专利名称：新抗体制剂的制作方法
新抗体制剂本发明涉及针对ρ-选择蛋白(P-Selectin)的抗体的药物制剂，制备该制剂的方法和该制剂的用途。第一方面，本发明涉及一种药物制剂，其包含1 至 200mg/mL 的抗体；1至IOOmM的缓冲液；0. 001至1 %的表面活性剂；(a) 10至500mM的稳定剂；或(b) 10至500mM的稳定剂和5至500mM的张力剂；或(c) 5 至 500mM 的张力剂，所处pH范围是从4.0至7.0，其中该抗体是针对P-选择蛋白的抗体。根据本发明的制剂可以是液体形式、冻干形式或从冻干形式重建的液体形式。针对P-选择蛋白的抗体是已知的，例如可从美国专利4，783，399、W093/06863、 Geng 等(J. Biol. Chem.(生物化学杂志)，266 (1991) 22313-22318)、WO 93/21956 和 WO 2005/100402 中得知。针对P-选择蛋白的示例性抗体在WO 2005/100402中描述，并且包括如下抗体，其特征在于所述抗体的可变重链氨基酸序列⑶R3选自由重链⑶R3序列SEQ ID NO :38、39、 40、41或42组成的组。优选抗体的特征在于i)包含可变重链和可变轻链，其特征在于可变重链包含 CDR 序歹Ij CDRUCDR2 和 CDR3,并且 CDRl 选自由 SEQ ID NO :29、30、31、32 组成的组，CDR2 选自由 SEQ ID NO :33、34、35、36、37 组成的组，CDR3选自由 SEQ ID NO :38、39、40、41、42 组成的组，其中相互独立地选择所述的⑶R，ii)可变轻链包含 CDR 序列 CDR1、CDR2 和 CDR3，并且 CDRl 选自 SEQ ID NO :43、 44，CDR2 选自 SEQ ID NO :45、46 以及 CDR3 选自 SEQ ID NO :47、48、49、50、51、52，其中相互独立地选择所述的⑶R， iii)含有作为重链CDR的SEQ ID NO 2的CDR以及作为轻链CDR的SEQ ID NO 1的⑶R ；作为重链⑶R的SEQ ID NO 4的⑶R以及作为轻链⑶R的SEQ ID NO 3的⑶R ； 作为重链⑶R的SEQ ID NO 6的⑶R以及作为轻链⑶R的SEQ ID NO 5的⑶R ；作为重链 CDR的SEQID NO 8的⑶R以及作为轻链⑶R的SEQ ID NO 7的⑶R ；作为重链⑶R的SEQ ID NO 10的CDR以及作为轻链CDR的SEQ ID NO 9的CDR ；作为重链CDR的SEQ ID NO 12 的⑶R以及作为轻链⑶R的SEQ ID NO 11的⑶R ；作为重链⑶R的SEQ ID NO 14的⑶R 以及作为轻链⑶R的SEQ ID NO 13的⑶R ；作为重链⑶R的SEQ ID NO 16的⑶R以及作为轻链⑶R的SEQ ID NO 15的⑶R ；作为重链⑶R的SEQ ID NO 18的⑶R以及作为轻链 CDR的SEQ ID NO 17的⑶R ；作为重链⑶R的SEQ ID NO 20的⑶R以及作为轻链⑶R的 SEQ ID NO 19的CDR ；作为重链CDR的SEQ ID NO 22的CDR以及作为轻链CDR的SEQ ID NO :21 的 CDR,
iv)所述抗体结合P-选择蛋白并且包含独立选自由下述各项组成的组的可变重链区和可变轻链区由氨基酸序列SEQ ID NO :2定义的重链可变结构域和由SEQ ID NO: 1定义的轻链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID NO 4定义的重链可变结构域和由SEQ ID NO 3定义的轻链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID NO 6定义的重链可变结构域和由SEQ ID NO :5定义的轻链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID NO :8定义的重链可变结构域和由 SEQ ID NO :7定义的轻链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID NO 10定义的重链可变结构域和由SEQ ID NO :9定义的轻链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID NO :12定义的重链可变结构域和由SEQ ID NO: 11定义的轻链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID N0:14定义的重链可变结构域和由SEQ ID NO 13定义的轻链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID NO 16定义的重链可变结构域和由氨基酸序列SEQ ID NO: 15定义的轻链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID NO: 18定义的重链可变结构域和由SEQ ID NO :17定义的轻链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID NO :20定义的重链可变结构域和由SEQ ID NO 19定义的轻链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID NO 22定义的重链可变结构域和由SEQ ID NO 21定义的轻链可变结构域，ν)重链可变区包含独立选自由 SEQ ID NO :2、4、6、8、10、12、14、16、18、20 和 22 组
成的组的氨基酸序列， vi)轻链可变区包含独立选自由 SEQ ID NO :1、3、5、7、9、11、13、15、17、19 和 21 组
成的组的氨基酸序列。CDR Ιψ 歹Ij nj IH ig Kabat 等’ Sequences of Proteins of Immunological Interest (免疫学感兴趣的蛋白的序列)，第5版.Public Health Service (公共保健服务)，National Institutes of Health (国立卫生研究所)，Bethesda，MD (1991)的标准定义来确定。每条链中的⑶R通过构架氨基酸分隔。SEQ ID NO 1-22的⑶R示于SEQ ID NO 29-52 中。在一个实施方案中，该抗体的特征在于结合P-选择蛋白并且不结合补体因子 Clq和/或Fc受体。这些抗体不引起依赖补体的细胞毒性(CDC)和/或抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。优选地，该抗体特征在于它结合P-选择蛋白、含有人源衍生的Fc部分并且不结合补体因子Clq。更优选地，抗体是人抗体或人源化抗体。在另一个实施方案中，该抗体的特征在于恒定链为人类来源。此类恒定链在本领域内是众所周知的并且例如由Kabat描述(参见例如Johnson和Wu，Nucleic Acid Res. (核酸研究)28 (2000) 214-218)。例如，有用的人重链恒定区包含独立选自由SEQ ID N0 24、25、26、27和28组成的组的氨基酸序列。例如，有用的人轻链恒定区包含SEQ ID NO 23 的κ-轻链恒定区氨基酸序列。当用于本文时，术语“结合P-选择蛋白”意指在BIAcore测定(Pharmacia Biosensor AB，Uppsala，瑞典)或在ELISA中抗体对P-选择蛋白的结合，其中纯化的P-选择蛋白或者P-选择蛋白CHO转染子包被于微量滴定板上。在BIAcore测定中，抗体结合于表面上并且通过表面等离振子共振(SPR)测定 P-选择蛋白的结合。结合的亲和性由术语ka(来自抗体/抗原复合物中的抗体的结合速率常数)、kd(解离常数)以及KD(kd/ka)来定义。在又一个实施方案中，抗体显示ICT8M或更低、优选地是大约10—11至IQ-9M的Kd(参见实施例)。因此，优选的抗体是如上文描述的抗体，其中抗体在BIAcore测定中以小于ICT8M的Kd值结合P-选择蛋白，优选地其中Kd范围在 ICT11 至 IO-9M0优选地，抗体是IgGl或IgG4人亚型。更优选地，抗体特征在于抗体是在L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、 P331和/或P329中含有至少一个突变的人抗体IgGl亚类，或在L235和S228中含有至少一个突变的人抗体IgG4亚类(根据EU索引编号)。在P-选择蛋白特异性ELISA中，在微量滴定板内包被纯化的P-选择蛋白并且以生物素化的抗人IgG和ELISA的常规步骤测定抗体对P-选择蛋白的结合。此测定中的EC5tl 值范围在P-选择蛋白CHO细胞上优选地在0. 002和0. 03 μ g/ml之间，即优选的抗体是那些抗体，其中对于P-选择蛋白结合的EC50值范围在ELISA测定中在存在P-选择蛋白的CHO 细胞上是0. 002至0. 03 μ g/ml。在其中表达P-选择蛋白的CHO转染子包被于微量滴定板内的测定中，EC50值范围在0. 01和0. 08 μ g/ml之间，优选地在0. 01和0. 04 μ g/ml之间。在E-选择蛋白转化子和L-选择蛋白转化子上的EC5tl值优选地高于100 μ g/ml。 优选的抗体特征在于如在其中P-选择蛋白以及E-选择蛋白和/或L-选择蛋白包被于微量滴定板内的ELISA测定中所测定的EC5tl值，抗体结合P-选择蛋白的特异性比结合E-选择蛋白和/或L-选择蛋白的特异性高至少1000倍。该抗体优选地能够在P-选择蛋白氨基酸片段aa 60-75 (Swiss-Prot序列P16109) 存在时结合P-选择蛋白和/或非竞争性地抑制由命名为ATCC登录号HB11041细胞系分泌的抗体对P-选择蛋白的结合。该抗体优选地在ELISA测定方式中不抑制P-选择蛋白与血小板膜糖蛋白GPIb α 的相互作用。在ELISA中，作为GPIb α的可溶性细胞外部分的糖萼蛋白(glycocalicin) 固定在微量滴定板的孔内，如(Romo等，J Exp Med (实验医学杂志)190 :803 (1999))所述， 并且在用P-选择蛋白HuMabs预温育后，用抗P-选择蛋白多克隆抗体检测纯化的P-选择蛋白的结合。优选的抗体的特征在于其不结合C3蛋白质，更优选地特征在于它不引起依赖补体的细胞毒性(CDC)。此外，抗体的特征可在于它不结合NK效应细胞上的Fc γ受体。优选地,抗体的特征在于它是在 L234、L235、D270、N297、E318、K320、K322、P331 和 / 或 P329 中含有至少一个突变的人抗体IgGl亚类，或者是在L235和S228中含有至少一个突变的人抗体IgG4亚类(根据EU索引编号)。优选的抗体的特征在于它不引起抗体依赖性细胞毒作用(ADCC)。更优选的抗体特征在于它们结合P-选择蛋白并且它们包含独立选自由下述各项组成的组的可变区由氨基酸序列SEQ ID NO :1定义的轻链可变结构域和由SEQ ID NO 2定义的重链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID NO :3定义的轻链可变结构域和由SEQ ID NO 4定义的重链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID NO 5定义的轻链可变结构域和由SEQ ID NO :6定义的重链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID NO :7定义的轻链可变结构域和由 SEQ ID NO :8定义的重链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID NO :9定义的轻链可变结构域和由SEQ ID NO: 10定义的重链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID NO :11定义的轻链可变结构域和由SEQ ID NO 12定义的重链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID NO 13定义的轻链可变结构域和由SEQ ID NO: 14定义的重链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID N0:15定义的轻链可变结构域和由SEQ ID NO: 16定义的重链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID NO 17定义的轻链可变结构域和由SEQ ID NO: 18定义的重链可变结构域；由氨基酸序列SEQ ID NO 19定义的轻链可变结构域和由SEQ ID NO 20定义的重链可变结构域；和由氨基酸序列SEQ ID N0:21定义的轻链可变结构域和由SEQ ID NO 22定义的重链可变结构域。优选地，抗体包含由氨基酸序列SEQ ID NO 3定义的轻链可变结构域和由SEQ ID NO 4定义的重链可变结构域。优选的抗体特征在于抗体是人IgG4亚类或包含至少一种导致不结合补体因子 Clq的氨基酸突变。这些变体抗体包含例如独立选自由SEQ ID N0:25或SEQ ID NO :26和 SEQ ID NO :28组成的组的氨基酸序列。在本文中，抗P-选择蛋白“变体”抗体指这样的分子，其因在抗P-选择蛋白“亲本” 抗体氨基酸序列内添加、缺失和/或置换一个或多个氨基酸残基而在氨基酸序列上与亲本抗体序列不同。优选地，变体在亲本抗体的一个或多个恒定区或可变区、更优选地在恒定区内包含一个或多个氨基酸置换。例如，变体可以在亲本抗体的一个或多个可变区内包含至少1个，例如大约1个至大约10个，并且优选地大约2个至大约5个置换。通常，变体具有与亲本抗体的恒定结构域序列和/或可变结构域序列至少90%、更优选至少95%并且最优选至少99%的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。在本文中，将对这种序列的同一性或同源性定义为在比对序列和根据需要导入缺口以获得最大序列同一性百分数后，候选序列中与亲本抗体残基相同的氨基酸残基的百分数。抗体序列的N末端、C末端或内部延伸、缺失或插入均不应解释为影响序列同一性或同源性。变体保留了结合人P-选择蛋白的能力并且优选地具有优于亲本抗体特性的特性。例如，变体可具有较强的结合亲和性、增强的治疗重度肢体局部缺血或周围动脉硬化闭塞症 (critical limb ischemia or peripheral arterial occlusive disease, CLI/PA0D) t百关疾病的能力。本文中特别感兴趣的变体抗体是当与亲本抗体相比时，因消除对Fc Y受体的结合而在粘着测定(adhesion assay)中在抑制活性上表现出至少大约4倍增强的变体抗体。在本文中，“亲本”抗体是由用于制备变体的氨基酸序列编码的抗体。优选地，亲本抗体具有人构架区并且根据需要具有人抗体恒定区。例如，亲本抗体可以是人源化抗体或人抗体。 此外，本发明的抗体包括了具有不影响或不改变以上提及的本发明抗体特征的 “保守序列修饰”、核苷酸序列修饰和氨基酸序列修饰的抗体。可以通过本领域内已知的标准技术如定点诱变和PCR-介导的诱变导入修饰。保守氨基酸置换包括其中氨基酸残基用具有相似侧链的氨基酸残基置换的保守氨基酸置换。在本领域中已经定义了具有相似侧链的氨基酸残基的家族。这些家族包括具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷极性侧链的氨基酸 (例如甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、 具有β分支侧链的氨基酸(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸 (例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，可以优选地用来自相同侧链家族的另一种氨基酸残基替代在人抗P-选择蛋白抗体中被预测为非必需的氨基酸残基。
可基于如由Riechmann 等，Nature (自然)332 (1988) 323-327 和 Queen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (美国科学院院刊)86 (1989) 10029-10033描述的分子建模，通过诱变
实施氨基酸置换。还优选的抗体 包含如由SEQ ID NO 23定义的κ轻链恒定区。还优选的抗体是那些抗体，其定义为IgGlvl (PVA-236，GLPSS331，由以下指定:E233P, L234V, L235A, δ G236, A327G, A330S, P331S)、IgGlv2(L234A, L235A)禾口 IgG4vl(S228P, L235E)。序列表的描述SEQ ID NO 1 LC1004-001 轻链，HuMab 1004-001 的可变结构域SEQ ID NO 2 LC1004-001 重链，HuMab 1004-001 的可变结构域SEQ ID NO 3 LC1004-002 轻链，HuMab 002 可变结构域SEQ ID NO 4 LC1004-002 重链，HuMab 002 可变结构域SEQ ID NO 5 LC1004-003 轻链，HuMab 003 的可变结构域SEQ ID NO 6 LC1004-003 重链，HuMab 003 的可变结构域SEQ ID NO 7 LC1004-004 轻链(I), HuMab 004(1)的可变结构域SEQ ID NO 8 LC1004-004 重链(I), HuMab 004(1)的可变结构域SEQ ID NO 9 LC1004-004 轻链(II)，HuMab 004(11)的可变结构域SEQ ID NO 10 LC1004-004 重链(II)，HuMab 004(11)的可变结构域SEQ ID NO 11 轻链，HuMab 005 的可变结构域SEQ ID NO 12 重链，HuMab 005 的可变结构域SEQ ID NO 13 轻链，HuMab 010(1)的可变结构域SEQ ID NO 14 重链，HuMab 010(1)的可变结构域SEQ ID NO 15 轻链，HuMab OlO(II)的可变结构域SEQ ID NO 16 重链，HuMab OlO(II)的可变结构域SEQ ID NO :17 轻链，HuMab OlO(III)的可变结构域SEQ ID NO :18 重链，HuMab OlO(III)的可变结构域SEQ ID NO 19 轻链，HuMab 011 的可变结构域SEQ ID NO 20 重链，HuMab 011 的可变结构域SEQ ID NO 21 轻链，HuMab 017 的可变结构域SEQ ID NO 22 重链，HuMab 017 的可变结构域SEQ ID NO 23 κ 轻链恒定区SEQ ID NO 24 γ 1 重链恒定区SEQ ID NO 25 γ 1 重链恒定区 PVA236/GLPSS331 (IgGlvl)SEQ ID NO 26 γ 1 重链恒定区 L234A/L235A (IgGlv2)SEQ ID NO 27 Y 4 重链恒定区SEQ ID NO 28 γ 4 重链恒定区 S228/L235E (IgG4vl)SEQ ID NO 29-32 重链 CDRlSEQ ID NO 33-37 重链 CDR2SEQ ID NO 38-42 重链 CDR3
SEQ ID NO :43-44 轻链 CDRlSEQ ID NO :45-46 轻链 CDR2SEQ ID NO :47-52 轻链 CDR3在一个实施方案中，本发明提供制剂，在该制剂中抗体以范围在10至150mg/ mL，优选在10至50mg/mL的量存在。针对P-选择蛋白的拮抗性单克隆抗体可通过杂交瘤细胞系产生。优选的杂交瘤细胞系是hu-Mab<P-选择蛋白>LC 1004-001 (抗体HuMab 001) hu-Mab<P-选择蛋白 >LC 1004-002 (抗体 HuMab 002)和 hu_Mab<P-选择蛋白 >LC 1004-017 (抗体HuMab 017)，它们在国际认可用于专利程序目的的微生物保藏布达佩斯条约下，保藏在德国的德意志微生物保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSMZ), Germany)
权利要求
1.一种药物制剂，其包含 1至200mg/mL的抗体；1至IOOmM的缓冲液； 0.001至的表面活性剂；(a)10至500mM的稳定剂；或(b)10至500mM的稳定剂和5至500mM的张力剂；或 (c)5至5001111的张力剂，所处PH范围是从4.0至7.0， 其中该抗体是针对P-选择蛋白的抗体。
2.根据权利要求1的制剂，其是液体制剂或冻干制剂或从冻干制剂重建的液体制剂。
3.根据权利要求1或2的制剂，其中该抗体的浓度范围为lOmg/mL至150mg/ml。
4.根据权利要求1至3中任意一项的制剂，其中该稳定剂是海藻糖。
5.根据权利要求1至4中任意一项的制剂，其中该表面活性剂是聚山梨酯。
6.根据权利要求1至5中任意一项的制剂，其中该缓冲液是组氨酸-缓冲液。
7.根据权利要求1至6中任意一项的制剂，其包含张力剂。
8.根据权利要求1至7中任意一项的制剂，其中该张力剂是海藻糖。
9.权利要求1的制剂，其包含1至50mg/mL huMAb-P-选择蛋白，20mM L-组氨酸盐酸盐，240mM海藻糖，0. 02%聚山梨酯20，处于pH 6.0 ； 或1至50mg/mL huMAb-P-选择蛋白，20mM醋酸钠，140mM海藻糖，75mM甘氨酸，0. 04%聚山梨酯20，处于pH 5. 2 ； 或1至50mg/mL huMAb-P-选择蛋白，20mM L-组氨酸盐酸盐，240mM海藻糖，0. 02%聚山梨酯20，处于pH 6.0 ； 或1至50mg/mL huMAb-P-选择蛋白，20mM琥珀酸盐，240mM海藻糖，20mM精氨酸，0. 02% 聚山梨酯20，处于pH 6.0。
10.根据权利要求1-20中任意一项的制剂在制备用于治疗哮喘或变态反应的药物中的用途。
11.上文所描述的发明。
全文摘要
本发明涉及针对P-选择蛋白的抗体的药物制剂，制备该制剂的方法和该制剂的用途。
文档编号C07K16/28GK102159194SQ200980136837
公开日2011年8月17日 申请日期2009年9月9日 优先权日2008年9月19日
发明者乌拉·格劳施奥夫, 奥利弗·鲍里斯·斯陶克, 汉斯-克里斯蒂·马勒 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司