专利名称：用于制造寡核苷酸的方法
用于制造寡核苷酸的方法 本申请要求2008年4月24日提交的U. S.申请号60/047524的权益，其全部内容 通过引用结合在此。本发明涉及一种用于制造寡核苷酸的方法。寡核苷酸及其衍生物是例如用于癌症 治疗的有用的候选药物。在寡核苷酸的合成过程中，特别是通过亚磷酰胺方法时，氰乙基保护基常见的 是用作磷的保护基。将这些氰乙基团进行脱保护是为了到达最终产物的一个步骤。US专利6，858，715和7，199，236 (其全部内容通过引用结合在本说明书中)描述 了一种将氰乙基保护基进行脱保护的方法，其中必须使用一种胺，该胺的共轭酸具有 一个从约8到约11 WpKa。Eritja et al. Helv. Chim. Acta, Vol 83 (2000) ρ· 1417-1423 披露了使用 DBU 在乙 腈中的0. 5Μ浓溶液将用β -氰乙基保护的寡核苷酸进行脱保护的方法。现在已经出人意料地发现，即便是其共轭酸具有大于11. 5(例如约12)的pKa的 强碱，也可以在特定条件下引起对(例如)氰乙基保护基的实质上完全的脱保护，而同 时基本上避免氰乙基到核碱基(特别是胸苷)的多种加合物的形成。本发明因此涉及一种制造寡核苷酸的方法，该方法包括至少一个步骤，该步骤是 去除消除的保护磷的基团，特别是来自一种受保护的寡核苷酸的氰乙基保护基，其 中所述去除包括使该受保护的寡核苷酸与一种胺溶液在一种溶剂中进行接触，该溶剂优选 不包含吡啶，其中该胺的共轭酸具有一个大于11.5的pKa，并且其中该胺在该溶液中的浓 度是小于0.5摩尔/升。已经出人意料地发现，根据本发明的方法允许以高的选择性和产率对磷受保护的 多种寡核苷酸(特别是对氰乙基保护基)进行特别有效的脱保护。在脱保护的过程中 所不希望的副反应可以基本上避免。该胺在溶液中的浓度是高于0摩尔/升。它优选等于或高于0. 03摩尔/升。胺 在溶液中的浓度经常是低于或等于0. 4，优选低于或等于0. 3摩尔/升，更优选低于或等于 0. 25摩尔/升。这种优选的浓度可以为，例如，低于或等于0. 15摩尔/升，或者低于或等于 0. 1摩尔/升。约0. 05摩尔/升的一种胺浓度给出了良好的结果。与该受保护的寡核苷酸相接触的胺的总量可以变化。在一个实施方案中，该量是 使该胺与这些有待被去除的保护基(特别是氰乙基保护基)之间的摩尔比为等于或大 于1。在另一个实施方案中，与该受保护的寡核苷酸相接触的胺的总量是使该胺与这些 有待被去除的保护基(特别是β-氰乙基保护基)之间的摩尔比为等于或大于0.01并且 等于或小于0.9，优选约0. 1。术语“寡核苷酸”在本发明的框架中具体是指多个核苷单体单元(包括多个连接 到核碱基上的糖单元)的一种寡聚物，所述核苷单体单元通过多个核苷酸间键相连接。一 个“核苷酸间键”具体是指两个核苷部分之间的一个化学连接，例如典型地在天然发现的 核酸中存在的磷酸二酯连接，或者典型地在多种合成核酸以及核酸类似物中存在的其他连接。这种核苷酸间键可以，例如，包括一个磷酸(phospho)或亚磷酸酯基团，并且可能包括 一些连接，在这些连接中磷酸或亚磷酸基团的一个或多个氧原子或被一个取代基修饰、或 被其他原子取代，例如硫原子或者单或二烷基氨基中的氮原子。典型的核苷酸间键是磷酸 的二酯类或其衍生物，例如磷酸酯、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、磷酰胺酯、硫代磷酰胺酯。术语“核 苷”应理解为具体是指由一个核碱基连接到一个糖上所构成的一种化合 物。糖类包括但不限于呋喃糖环，如核糖、2’ -脱氧核糖，以及非呋喃糖环，如环己烯基、脱 水己糖醇、吗啉基。在核苷中所包括的糖中，在下文中指出的修饰、取代以及位置是参考呋 喃糖而讨论的，但是相同的修饰和位置也适用于其他糖环的类似的位置。该糖可以被进一 步修饰。作为糖的修饰的非限制性例子，值得注意地可以提及例如在2’ -或3’ -位置的修 饰，特别是在一个呋喃糖环的2’ -位置的修饰，包括例如氢；羟基；烷氧基，如甲氧基、乙氧 基、烯丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、甲氧乙基、烷氧基、苯氧基；叠氮基；氨基；烷氨 基；氟、氯和溴；2’ _4’ -和3’ _4’ -连接的呋喃糖环修饰，在该呋喃糖环中的修饰包括例如 针对环的4’ -0被S、CH2、NR、CHF或CF2取代。术语“核碱基”应理解为具体是指一个含氮的杂环部分，该部分能够与一个(特别 是互补的)核碱基或核碱基类似物进行配对。典型的核碱基是天然存在的核碱基，包括嘌 呤碱基中的腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，以及嘧啶碱基中的胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)和尿嘧 啶(U)，以及修饰过的核碱基；包括其他合成和天然核碱基，例如5-甲基胞嘧啶(5-me-C)、 5_羟甲基胞嘧啶、黄嘌呤、次黄嘌呤、2-氨基腺嘌呤、腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基和其他烷 基衍生物、腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物、2-硫脲嘧啶、2-硫代胸腺嘧啶和 2_硫代胞嘧啶、5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶、5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶、以及嘧啶碱基的其他 炔基衍生物、6-偶氮尿嘧啶、胞嘧啶和胸腺嘧啶、5-尿嘧啶(假尿嘧啶)、4_硫代尿嘧啶、 8-卤代、8-氨基、8-硫代、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤、5-卤代 特别是5-溴代、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶、7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺 嘌呤、2-氟-腺嘌呤、2-氨基-腺嘌呤、8-氮鸟嘌呤和8-氮腺嘌呤、7-脱氮鸟嘌呤和7-脱 氮腺嘌呤、3-脱氮鸟嘌呤和3-脱氮腺嘌呤、以及氟化的碱基。进一步被修饰的核碱基包括 三环的嘧啶类，例如吩噁嗪胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][l，4]苯并噁嗪-2(3H)_酮)、吩噻嗪 胞苷(1H-嘧啶并[5，4-b][l，4]苯并噻嗪_2 (3H)_酮)，G字夹型物例如一种被取代的吩噁 嗪胞苷(如9-(2_氨基乙氧基)-H-嘧啶并[5，4-b][l，4]苯并噁嗪-2(3H)_酮)、咔唑胞 苷(2H-嘧啶并[4，5-b]吲哚-2-酮)，吡啶吲哚胞苷(H-吡啶并[3’，2’ 4,5]吡咯并[2， 3-d]嘧啶-2-酮)。其他可能的合适碱基包括通用碱基、疏水碱基、混杂碱基(promiscuous bases)禾口尺寸扩大减基(size-expanded bases) 0在根据本发明的方法中，该溶剂经常包括一种卤化的化合物，例如含有1或2个碳 原子的氯代烷，例如二氯甲烷或1，2_ 二氯乙烷。二氯甲烷作为含氯溶剂是优选的。包含氰烷基化合物的溶剂是优选的。乙腈作为氰烷基化合物是优选的。一种主要包含上述化合物的溶剂是优选的。更具体地，该溶剂优选包含乙腈。在本发明中使用的由特定的β-消除的保护磷的基团(Rt)保护的核苷酸间键可 以在以下化学式I中表示
权利要求
1.一种用于制造寡核苷酸的方法，包括从受保护的寡核苷酸上去除β-消除的保护磷 的基团，特别是β-氰乙基保护基，其中所述去除包括使该受保护的寡核苷酸与胺溶液在 溶剂中进行接触，该溶剂优选不是由吡啶组成，其中该胺的共轭酸的PKa优选大于11. 5，并 且其中该胺在该溶液中的浓度小于0. 5摩尔/升。
2.一种用于制造寡核苷酸的方法，该寡核苷酸选自BNA、LNA、ENA、UNA以及它们的衍生 物，该方法至少包括从受保护的BNA、LNA、ENA或UNA-寡核苷酸上去除β -消除的保护磷的 基团、特别是氰乙基保护基的步骤，其中，所述去除包括使该受保护的寡核苷酸与胺在 溶剂中进行接触，其中该胺的共轭酸的PKa大于11. 5，并且该溶剂优选不是由吡啶组成。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中该胺在该溶液中的浓度为0.03至0. 25摩尔 /升。
4.根据权利要求1或2所述的方法，其中该溶剂包含卤化物或氰烷基化合物或者其基 本上由商化物或氰烷基化合物组成。
5.根据权利要求4所述的方法，其中该溶剂包含乙腈或其基本上由乙腈组成。
6.根据权利要求1至5中任何一项所述的方法，其中使该寡核苷酸与该胺溶液接触3 至360分钟的反应时间。
7.根据权利要求6所述的方法，其中该反应时间少于30分钟，优选等于或少于20分钟。
8.根据权利要求1至7中任何一项所述的方法，其中该去除是在10°C到60°C的温度下 进行的。
9.根据权利要求1至8中任何一项所述的方法，其中该受保护的寡核苷酸被附连到固 体载体上。
10.根据权利要求1至9中任何一项所述的方法，其中使用了胺，其共轭酸的PKa为 11. 5至12. 5，优选约12。
11.根据权利要求10所述的方法，其中该胺是DBU(1，8-二氮杂双环[5.4.0]十一 碳-7-烯)。
12.根据权利要求1、或3至9中任何一项所述的方法，其中使用了胺，其共轭酸的pKa 为8至11. 5。
13.根据权利要求1至12中任何一项所述的方法，其中与该受保护的寡核苷酸相接触 的胺的总量是如下的量，使得该胺与这些有待去除的保护基、特别是氰乙基保护基的 摩尔比为等于或大于1。
14.根据权利要求1至12中任何一项所述的方法，其中与该受保护的寡核苷酸相接 触的胺的总量是如下的量，使得该胺与这些有待在脱保护过程中被去除的保护基、特别是 β -氰乙基保护基的摩尔比为等于或大于0. 01，并且等于或小于0. 9，优选约0. 1。
15.根据权利要求1、或3至14中任何一项所述的方法，其中该寡核苷酸选自DNA、RNA、 BNA、LNA、ΕΝΑ、UNA以及它们的衍生物。
全文摘要
一种用于制造寡核苷酸的方法，该方法包括从一种受保护的寡核苷酸上去除β-消除的保护磷的基团，特别是β-氰乙基保护基，其中所述去除包括使该受保护的寡核苷酸与一种胺溶液在一种溶剂中进行接触，该溶剂优选不包含吡啶，其中该胺的共轭酸优选具有一个大于11.5的pKa，并且其中该胺在该溶液中的浓度是小于0.5摩尔/升。
文档编号C07H21/04GK102076703SQ200980123166
公开日2011年5月25日 申请日期2009年4月24日 优先权日2008年4月24日
发明者凯文·詹姆斯·芬恩, 哈根·克拉默, 塔德乌什·克日什托夫·维尔奇凯维奇, 朱辉赫 申请人:集润德斯股份公司