少一种小干扰RNA或小干扰RNA载体使其通过该导管的流出部位。另一实施方案包括为所述大脑外部的泵周期性更新至少一种小干扰RNA或小干扰RNA载体的供给。因此，本发明包括使用可植入的泵和导管递送小干扰RNA，如在美国专利号5,735,814和6,042,579中所教导的，以及还使用传感器作为输液系统的一部分来调控递送至大脑的小干扰RNA载体的量，如在美国专利号5,814,014中教导的。可根据本发明的方法使用其他设备和系统，例如在美国专利申请09/872,698(2001年6月1日提交)和09/864,646(2001年5月23日提交)中所公开的设备和系统，其通过引用方式并入本文。可通过标准药学程序在细胞培养物或试验动物中确定这些化合物的毒性和治疗功效，例如用于确定LD50(50。/。群体致死的剂量)和ED50(50y。群体治疗有效的剂量)。毒性和治疗效果之间的剂量比率是治疗指数，并且其可表示为LD50/ED50的比率。优选表现出高治疗指数的化合物。从细胞培养物分析和动物研究中得到的数据可设计用于人类的剂量范围。本发明的组合物的剂量优选地在毒性很小或没有毒性的ED50的循环浓度的范围内。所述剂量依赖于所应用的剂量形式和所使用的施用途径而在此范围内变动。对于在本发明的方法中使用的任何化合物，可根据细胞培养分析对治疗有效剂量做最初评估。可在动物模型中设计剂量以达到所述化合物的循环血浆浓度范围，或者当合适时是靶序列的多肽产物(例如达到所述多肽的降低的浓度)的循环血浆浓度范围，其中包括在细胞培养中确定的IC5o(即，测试化合物达到病症最大抑制一半的浓度)。此类信息可用于更准确地确定在人类中的有用剂量。可以测量血浆中的水平，例如通过高效液相色谱测量。除了上文所讨论的其单独使用或多种施用外，本发明的dsRNA可与其它在治疗疾病中有效的已知试剂组合施用。在任何情况下，施用的医师可根据使用本领域已知的或在本文中描述的标准功效测量方法所观察到的结果调整dsRNA施用的量和时间。用于治疗由HD基因表达所引起的疾病的方法在一个实施方案中，本发明提供了用于治疗患有HD基因或HD基因的突变体形式的表达所引起的疾病或处于发展为该疾病的风险中的受试者的方法。在此实施方案中，所述dsRNA作为用于控制HD基因表达的治疗剂发挥作用。所述方法包括向患者(例如人)施用本发明的药用组合物，从而至少部分地减少HD基因的表达。因为其高度特异性，本发明的dsRNAs特异性地靶向HD基因的mRNAs。神经退行性变性疾病亨廷顿病也称为亨廷顿舞蹈症、慢性进行性舞蹈症和遗传性舞蹈症。亨廷顿病是常染色体显性遗传紊乱，其特征在于舞蹈形式的运动和进行性智力退化，通常开始于中年(35—55岁)。该疾病同等地影响男女两性。尾状核萎縮(caudatenucleusatrophies)、小细胞群落退化以及神经递质，氨基丁酸(GABA)和物质P的水平降低。这些退化导致CT扫描中见到的特征性的"车厢式心室(boxcarventricles)"。与亨廷顿病有关的基因(IT-15)位于4号染色体短臂的末端。在此基因的编码区域发生突变并产生不稳定的扩展的三核苷酸重复(胞嘧啶核苷-腺嘌呤核苷-鸟嘌呤核苷)，产生具有扩展的谷氨酸序列的蛋白质。该蛋白质(术语称为亨廷顿(Huntingtin))的正常功能和异常功能是未知的。异常的亨廷顿蛋白似乎在转基因小鼠的神经元核中积聚，但这种积聚与神经元死亡之间的因果关系还不确定。本文所用"亨廷顿(Huntingtin)"或"HD"表示任何与亨廷顿病的发展或维持相关的亨廷顿蛋白、肽或多肽。术语"亨廷顿(Huntingtin)"和"HD"也指编码任何亨廷顿蛋白、肽或多肽的核酸序列，例如亨廷顿RNA或亨廷顿DNA(参见例如VanDellenetal.，Jan.24,2004，Neurogenetics)。症状和体症在不知不觉中发展。痴呆或精神障碍，其变化范围从情感冷淡和易怒至完全的双向障碍或精神分裂样疾病，可早于运动紊乱或在其过程中发展。快感缺乏或相关行为可以是最早的行为表现。运动表现包括极端的忽然运动、轻快歩伐、运动不安(不能维持运动动作，例如吐舌头)、面部扭曲、运动共济失调和肌张力障碍。目前没有针对亨廷顿病的治疗。通过安定药(例如口服氯丙嗪100-900mg/天或者口服氟哌丁苯10-90mg/天)或者开始口服利血平0.1mg/天直至嗜睡、高血压和震颤性麻痹的副作用发生，通常只可以部分地抑制舞蹈性运动和激云力行为(agitatedbehaviors)。因此，本发明的另一个实施方案提供了施用于人特别是人脑的纹状体的抗亨廷顿的dsRNA，用于治疗亨廷顿病。包括在本发明内的药用组合物可通过本领域已知的任何方式施用，包括但不局限于口服和胃肠道外途径，其中包括颅内(包括薄壁组织内和脑室内)、鞘内、硬(脑)膜上、静脉内，肌肉内、腹膜内、皮下、透皮、气道(气雾剂)、鼻内、直肠内、阴道内和局部(包括口腔和舌下)施用。在优选的实施方案中，所述药用组合物通过静脉内、鞘内或颅内输注或注射而施用。抑制HD基因表达的方法在另一个方面内，本发明提供了在哺乳动物内抑制HD基因表达的方法。所述方法包括向哺乳动物施用本发明的组合物，从而沉默靶HD基因的表达。因为其高度的特异性，本发明的dsRNAs特异性地靶向靶HD基因的RNAs(原始的或处理的)。使用dsRNAs抑制这些HD基因表达的组合物和方法可如本文其它地方的描述来进行。在一个实施方案中，所述方法包括施用包含dsRNA的组合物，其中所述dsRNA包含与待治疗哺乳动物的HD基因的RNA转录本的至少一部分互补的核苷酸序列。当所述待治疗的生物体是哺乳动物例如人时，所述组合物可通过本领域已知的任何方式施用，包括但不局限于口服和胃肠道外途径，其中包括颅内(包括薄膜组织内和脑室内)、鞘内、硬膜上、静脉内，肌肉内、腹膜内、皮下、透皮、气道(气雾剂)、鼻内、直肠内、阴道内和局部(包括口腔和舌下)施用。在优选的实施方案中，所述药用组合物通过静脉内、鞘内或颅内输注或注射而施用。除非另有定义，本文所使用的所有技术和科学术语与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的具有相同的意思。尽管与本文所描述的相似或等效的方法和材料可用在本发明的实践或实验中，但下文描述了适宜的方法和材料。将所有在本文中提到的出版物、专利申请文件、专利和其它参考文献的全部内容并入本文作为参考。如有矛盾，以本说明书(包括定义)为准。另外，材料、方法和实施例只用于举例说明而非旨在限制。具体实施例方式HD基因的基因步移(genewalking)使用BioEditSequenceAlignmentEditor的ClustalW多重比对功能产生人(NM-002111)、小鼠(NM—010414)和大鼠(U18650)mRNA序列的完全比对。通过该软件的嵌入序列分析功能鉴定保守区域。对不包含内部缺口所有比对的序歹!j，保守区域定义为具有最短19个碱基的序列延伸(sequencestretches)。根据人类序列对保守区域的序列位置进行计数。使用WhiteheadInstituteforBiomedicalResearch(http:〃jura.wi.mit.edu/siRNAext/)(Yuanetal.，Nucl.Acids.Res.200432:W130-W134)的siRNA设计网页界面鉴定靶向所述保守区域的所有可能的siRNAs，以及其各自对人、小鼠和大鼠RefSeq数据库中序列的未靶向结果。将满足交叉反应性标准的siRNA从候选库中选出并用软件嵌入未靶向分析(softwareembeddedoff-targetanalysis)。对此，通过NCBIBlast算法针对NCBI人、小鼠和大鼠RefSeq数据库对所有选择的siRNAs进行三轮分析。下载并分析Blast结果以提取所述反义链的最佳未靶向结果的同一性以及发生错配的位置。根据预测的特性对所有候选siRNA排序。对此，使用不同的标准以鉴定具有以下特性的siRNA:耙向人、小鼠和大鼠的序列(给定的交叉反应性)，在行中缺少多于3Gs的延伸，缺少人、小鼠或大鼠的预测的未靶向结果。选择并合成包含所使用的标准物的siRNAs(表1和2)。如在反义领域工作的人员所经历的，核糖核酸经常被几乎出现在所有生物学环境中的许多核酸酶快速降解，例如核酸内切酶、核酸外切酶等。这种易损性可通过化学修饰这些寡核苷酸而得以规避，从而使核酸酶不能被攻击。因此，使用2'-0-甲基取代(表2)合成siRNA，并测试其对内源HD基因表达(HDmRNA水平)的体外抑制活性。dsRNA合成试剂的来源在本文中如试剂的来源没有特别说明，则此类试剂来自分子生物学应用的质量/纯度标准的任何分子生物学试剂供应商。表1:测试HD基因表达抑制活性的dsRNAs的序列和活性<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>双链体名称全部19mer耙位点的序列SE有义链序列(5'-3')SE反义链序列(5'-3')SE剩余HD基因QQQ的mRNA[对IDIDID照的百分比]NO:NO:NO:AD-11016cugggcaucgcuauggaac367cugggcaucgcuauggaacTT368guuccauagcgaugcccagTT36925土3AD-11017cucggag觀gcgugcugc370cucggaguuugcgugcugcTT371gC3gC3CgCM3CUCCg3gTT37229±3AD-11018uguuaaaggccuucauagc373uguuaaaggccuucauagcTT374gcuaugaaggccuuuaacaTT37542±3AD-11019uuaaaggccuucauagcga376uuaaaggccuucauagcgaTT377ucgcuaugaaggccuuuaaTT37832±4AD-11020gccuucauagcgaaccuga379gccuucauagcgaaccugaTT380ucagguucgcuaugaaggcTT38126±10AD-11021aaggcagcuucggagugac382aaggcagcuucggagugacTT383gucacuccgaagcugccuuTT38427±2AD-11022agguuuaugaacugacguu385agguuuaugaacugacguuTT3863aCgUC3gUUCBU333CCUTT38710±2AD-11023aacugacguuacauc肌ac38833CUg3CgUU3C3UC3imcTT389guaugauguaacgucaguuTT39039±3AD-11024cacaauguugugaccggag391cacaauguugugaccggagTT392cuccggucacaacauugugTT39323±4AD-11025caauguugugaccggagcc394caauguugugaccggagccTT395ggcuccggucacaacauugTT39625±4AD-11026agcagcucuucagaacgcc397agcagcucuucagaacgccTT398ggcguucugaagagcugcuTT39974±11AD-11027guggccgaagccguagugg400guggccgaagccguaguggTT401cc3cu3cggcuucggcc3cTT40232±4AD-11028cguagugggaguauugugg403cguagugggaguauuguggTT404ccsc33U3CucccacuacgTT40526±4AD-11029ggaguauuguggaacuuau楊ggaguauuguggaacuuauTT407auaaguuccac犯u3cuccTT40820±2AD-11030aguauuguggaacuuauag409aguauuguggaacuuauagTT410cuauaaguuccacaauacuTT41135±3AD-11031gagaucggaugucagcagc412gagaucggaugucagcagcTT413gcugcug3cauccg3ucucTT41453±18AD-11032C3gCgCCgUCCC3UCUg3C415cagcgccgucccaucugacTT416gucagaugggacggcgcugTT41749±4AD-11033ccaccgaagggccugauuc418ccaccgaagggccugauucTT419gaaucaggcccuucgguggTT42028±6AD-11034auuguguuagacgguaccg421auuguguuagacgguaccgTT422cgguaccgucuaacacaauTT423111±12AD-11035ccgacaaccaguauuuggg424ccgacaaccaguauuugggTT425cccaaauacugguugucggTT42625±5AD-11036犯3C犯gCCUUgCCgC3UC427333C33gCCUUgCCgC3UCTT428gaugcggcaaggcuuguuuTT42935±4AD-11037gccuugccgcaucaaaggu430gccuugccgcaucaaagguTT431accuuugaugcggcaaggcTT43236±9AD-11038aucuugaacuacaucgauc433aucuugaacuacaucgaucTT434gaucgauguaguucaagauTT43540±5AD-11039aucgaucauggagacccac4363Ucgaucauggagsiccc3cTT437gugggucuccaugaucgauTT43869±5AD-11040uggagacccacagguucga439ugg3gaccc3C3gguucg3丁T440ucgaaccugugggucuccaTT44139±9AD-11041ggagacccacagguucgag442ggagacccacagguucgagTT443cucgaaccugugggucuccTT44465±14AD-11042ccgcuuccacgugggagau445ccgcuuccacgugggagauTT446aucucccacguggaagcggTT44763±2AD-11043ucuuuggcggauugcauuc448ucuuuggcggauugcauucTT449g33UgC33UCCgCCB33g3TT45060±5AD-11044uuggcggauugcauuccuu451uuggcggauugcauuccuuTT45233gg33UgC33UCCgCC肌TT45330±2AD-11045agcagcuacagugaguuag454agcagcuacagugaguuagTT455cuaacucacuguagcugcuTT45664±2AD-11046cgagugcucaauaauguug457cgagugcucaauaauguugTT458caacauuauugagcacucgTT45918±5200680046400.X势溢也被37/59到双链体名称仝部19mer靶位点的序列AD-11047AD-11048AD-11049AD-11050AD-11051AD-11052AD-11053AD-11054AD-11055AD-11056AD-11057AD-11058AD-11059AD-11060AD-11061AD-11062AD-11063AD-11064AD-11065AD-11066AD-11067AD-11068AD-11069AD-11070AD-11071AD-11072AD-11073AD-11074AD-11075AD-11076AD-11077aauuaggcuugucccaaaguggaguuuagguuggcacucuugguucccauuggaucuuuuuggccggaaacuugcuUgCCUUCUCU33C肌3CCCU犯gUCCC3UCCg3Cg333ugauaccucagguccuguugauaccucagguccuguuauguuacaacaaguaaaucccuaggauaccugaaauccucuuuagucgagaaccaaugacuguuuguguucaacaaucaauuguugaagacucucuC肌gUC3C33ggCCg3gC333gUC3C33ggCCg3gC3CggcuuguaccacuacugcuacgacaccucgggaugguucaccucgggaugguuugaucucgggaugguuugaugucagugucacaaagaaccguggugucacaaagaaccgugcaaccgugcagauaagaaugaccgugcagauaagaaugcccgugcagauaagaaugcugcagauaagaaugcuauucacauucguuuguuugaaccugaaccucuuguuauaaaauuuagauuugcuggcgcagugguucaguuacggguuaagggccaguucagggaaucauggaagcgacugucucgacSEQIDNO:460463楊4694724754784814844874卯493496499502505508511514517520523526529532535538541544547550有义链序列(5'-3')aauuaggcuugucccaaagTTuggaguuuagguuggcacuTTcuugguucccauuggaucuTTuuuuggccggaaacuugcuTTugccuucucuaacaaacccTTuaagucccauccg3cga犯TTugauaccucagguccuguuTTgauaccucagguccuguuaTTuguuacaacaaguaaauccTTcuaggauaccugaaauccuTTcuuuagucgagaaccaaugTTacuguuuguguucaacaauTTcaauuguugaagacucucuTTcaagucacaaggccgagcaTTaagucacaaggccgagcacTTggcuuguaccacuacugcuTTacgacaccucgggaugguuTTcaccucgggaugguuugauTTcucgggaugguuugaugucTTagugucacaaagaaccgugTTgugucacaaagaaccgugcTTaaccgugcagauaagaaugTTaccgugcagauaagaaugcTTccgugcagauaagaaugcuTTgcagauaagaaugcuauucTTacauucguuuguuugaaccTTugaaccucuuguuauaaaaTTuuuagauuugcuggcgcagTTugguucaguuacggguuaaTTgggccaguucagggaaucaTTuggaagcgacugucucgacTTSEQIDNO:46146446747047347647948248548849149449750050350650952515518521524527530533536539542545548551反义链序列(5'-3')cuuugggacaagccuaauuTT3gUgCC33CCU333CUCC3TTagauccaaugggaaccaagTTagcaaguuuccggccaaaaTTggguuuguuagagaaggcaTTuuucgucggaugggacuuaTTaacaggaccugagguaucaTTuaacaggaccugagguaucTTggauuuacuuguuguaacaTTaggauuucagguauccuagTTcauugguucucgacuaaagTTauuguugaacacaaacaguTTagagagucuucaacaauugTTugcucggccuugugacuugTTgugcucggccuugugacuuTTagcaguagugguacaagccTTaaccaucccgaggugucguTT3UCa33CC3UCCCg3ggUgTTg3C3UC333CC3UCCCg3gTTcacgguucuuugugacacuTTgcacgguucuuugugacacTTcauucuuaucugcacgguuTTgcauucuuaucugcacgguTTagcauucuuaucugcacggTTgaauagcauucuuaucugcTTgguucaaacaaacgaauguTTuuuuauaacaagagguucaTTCUgCgCC3gC333UCU3犯TTuuaacccguaacugaaccaTTugauucccugaacuggcccTTgucgagacagucgcuuccaTT剩余HD基因的mRNA[对照的百分比l54±1444±532±453±1257±543±426±230±581±435±1333±639±439±340±138±527±338±452±1149±1343±1330±636±739±339±337±462±321±480±532±1330±741±5200680046400.X势溢击被38/59u>^-5258147036925001470369250014703692DW6667778888999000l1i11222333444451^4444444444444555555555555555555<formula>formulaseeoriginaldocumentpage42</formula>双链体名称全部19mer靶位点的序列SE有义链序列(5'-3')SE反义链序列(5'-3')SE剩余HD基因QQQ的mRNA[对IDIDID照的百分比]NO:NO:NO:AD-11]09caaaucccaguguuggacc646C333UCCC3gUgUUgg3CCTT647gguccaacacugggauuugTT64853±4AD-1110acucggaguucaaccuaag649acucggaguucaaccuaagTT650cuuagguugaacuccgaguTT65143±3AD-11iicucggaguucaaccuaagc652cucggaguucaaccuaagcTT653gcuuagguugaacuccgagTT65441±6AD-11]12agccuagggaugagugaaa655agccuagggaugagugaaaTT656uuucacucaucccuaggcuTT65734±5AD-11]13guc33C3gcimc3cscgug658gUC33C3gCU3CaC3CgUgTT659cacguguguagcuguugacTT66042±4AD-m14gauggucacccaaaccggg661gauggucacccaaaccgggTT662cccgguuugggugaccaucTT66349±3AD-ii15ugacagaacugcgaagggu664ugacagaacugcgaaggguTT665acccuucgcaguucugucaTT66653±8AD-ii16gaagacgagauccucgcuc667gaagacgagauccucgcucTT668gagcgaggaucucgucuucTT66943±7AD-ii17acgagauccucgcucagua670acgagauccucgcucaguaTT671uacugagcgaggaucucguTT67240±9AD-ii18aaccugaaagggaucgccc673aaccugaaagggaucgcccTT674gggcgaucccuuucagguuTT67581±7AD-1119gaucgcccacugcgugaac676gaucgcccacugcgugaacTT677guucacgcagugggcgaucTT67850±7AD-ii120cacugcgugaacauucaca679cacugcgugaacauucacaTT680ugugaauguucacgcagugTT68140±13AD-n21agaacuauccucuggacgu682agaacuauccucuggacguTT683acguccagaggauaguucuTT68441±8AD-ii122gucaguccggguagaacuu685gucaguccggguagaacuuTT686aaguucuacccggacugacTT68737±10AD-ii23ugaacaaagucaucggaga688ugaacaaagucaucggagaTT689ucuccgaugacuuuguucaTT6卯39±6AD-ii124aagucaucggagaguuucu691aagucaucggagaguuucuTT692agaaacucuccgaugacuuTT69340±2AD-ii125gucaucggagaguuucugu694gucaucggagaguuucuguTT6953C3g犯3CUCUCCg3Ug3CTT69637±4AD-ii126ggccaccgugguguauaag697ggccaccgugguguauaagTT698cuuauacaccacgguggccTT69948±2AD-ii127accgugguguauaaggugu700accgugguguauaagguguTT701acaccuuauacaccacgguT丁70236±2AD-ii128cugacuuguuuacgaaaug703cugacuuguuuacgaaaugTT704cauuucguaaacaagucagTT70533±7AD-ii129uguuuacgaaauguccaca706uguuuacgaaauguccacaTT707uguggacauuucguaaacaTT70846±8AD-ii130ccaccgagccagcuugguc709ccaccgagccagcuuggucTT710gaccaagcuggcucgguggTT71151±12AD-ii131caccgagccagcuuggucc712caccgagccagcuugguccTT713ggaccaagcuggcucggugTT71453±15AD-ii132caggcaacgugcgugucuc715caggcaacgugcgugucucTT716gagacacgcacguugccugTT71746±6AD-ii133aacgugcgugucucugcca718aacgugcgugucucugccaTT719uggcagagacacgcacguuTT72059±6AD-ii134uuaauuuuaacguaacucu721uuaauuuuaacguaacucuTT722agaguuacguuaaaauuaaTT72364±16ADii135uuaacguaacucuuucuau724uuaacguaacucuuucuauTT725auagaaagaguuacguuaaTT72657±6ADii136uaacguaacucuuucuaug727uaacguaacucuuucuaugTT728cauagaaagaguuacguuaTT72972±9ADii137aacguaacucuuucuaugc730aacguaacucuuucuaugcTT731gcauagaaagaguuacguuTT73268±8AD-ii138guaacucuuucuaugcccg733guaacucuuucuaugcccgTT734cgggcauagaaagaguuacTT73569±10AD-ii139uaugcccguguaaaguaug736uaugcccguguaaaguaugTT737C3U3CUUU3C3CgggC3U3TT738102±4<table>tableseeoriginaldocumentpage44</column></row><table>表2:测试HD基因表达抑制活性的、具有稳定化修饰的dsRNAs的序列和活性<table>tableseeoriginaldocumentpage45</column></row><table>双链体名称有义链序列(5'-3')SEQID反义链序列(5'-3')SEQID剩余HD基因的NO:NO:mRNA[对照的百分数]AL-DP-6022acmumacmaumcmgaumcmaumggagaTI842ucuccmaugaucgaugumaguTI84335±18AL-DP-6023aaumcmcmumgcmumumumaguincmgagaTI844ucucgacumaaagcmaggauuTI84526±16AL-DP-6024umgumcmcmaggumumumaumgaacm咖gTI846cmaguucmaumaaaccuggacmaTI84716±5AL-DP-6025cmumcmggagumumcmaacmcmumaagcmTI848gcuumagguugaacuccgagT工84924±6AL-DP-6026umgaaaumcmcmumgcmumumumagumcmgTI850cgacumaaagcmaggauuucmaTI85121±6AL-DP-6027cmagcmumumgumcmctnaggumumumaumgT工852cmaumaaaccuggacmaagcugTI85322±6AL-DP-6028cmgumgaacmaumumcmactnagcmcmagTI854cuggcugugaauguucmacgTI85533±11AL-DP-6029cmumggcmumcmgcmaumggumcmgacmaT工856ugucgaccmaugcgagccmagT工85745±15AL-DP-6030agcmumumgumcmcmaggumumumaumgaT工858ucmaumaaaccuggacmaagcuTI85975±15AL-DP-6031ggcmaaagumgcmumcmumumaggagTI860cuccumaagagcmacuuugccTI86128±10AL-DP-6032gaumcmaumumggaaumumcmcmumaaaTI862uuumaggaauuccmaaugaucT工86325±10AL-DP-6033cmacmumgcmgumgaacmaumumcmacmaTI864ugugaauguucmacgcmagugTI86524±3AL-DP-6034gumcmgagaacmcmaaumgaumggcmTI866gccmaucmauugguucucgacTI86720±1AL-DP-6035cmumumgumcmcmaggumumumaumgaacmTI868guucmaumaaaccuggacmaagT工86928±9AL-DP-6036umgumgaumggcmaumcmaumggcmcmaTI870uggccmaugaugccmaucmacmaTI87150±14AL-DP-6037cmacmaaagaacmcmgumgcmagaumTI872aucugcmacgguucuuugugTI87320±5s讓A合成使用Expedite8909合成仪(AppliedBiosystems,AppleraDeutschlandGmbH,Darmstadt,Germany)并以调整后的孔玻璃(CPG,500A，ProligoBiochemieGmbH,Hamburg,Germany)作为固体支持物，以1pmole的规模，通过固相合成制备单链RNAs。通过固相合成，分别使用相应的亚磷酰胺和2'-0-甲基亚磷酰胺，制备RNA和包含2'-0-甲基核苷酸的RNA(ProligoBiochemieGmbH,Hamburg,Germany)。使用标准的核苷亚磷酰胺化学方法，在寡核苷酸链的序列内的所选位点上并入这些构建单元，所述化学方法利描述于Currentprotocolsinnucleicacidchemistry,Beaucage,S丄.etal.(Edrs.),JohnWiley&Sons，Inc.,NewYork,NY，USA。通过用Beaucage试齐U(ChruachemLtd,Glasgow:UK)的乙氰溶液(l。/。)替换碘氧化剂来引入硫代磷酸酯基。其它辅助试剂来自根据已经建立的程序，通过阴离子交换HPLC进行粗寡核糖核苷酸的去保护和纯化。使用光谱光度计(DU640B,BeckmanCoulterGmbH,UnterschleiBheim,Germany),通过在260nm波长处的各个RNA溶液的UV吸收率确定得率和浓度。以如下方法产生双链RNA:在退火缓冲液(20mM磷酸钠，pH6.8、lOOmM氯化钠)中混合等摩尔的互补链溶液，在85-90°C水浴中加热3分钟并在3-4小时内冷却到室温。退火的RNA溶液储存在-20°C对于合成轭合3'-胆固醇的siRNAs(本文中称为-Chol或-sChol，其依赖于对胆固醇的连接是否通过磷酸二酯基或硫代磷酸二酯基所影响)，使用适当的修饰固相支持物合成RNA。所述修饰的固相支持物按如下进行制备2-氮杂丁烷-l，4-二羧酸二乙酯AA将4.7M氢氧化钠的水溶液(50mL)添加到溶于水的甘氨酸乙酯盐酸盐(32.19g,0.23mole)的搅拌的、冰冷却的溶液(50mL)中。然后，添加丙烯酸乙酯(23.1g,0.23mole)并且在室温下搅拌该混合物直至通过TLC确定该反应完成。19小时后，使用二氯甲烷(3x100mL)萃取该溶液。有机层使用无水硫酸MallinckrodtBaker(Griesheim，Germany)。钠干燥，过滤并蒸发。蒸馏残留物而得到AA(28.8g,6in/。)。3-{乙氧基羰甲基-[6-(9H-芴-9-基甲氧基羰基-氨基)-己酰基]-氨基}-丙酸乙<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>将Fmoc-6-氨基-己酸(9.12g,25.83mmol)溶解于二氯甲烷中(50mL)并用冰冷却。在0°C将二异丙基碳二亚胺(3.25g,3.99mL,25.83mmol)添加到该溶液中。其后，添加氮杂丁烷-1,4-二羧酸二乙酯(5g,24.6mmol)和二甲氨基吡啶(0.305g,2.5mmol)。将该溶液置于室温并进一步搅拌6小时。通过TLC确定该反应的完成。在真空下浓縮所述反应混合物，并添加乙酸乙酯来沉淀二异丙基脲。过滤该悬浊液。用5%盐酸、5%碳酸氢钠和水洗涤该滤液。通过硫酸钠干燥合并的有机层，浓縮以得到粗品，所述组品经柱层析(50%EtOAC/己烷)纯化得到11.87g(88%)的AB。3-[(6-氨基-己酰)-乙氧基羰甲基-氨基]-丙酸乙酯AC<formula>formulaseeoriginaldocumentpage48</formula>在0°C将3-(乙氧基羰甲基-[6-(9H-芴-9-基甲氧基羰基-氨基)-己酰基]-氨基}-丙酸乙酯AB(U.5g，21.3mmol)溶解于含20。/。哌啶的二甲基甲酰胺中。继续搅拌该溶液1小时。在真空中浓縮该反应混合物，向残余物中添加水，用乙酸乙酯提取产物。通过转化成盐酸盐来纯化粗品。3-({6-[17"(1,5-二甲基-己基>10,13-二甲基誦2，3,4,7,8,9，10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-lH-环戊垸并[a]菲-3-基氧基羰基氨蜀-己酰)乙氧基羰甲基-氮基)-丙酸乙酯ADAD将3-[(6-氨基-己酰)-乙氧基羰甲基-氨基]-丙酸乙酯AC的盐酸盐(4.7g，14.8mmol)加入二氯甲烷中。在冰上将该混悬液冷却到0°C。向该混悬液中加入二异丙基乙胺(3.87g,5.2mL，30mmol)。向所得溶液中加入氯甲酸胆固醇酯(6.675g,14.8mmol)。搅拌该反应混合物过夜。该反应混合物用二氯甲垸稀释，并用10%盐酸洗涤。用快速层析纯化该产物(10.3g,92。/。)。l画(6國[17-(l,5國二甲基画aSH0,13國二甲基画2，3,4，7,8,9,10,ll,12,13,14,15,16,17誦十四氢-lH-环戊烷并[a]菲-3-基氧基羰基氨基]-己酰M-氧代-卩比咯垸-3-羧酸乙酯AEAE叔丁醇钾(l.lg,9.8mmol)与30mL干燥甲苯混合。该混合物在冰上冷却到0°C并在20分钟内边搅拌边缓慢加入5g(6.6mmol)二酯AD。在加入期间保持温度低于5°C。在0°C继续搅拌30分钟，再加入1mL冰乙酸，随后立即加入含4gNaH2P(VH20的40mL水。每次用100mL二氯甲烷提取所得混合物，提取2次，混合的有机提取物每次用lOmL磷酸缓冲液洗涤，洗涤2次，干燥并蒸发至干。将残留物溶解在60mL甲苯中，冷却到0°C并用3份50mL的冷却的、pH9.5的碳酸盐缓冲液提取。水相提取物用磷酸调整到pH3，并用5份40mL的氯仿提取，合并提取液，干燥并蒸干。使用25%乙酸乙酯/己烷，通过柱层析纯化该残留物，得到1.9g的b-酮酯(39M)。-氨基甲酸17-(1,5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7，8,9，10,ll，12,13,14，15,16，17-十四氢-lH-环戊垸并[a]菲-3-基酯AFAF在1小时内将甲醇(2mL)逐滴加入到含b-酮酯AE(1.5g，2.2mmol)和硼氢化纳(0.226g,6mmol)的四氢呋喃(10mL)的回流混合物中。在回流温度下继续搅拌1小时。在冷却到室温后，加入1NHC1(12.5mL)，用乙酸乙酯(3x40mL)提取该混合物。合并的乙酸乙酯层通过无水硫酸钠干燥并在真空中浓縮以得到产物，通过柱层析(10%MeOH/CHCl3)纯化所述产物(89y。)。(6-{3_[二_(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲蜀-4-羟基-卩比咯烷-1-基}-6-氧代-己基)-氨基甲酸17-(1，5-二甲基-己基)-10,13-二甲基-2,3,4,7,8,9,10,11,12，13,14，15,16，17-十四氢-lH-环戊烷并[a]菲-3-基酯AGAG与吡啶(2x5mL)—同通过真空蒸发来干燥二醇AF(1.25gm1.994mmol)。边搅拌边加入无水吡啶(IOmL)和4,4，-二甲氧基三苯甲基氯(0.724g,2.13mmol)。在室温下进行该反应并过夜。通过加入甲醇结束该反应。在真空中浓縮该反应混合物并向残留物中加入二氯甲烷(50mL)。用1M碳酸氢钠水溶液洗涤该有机层。该有机层通过无水硫酸钠干燥、过滤并浓縮。通过与甲苯一同蒸发去除残留的嘧啶。通过柱层析(2%MeOH/氯仿，在5。/。MeOH/CHCl3中，Rf=0.5)纯化粗品(1.75g，95%)。琥珀酸单-(4-[二-(4-甲氧基-苯基)-苯基-甲氧基甲基]-1-{6-[17-(1,5-二甲基-己基)-10，13-二甲基2，3,4，7,8，9,10，11,12,13,14,15,16，17-十四氢-lH-环戊垸并[a]菲-3-基氧基羰基氨基]-己酰}-吡咯烷-3-基)酯AH将化合物AG(1.0g,1.05mmol)与琥珀酸酐(0.150g，1.5mmol)及DMAP(0.073g,0.6mmol)混合，并在40°C的真空中干燥过夜。该混合物溶解在无水二氯乙烷(3mL)中，加入三乙胺(0.318g,0.440mL，3.15mmol)，该溶液在室温下、氩气环境中搅拌16小时。然后将其用二氯甲垸(40mL)稀释，并用冰冷的柠檬酸溶液(5wt%，30mL)和水(2x20mL)洗涤。该有机相通过无水硫酸钠干燥并浓縮至干。该残留物用于以后的步骤。胆固醇衍生化的CPGAI<formula>formulaseeoriginaldocumentpage51</formula>将琥珀酸AH(0.254g，0.242mmol)溶解于二氯甲垸/乙腈(3:2，3mL)的混合物中。向该溶液中依次加入含DMAP(0.0296g，0.242mmol)的乙腈(1.25mL)，含2,2，-二硫代-二(5-硝基吡啶)(0.075g，0.242mmol)的乙腈/二氯甲烷(3:l，1.25mL)。向所得溶液中加入含三苯基膦(0.064g,0.242mmol)的乙腈(0.6ml)。反应混合物在颜色上变为亮橙色。使用腕式振荡器短暂地摇动该溶液(5分钟)。加入长链烷基胺-CPG(LCAA-CPG)(1.5g，61mM)。搅拌该混悬液2小时。CPG通过烧结漏斗过滤并依次用乙腈、二氯甲烷和乙醚洗涤。使用乙酸酐/吡啶掩蔽未反应的氨基基团。通过使用UV仪测量CPG的所达到负载(37mM/g)。具有5'-12-十二垸酸二癸酰胺基团(本文称为"5'-C32-")或5'-胆固醇衍生基团(本文称为"5'-Chol-")的siRNAs的合成如WO2004/065601中所描述，但不包括对于胆固醇衍生物，使用Beaucage试剂进行的氧化步骤，以在核酸寡聚体的5'端引入硫代磷酸酯连接。如下文使用标准命名法，特别是表3中的縮写表示核酸序列。表3:在核酸序列表示中使用的核苷酸单体的缩写。应当认识到这些单体当以寡核苷酸出现时，则通过5'-3'磷酸二酯键相互连接。<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage53</column></row><table>a大写字母代表2'-脱氧核糖核苷酸(DNA)，小写字母代替核糖核苷酸(RNA)在HeLa细胞中筛选抗内源性人HDmRNA表达的HDdsRNAs从美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)获得HeLa细胞，并在37°C、5%C02环境的湿润培养箱(HeraeusHERAcell，KendroLaboratoryProducts,Langenselbold,Germany)内，将其培养于补充以含有10。/。胎牛血清(FCS)(BiochromAG,Berlin,Germany)、100U/ml青霉素、100pg/ml链霉素(BiochromAG,Berlin,Germany)的Ham'sF12(BiochromAG,Berlin,Germany)中。对于用siRNA转染，将HeLa细胞以2.0x104个细胞/孔接种于96孔板中，并直接转染。根据说明书描述用oligofectamine(InvitrogenGmbH,Karlsruhe,Germany)进行siRNA的转染(对于单次筛选使用30nM)。对于剂量响应曲线,siRNA浓度从30nM-14pM以3倍稀释变化。转染后24小时，裂解HeLa细胞，并根据操作规程通过QuantigeneExplore试剂盒(Genosprectra,DumbartonCircleFremont,USA)定量亨廷顿mRNA的水平。将亨廷顿mRNA水平以GAPDHmRNA标准化。对每一个siRNA，收集4个个别的数据点。使用与HD基因无关的siRNA双链体作为对照(VEGFCtrl)。给定HD-特异siRNA双链体的活性表示为，相对于用对照siRNA双链体处理的细胞中亨廷顿mRNA的浓度，在处理的细胞内HDmRNA的百分比浓度。表1提供了4个独立的体外HeLa筛选试验的结果，其中在30nM的单一剂量下测试在表l中给出序列的siRNAs。与对照相比，残留在处理细胞中的HDmRNA百分比士标准偏差显示于表1的最右栏中。图1提供了2个独立的体外HeLa筛选试验的结果，其中在30nM的单一剂量下测试序列在表1中给出的siRNAs。在表2中，双链体的名称以AL-DP-xxxx给出，而在图1中的相同的双链体只显示为"xxxx"。例如，表2中的AL-DP-5997对应于图1中的"5997"。而且，与对照相比，残留在处理细胞中的HDmRNA百分比士标准偏差显示在表2的最右栏中。许多siRNAs在30nM在HeLa细胞中有效降低HDmRNA水平大于70%。表4提供了对于25个选择的siRNAs，来自2—5个独立试验的IC5()、IC80和最大抑制值。在此试验范例中，几个311^^^(以*标示的AL-DP-5997,AL-DP-6000，AL-DP-6001，AL-DP-6014,AL-DP-6020和AL-DP-6032)特别有效，并表现出10—130pM之间的ICso值。表4<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>在神经筛选和U87MG细胞中，筛选抗内源性HDmRNA表达的所选的HDdsRNA从Cellomics(Pittsburgh,PA)获得神经筛选细胞(PC12亚克隆)并在37°C、5%C02环境的湿润培养箱(HeraeusHERAcell,KendroLaboratoryProducts,Langenselbold,Germany)内，将其培养于补充以含有5。/。胎牛血清(FCS)(BiochromAG,Berlin,Germany)、10%DHS(BiochromAG,Berlin,Germany)、100U/ml青霉素、100jig/ml链霉素(BiochromAG,Berlin,Germany)和2mML-谷氨酸(BiochromAG,Berlin,Germany)的RPMI1640(BiochromAG,Berlin,Germany)中。从美国典型培养物保藏中心(Rockville，MD)获得U87MG细胞，并在37。C、5%C02环境的湿润培养箱(HeraeusHERAcell，KendroLaboratoryProducts,Langenselbold,Germany)内，将其培养于补充以含有10。/o胎牛血清(FCS)(BiochromAG，Berlin,Germany)、100U/ml青霉素、100ng/ml链霉素(BiochromAG,Berlin,Germany)的Ham'sF12(BiochromAG,Berlin,Germany)中。使用6个所选的siRNAs(AL-DP-5997,AL-DP-6000,AL-DP-6001,AL-DP-6014,AL-DP-6020andAL-DP-6032)转染神经筛选和U87MG细胞，以与描述HeLa细胞的相似方式使用QuantigeneExplore试剂盒进行亨廷顿和GAPDHmRNA水平的定量。ICso值提供于表5中。在神经筛选(大鼠)和U87MG(人)细胞中，ICso通常比在HeLa细胞中高。在测试的6个siRNAs中，在神经筛选细胞中，AL-DP-6014抗HDmRNA比其他5个siRNAs(AL-DP-5997,AL-DP-6000,AL-DP-6001,AL-DP-6020andAL-DP-6032)明显低效，而在U87MG细胞中，AL-DP-6000抗HDmRNA比其他5个siRNAs(AL-DP-5997,AL-DP-6001,AL-DP-6014,AL-DP-6020andAL-DP陽6032)明显低效。表5.双链体名称神经筛选平均IC50[nM]+/-SDU87MG平均IC50[nM]AL-DP-59976±2.82.7AL-DP-600011.7±109855<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>靶向HD的dsRNAs减少HeLa细胞中的内源性HD蛋白如上所述培养Hela细胞并用100nM指定的siRNAs转染，所述siRNAs包括6个抗HD的siRNAs(AL-DP-5997，AL-DP-6000,AL-DP-6001,AL-DP-6014,AL-DP-6020andAL-DP-6032)和一个对照不相关siRNA(ctrl)。转染后48小时，收集所述细胞并裂解。在8%的变性PAG上分离裂解物中的蛋白质。通过标准的western印记规程，使用结合到该蛋白质的抗体，检测亨廷顿和P-肌动蛋白。对于亨廷顿的检测，用小鼠抗-亨廷顿单克隆抗体(Chemicon，U.K.)探测所述膜，其后用辣根过氧化物酶偶联的羊抗小鼠第二抗体(SantaCruzBiotechnology,California)探测所述膜。用抗肌动蛋白羊多克隆IgG(SantaCruz，Califomia)检测P-肌动蛋白，随后用驴抗羊Ig-HRP第二抗体(SantaCruz,California)检观!j。图2提供了所述结果。AL-DP-5997(5997)、AL-DP-6000(6000)、AL-DP-6001(6001)、AL-DP-6014(6014)、AL-DP-6020(6020)和AL-DP-6032(6032)，相对于对照蛋白P-肌动蛋白，都在IOOnM降低了亨廷顿的水平，而对照非相关siRNA(ctrl)对任何蛋白的水平没有作用。这些结果表明靶向HD的dsRNAs不仅有效降低HDmRNA水平，也降低HD蛋白水平。所选的靶向HD的dsRNAs在脑脊液fCSF)中的稳定性在牛和猪CSF中，测试6个所选的siRNAs(AL-DP-5997,AL-DP-6000,AL-DP-6001，AL-DP-6014,AL-DP-6020和AL-DP-6032)在5uM、经48小时、37°C下的稳定性，并且以在PBS中作为比较。在l、2、4、8、24和48小时时，通过蛋白酶消化，停止在CSF中的温育，而在0和48小时时，停止在PBS中的温育。将过滤后的样品在变性条件下注射到IEX-HPLC上，并通过测量相应峰下的面积(area)，相对于在PBS中0小时所得数值表示此面积，来确定每个单链的回收百分比。图3和表6提供了所述结果。至少90%的AL-DP-5997、AL-DP-6000和AL-DP-6014的有义和反义链两者在牛和猪CSF中得以回收(表6)。相反，尽管92n/。的AL-DP-6001的反义链在牛CSF中得以回收，但只有73%的反义链在猪CSF中得以回收。对于AL-DP-6020和AL-DP-6032，至少19。/。的反义链在牛和猪CSF两者中不可回收。<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>用通过MALDI-TOF发现的实验量(experimentalmasses)，通过比较两个链的所有可能片段的计算的理论量(calculatedtheoreticalmasses),定位AL-DP-6020和AL-DP-6032的下述剪切位点。对于AL-DP-6020的反义链，片段5,-gauuuumaggaauuccmaau-环-P04-3，(SEQIDNO:874)，基于5973.5Da的计算量和5973.0Da的实验量，对应于3，-(n-3)。对于AL-DP-6032的反义链，片段5，-uumaggaauuccmaaugaucTT-3，(SEQIDNO:875)，基于6355.0Da的计算量和6355.0Da的实验量，对应于5，-(n-l)。考虑到这些剪切位点，设计具有其他化学稳定化的2个新双链体，其包括另外的2'-OMe基团(表7):AL-DP-7100(源于AL-DP-6020)和AL-DP-7101(源于AL-DP-6032)。表7:进一步稳定的dsRNAsAL-DP-7100和AL-DP-7101的序列和修饰<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>在37°C的大鼠CSF中，测试4个所选的dsRNAs(AL-DP-5997,AL-DP-6000,AL-DP-6001和AL-DP-7IOO)在5uM经14天、在37°C下的长期稳定性，并且以在PBS中做比较。在CSF中的温育进行O、1、3、5、7、10或14天，而在PBS中的温育进行14天。如上所述处理样品。图4显示了所述结果。对于AL-DP-6000，由于技术原因14天的CSF稳定性时间点无效。所有的4个dsRNAs在37。C的大鼠CSF中、在10-14天内具有高稳定性，反义或有义链损失<30%。在HeLa细胞中，靶向HD的轭合胆固醇的dsRNAs对内源性人HDmRNA表达的功效之前的研究(Soutscheketal.，2004)已经证明了胆固醇轭合对细胞摄取和/或体内siRNA功效的有益效果。我们合成了dsRNAsAL-DP-6982、AL-DP-6983和AL-DP-7130(表8)，它们分别是胆固醇轭合形式的AL-DP-5997、AL-DP-6000和AL-DP-7100，来评估它们在体外和体内的生物活性。如前所述，培养并用ds腦AsAL-DP-6982、AL-DP-6983、AL-DP-7130、AL-DP-5997、AL-DP-6000和AL-DP-7100在30nM-14pM的浓度范围内转染Hela细胞。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>表8:轭合胆固醇的dsRNAsAL-DP-6982、AL-DP-6983和AL-DP-7130的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>注意S代表T和胆固醇之间的硫代磷酸酯，Chol代表轭合的胆固醇。转染后24小时，裂解HeLa细胞，并如上所述对亨廷顿和GAPDHmRNA水平定量。对于每种siRNA，收集4个独立的数据点。使用与HD基因不相关的siRNA双链体作为对照。靶向HD的给定siRNA双链体的活性表示为相对于在用对照siRNA双链体处理的细胞中HDmRNA浓度，在处理的细胞中HDmRNA浓度的百分比。使用XL-fit计算IC^值；从3个独立的测定中计算平均IC^值并显示于表9中。表9:与未轭合的dsRNAsAL-DP-5997、AL-DP-6000和AL-DP-7100相比，轭合胆固醇的dsRNAsAL-DP-6982、AL-DP-6983禾卩AL-DP-7130在HeLa细胞中抗内源性人HDmRNA表达的的功效。<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>未轭合的dsRNAs表现出预期(表4)的体外抗HDmRNA的功效。所述轭合胆固醇的dsRNAs保留了体外抗HDmRNA的生物活性，尽管该功效与未轭合的母体分子相比略微降低。在大鼠和小鼠中，通过CNS施用未轭合的或靶向HD的轭合胆固醇的dsRNAs在体内下调内源性HDmRNA水平为既评估未轭合的或革巴向HD的轭合胆固醇的dsRNAs的体内生物活性又评估其分布，合成基于AL-DP-5997的dsRNAsAL-DP-1997和AL-DP-1998(表10)，其中用5-溴-2，-脱氧尿苷替换反义链的3'端的2个2'-脱氧-胸苷-5，-磷酸核苷酸(在靶向HDmRNA的dsRNA的核苷酸区域之外)。表10:dsRNAsAL-DP-1997和AL-DP-1998的序列<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>注意'B'代表5-溴-2'-脱氧尿苷，下划线指示核苷-5'-硫代磷酸酯，Choi代表轭合的胆固醇。在大鼠中，通过连续纹状体内输注7天，施用1.3mgAL-DP-1997或AL-DP-1998，或者磷酸缓冲盐溶液(PBS，载体对照)。大约250-300g体重的雄性Sprague-Dawley大鼠接受30号输注套管(PlasticsOne,Roanok,VA)的立体定位植入，从而单方面注射靶向纹状体的中心(前后径+0.7mm，中侧+3.0mm，相对于前卤；背腹5mm,相对于头骨表面)。根据操作说明书将小-渗透泵(Mini-osmoticpumps,1007D型)准备过夜，皮下植入，并通过导管连接，以0.5uL/小时递送(每治疗组4只大鼠)PBS、1.1mMAL-DP-1997或1.1mMAL-DP-1998达7天。在7天输注期结束时，处死动物，取出大脑，并快速冷冻包括输注位点的同侧纹状体。每一个大约5-30mg的组织样品通过用超声处理(BANDELINelectronicGmbH&Co.KG，Berlin,Germany),在包含84pg/ml蛋白酶K(Epicentre,Madison,WI)的组织和细胞裂解溶液中(Epicentre,Madison,WI)中进行均匀质化。随后将裂解物在-80。C储存。为了进行bDNA分析，在室温解冻冷冻的裂解物，根据操作说明书使用QuantigeneExplore试剂盒定量亨廷顿和GAPDHmRNA。对于每种组织样品，计算亨廷顿/GAPDH的比率(标准化的亨廷顿mRNA水平)作为4次测定的平均值。随后平均这些比率以获得组(治疗)平均值。未轭合的dsRNA(AL-DP-1997)相对PBS对照组降低标准化的亨廷顿mRNA水平33%，而轭合胆固醇的dsRNA(AL-DP-1998)相对PBS对照组降低标准化的亨廷顿mRNA水平26%。这两个降低具有统计学显著性(pO.05,具有Tukeypost-hoc分析的ANOVA)。这些结果证明纹状体内的AL-DP-1997和AL-DP-1998在体内对下调HDmRNA水平有效。根据相同的试验范例，也发现AL-DP-5997和AL-DP-6000在大鼠中用1.3mg输注7天(以1.1mM浓度0.5uL/小时)后在体内对下调HDmRNA水平有效。AL-DP-5997和AL-DP-6000相对PBS对照组分别降低标准化的亨廷顿mRNA水平34%和36%。另外，AL-DP-5997和AL-DP-6000在皮质组织中相对PBS对照组分别降低标准化的亨廷顿mRNA水平22%和26%。这些结果证明这些未轭合的siRNAs在纹状体输注后，不仅在纹状体内下调HDmRNA水平，也在皮质内下调HDmRNA水平，皮质是亨廷顿病中发生神经元损失的另一个主要脑区域并且位于输注位点的较远位置。在小鼠中，通过20分钟纹状体内输注，施用75ugAL-DP-1998或磷酸缓冲盐溶液(PBS，载体对照)。大约20—25g体重的Balb/c雄鼠接受测试物的单侧注射，所述测试物靶向纹状体(前后径+0.5mm，中侧+2.0mm，相对于前卤；背腹3.5mm,相对于头骨表面)。使用连接有33号针的预填充、泵调控的Hamilton微注射器，以0.25uL/分钟注射(每个测试物4个动物)测试物(l.lmM)。注射后大约72小时，处死动物，取出大脑，并切除包括输注位点的同侧纹状体，快速冷冻。如对大鼠组织样品所做的描述，裂解小鼠组织样品，对亨廷顿和GAPDHmRNA进行定量。对于每个组织样品，计算亨廷顿/GAPDH的比率(标准化的亨廷顿mRNA水平)作为4次测定的平均值。随后平均这些比率以获得组(治疗)平均值。轭合胆固醇的dsRNA(AL-DP-1998)相对于PBS对照组，降低了标准化的亨廷顿mRNA水平33%，其具有统计学显著性(pO.05,具有Tukeypost-hoc分析的ANOVA)。这些结果进一步证实AL-DP-1998在体内对下调HDmRNA水平有效。另外，这些结果证明低至75ug的AL-DP-1998的总纹状体内剂量导致HDmRNA水平的显著下调。权利要求1.双链核糖核酸(dsRNA)，其用于在细胞内抑制人HD基因的表达，其中所述dsRNA包含至少2个彼此互补的序列，并且其中有义链包含第一序列，反义链包含第二序列，所述第二序列包含与编码HD的mRNA的至少一部分基本上互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度小于30个核苷酸，并且其中所述的dsRNA当与表达所述HD的细胞接触时抑制所述HD的表达至少20％。2.权利要求1所述的dsRNA，其中所述第一序列选自表l、2、7、8或10，所述第二序列选自表l、2、7、8或10。3.权利要求1所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一个修饰的核苷酸。4.权利要求2所述的dsRNA，其中所述dsRNA包含至少一个修饰的核苷酸。5.权利要求3或4所述的dsRNA，其中所述修饰的核苷酸选自下组2'-0-甲基修饰的核苷酸、含有5'-硫代磷酸酯基的核苷酸、与胆甾醇的衍生物或十二垸酸双癸酰胺基连接的末端核苷酸。6.权利要求3或4所述的dsRNA，其中所述修饰的核苷酸选自下组2'-脱氧-2'-氟修饰的核苷酸、2'-脱氧修饰的核苷酸、锁定的核苷酸、脱碱基核苷酸、2，-氨基修饰的核苷酸、2，-烷基修饰的核苷酸、吗啉代核苷酸、氨基磷酸酯和含有非天然碱基的核苷酸。7.权利要求3或4所述的dsRNA，其中所述第一序列选自表2，所述第二序列选自表2。8.权利要求3或4所述的dsRNA，其中所述第一序列选自表1、2、7、8或10，所述第二序列选自表l、2、7、8或10。9.细胞，其包括权利要求1所述的dsRNA。10.药用组合物，其用于在生物体内抑制所述HD基因的表达，所述药用组合物包含dsRNA和药用可接受载体，其中所述dsRNA包含至少2个彼此互补的序列，并且其中有义链包括第一序列，反义链包括第二序列，所述第二序列包含与编码HD的mRNA的至少一部分基本上互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度小于30个核苷酸，并且其中所述的dsRNA当与表达所述HD的细胞接触时抑制所述HD的表达至少20%。11.权利要求IO所述的药用组合物，其中所述dsRNA的所述第一序列选自表l、2、7、8或10，所述dsRNA的所述第二序列选自表1、2、7、8或10。12.权利要求IO所述的药用组合物，其中所述dsRNA的所述第一序列选自表2，所述dsRNA的所述第二序列选自表2。13.在细胞内抑制所述HD基因表达的方法，所述方法包括(a)将双链核糖核酸(dsRNA)引入细胞，其中所述dsRNA包括至少2个彼此互补的序列，并且其中有义链包括第一序列，反义链包括第二序列，所述第二序列包括与编码HD的mRNA的至少一部分基本上互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度小于30个核苷酸，并且其中所述的dsRNA当与表达所述HD的细胞接触时抑制所述HD的表达至少20%,和(b)维持步骤(a)中产生的细胞足够的时间以得到所述HD基因的mRNA转录本的降解，从而抑制所述HD基因在所述细胞中的表达。14.治疗、预防或控制亨廷顿病的方法，包括对需要这种治疗、预防或控制的患者施用治疗有效量或预防有效量的dsRNA，其中所述dsRNA包括至少2个彼此互补的序列，并且其中有义链包含第一序列，反义链包含第二序列，所述第二序列包含与编码HD的mRNA的至少一部分基本上互补的互补区域，并且其中所述互补区域的长度小于30个核苷酸，并且其中所述的dsRNA当与表达所述HD的细胞接触时抑制所述HD的表达至少20%。15.载体，其用于在细胞内抑制所述HD基因的表达，所述载体包含可操作地连接至核苷酸序列的调控序列，所述核苷酸序列编码dsRNA的至少一条链，其中所述dsRNA链中的一条与编码HD的mRNA的至少一部分基本上互补，并且所述dsRNA的长度小于30个碱基对，并且其中所述的dsRNA当与表达所述HD的细胞接触时抑制所述HD基因的表达至少20%。16.细胞，其包含权利要求15所述的载体。全文摘要本发明涉及抑制亨廷顿基因(HD基因)表达的双链核糖核酸(dsRNA)，其包含具有长度小于25个核苷酸并且与所述HD基因的至少一部分基本上互补的核苷酸序列的反义链。本发明也涉及包含所述dsRNA的药用组合物和药用可接受载体；使用所述药用组合物用于治疗由所述HD基因和其突变体形式表达所引起的疾病的方法；以及用于在细胞中抑制所述亨廷顿基因表达的方法。文档编号C07H21/04GK101365801SQ200680046400公开日2009年2月11日申请日期2006年10月27日优先权日2005年10月28日发明者大卫·邦克洛特,帕梅拉·谭,比吉特·布拉姆利奇,汉斯-彼得·沃尔洛赫尔,英戈·勒尔,菲利普·哈德维格,黛娜·文意·沙申请人:阿尔尼拉姆医药品有限公司