一种猪圆环病毒2型表位肽疫苗及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种猪圆环病毒2型表位肽疫苗及其制备方法。该疫苗含有三种B细胞表位，其赖氨酸为核心基质构建表位单体相同的四分支肽，并串联一个通用T辅助细胞（Th）表位，分子量为13kDa，该表位肽命名为PCVCP98-156-228；该疫苗免疫小鼠后产生较强的免疫应答，产生高效价的病毒中和性抗体。本发明的表位肽疫苗具有价廉、安全、特异性强、容易保存和应用的优点，将在防控猪圆环病毒病发挥重要作用。本发明方法通过表位肽的预测、筛选，表位肽疫苗的设计，表位肽的合成、纯化及鉴定，以及表位肽疫苗的制备四个步骤制备出一种猪圆环病毒2型（PCV2）表位肽疫苗，该方法原料易得、成本较低、容易控制，具有较好的操作性，适应推广应用。
【专利说明】一种猪圆环病毒2型表位肽疫苗及其制备方法
【技术领域】
[0001]本发明属于兽药生物【技术领域】，具体涉及一种猪圆环病毒2型(PCV2)表位肽疫苗及其制备方法。[0002]
【背景技术】
[0003]1、猪圆环病毒病已成为当前生猪的三大主要疫病之一:
猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2, PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(post-weaning multisystemic wasting syndrome, PMWS)的重要病原，该病于 1997年在加拿大西部首次被证实，相继北美、欧洲及亚洲多数国家均有本病流行的报道。PCV2还与其他几种疾病有关，如猪皮炎与肾病综合征(TONS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪先天性振颤、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等，目前将与PCV2感染有关的疾病统称为猪圆环病毒病(porcine circovirus associated disease,PCVD)。感染 PCV2 的猪可导致淋巴系统损伤和免疫缺陷，引起机体抵抗力下降，使感染猪对其他病原的易感性增高，造成多种疾病的并发或继发感染，对养猪业造成了极大的危害。2008年第20届国际猪病大会上，人们将其列为当前危害养猪业发展的头号疫病。PCVAD被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)之后新发现的最重要的猪传染病。
[0004]PCV2还与其他几种疾病有关，如猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪先天性振颤、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等，目前将与PCV2感染有关的疾病统称为猪圆环病毒病(porcine circovirus associated disease, PCVD)。感染PCV2的猪可导致淋巴系统损伤和免疫缺陷，引起机体抵抗力下降，使感染猪对其他病原的易感性增高，造成多种疾病的并发或继发感染，对养猪业造成巨大的经济损失。
[0005]2、猪圆环病毒 2 型(porcine circovirus type 2, PCV2)疫苗研究现状:
PCV2每年给养猪业造成巨大的经济损失，但是尚无有效的治疗方法，而疫苗免疫是控制该病的有效途径，国内外研究者都在该病的疫苗研制上投入了大量工作，但由于病毒增殖缓慢、无CPE出现，PCVl和PCV2往往混合存在，因此其分离培养较困难，难以大量获得纯病毒，造成了全病毒苗难以开发。而新型亚单位疫苗因结构单一，不用病毒培养而具有成本低、靶向明确和安全稳定的特点成为当前PCV疫苗研究的重点。PCV2的0RF2基因编码的Cap蛋白具有良好的免疫原性，免疫动物后能产生较好的中和抗体，证明了其应用于亚单位疫苗研制的价值。国外学者把0RF2片段插入到昆虫杆状病毒中，研制了具有免疫原性的重组蛋白苗，目前已投入使用，但是由于其工艺要求高，相应的佐剂昂贵，在我国难以推广使用。目前，国内已有商品化PCV2全病毒灭活疫苗上市，申请号(ZL200810024423.1)。但灭活疫苗所提供的免疫力较弱，为完成全程免疫，需要进行多次接种，免疫剂量大，生产成本高；而且灭活疫苗中含有大量非保护性抗原成分，副作用较大并存在病毒灭活不充分带来的风险。而国外已有4种PCV疫苗投入使用，两种灭活苗和两种重组苗，梅里亚和英特威的需要免疫两次，柏林格和富道的需要免疫一次，但目前为止，仅柏林格在中国成功注册销售，价格为每头份30元，部分猪还需要加强免疫一次，所以其昂贵的价格大大增加了养猪成本，严重限制了其应用。美国联合生物医学公司已开展PCV2亚单位疫苗的研究，在多个实施方案中，此肽抗原包括衣壳蛋白从约第47位氨基酸至第202位氨基酸的氨基酸。选择的肽链较长，合成成本较高，且尚属于研究初级阶段，申请的专利尚未授权(专利受理号201080068977.7)。
[0006]表位是蛋白质抗原性的基础，正确而详细地绘制蛋白质表位图谱(包括抗原限制成分位)对疾病的诊断及预后判定、设计疫苗分子结构及免疫干预治疗等至关重要。根据B细胞表位的特征，先预测抗原表位，再合成肽段，在实验中验证，是一种省时、省力和经济的方法。目前，口蹄疫作为第一个兽用多肽疫苗已批准上市，开始广泛应用，并取得了较好的免疫效果，显示了多肽疫苗在动物疫病的防控方面具有极大的潜力。PCV2每年给养猪业造成巨大的经济损失，但是尚无有效的治疗方法，而疫苗免疫是控制该病的有效途径，国内外研究者都在该病的疫苗研制上投入了大量工作，但由于病毒增殖缓慢、无CPE (细胞病变)出现，PCVl和PCV2往往混合存在，因此其分离培养较困难，难以大量获得纯病毒，造成了全病毒苗难以开发。而新型亚单位疫苗因结构单一，不用病毒培养而具有成本低、靶向明确和安全稳定的特点成为当前PCV疫苗研究的重点。PCV2的0RF2基因编码的Cap蛋白具有良好的免疫原性，免疫动物后能产生较好的中和抗体，证明了其应用于亚单位疫苗研制的价值。国外学者把0RF2片段插入到昆虫杆状病毒中，研制了具有免疫原性的重组蛋白苗，目前已投入使用，但是由于其工艺要求高，相应的佐剂昂贵，在我国难以推广使用。
[0007]
【发明内容】
[0008]针对目前 国产上市的全病毒灭活疫苗有一定的保护作用，但副作用大、安全性差的问题，以及进口的重组亚单位疫苗和嵌合病毒灭活疫苗，免疫原性较好、但价格昂贵的问题，本发明的目的是提供一种具有价廉、安全、特异性强、容易保存和应用安全的猪圆环病毒2型(PCV2)表位肽疫苗。
[0009]本发明还提供所述猪圆环病毒2型(PCV2)表位肽疫苗的制备方法。
[0010]实现上述目的，本发明采用如下技术方案:一种猪圆环病毒2型表位肽疫苗，其特征在于，该疫苗含有三种B细胞表位，其赖氨酸为核心基质构建表位单体相同的四分支肽，并串联一个通用T辅助细胞(Th)表位，分子量为13 kDa，该表位肽命名为PCV CP98_156_228 ;
所述三种B细胞表位具体氨基酸序列如下:B98 IRKVKV7B156 YHSRYFT, B228 DPPLNP ； 所述表位肽结构如下:
IRKVKVGGG'fHSRYFTGGGDPPLNP ,
lRKVVWi3GGYHSRYFTOGGDPPLNP ,."
lRKVKVi3GGYHSRYFTGGGDPPLNP \ ,> K"KKJ SlSElKGVfVHKlEGlLf
丨."
tRKVKV6i3GYHSRYfT6GGDPPLNP ,
进一步，所述猪圆环病毒2型表位肽疫苗的制备方法，包括如下步骤:
O表位肽的预测、筛选:选用PCV2b (国内90%PMWS猪群均因PCV2b感染)CAP蛋白作为候选抗原，对其氨基酸序列采用BcePred和DNAStar软件进行B细胞表位预测；结合PCV2b CAP B细胞表位，筛选出3种抗原指数较高的表位，即98-103aa(命名为B98)，156_162aa(命名为B156)，228-233aa(命名为B228) ;3种表位具体氨基酸序列如下:B98 IRKVKVjB156 YHSRYFT, B228DPPLNP ；
2)表位肽疫苗的设计:
以步骤I)所选序列为基础，赖氨酸为核心基质构建表位单体相同的四分支肽，同时串联一个通用型Th表位，该表位肽命名为PCVCP98_156_228，结构式如上；
3)多肽的合成、纯化及鉴定:
用多功能多肽合成仪分别合成表位肽PCV CP98_156_228，对其进行质谱(MS)检测，高效液相色谱(HPLC)检测纯度；
4)表位肽疫苗的制备:
首先，将上述步骤3)合成的表位肽PCV 0?98_156_228用0.01M，pH7.4 PBS (磷酸盐缓冲液)稀释到100ug/ml,过滤,制得水相；
然后，选择油乳剂在121°C下灭菌15min得到油相；所述油乳剂为Span-80, Tween-80或Arlacel-80中的一种；
再之，在乳化器中加入油相，在80-100r/min下搅拌2min后，加入同等质量的水相采用8500r/min的速度搅拌6min，制得油包水乳剂；
最后，将所得油包水乳剂在无菌条件下定量分装，得猪圆环病毒2型表位肽疫苗成品。
[0011]进一步，步骤3)中，(I)表位肽的合成具体步骤为:
①选择RinkAmide-AM Resin树脂作为载体,与表位肽C段氨基酸相连接,合成方向是C端向N端延伸；
②将步骤①中与树脂载体相连的氨基酸脱除Fmoc保护基团，裸露出活性氨基，与下一个氨基酸相连接；
③游离出的COOH(保护氨基酸原料中本身存在的)进行活化后与步骤②中的裸露氨基相交联；
④将步骤②步骤③循环进行，直至指定表位肽序列合成片段为全保护的KKISISEIKGVIVHKIEGILF-树脂，再连接下一个氨基酸原料Fmoc-Lys (Dde) -OH,形成Fmoc-Lys (Dde) - KKISISEIKGVIVHKIEGILF-树脂；
⑤用20%哌啶脱除步骤④得到的表位肽中的Fmoc基团，用含2%水合肼的DMF脱除其Dde基团，得到主链和侧链氨基；
游离的氨基与下一个Fmoc-Lys (Dde) -OH的C端羧基进行偶联；
⑥偶联完毕后，重复脱除Fmoc和Dde的步骤，得到全保护的肽树脂；
⑦加入保护性氨基酸，进入“偶联-去保护-偶联”循环步骤，得到最终的全保护多肽；
⑧将多肽从载体上洗脱下来，三氟乙酸(TFA)脱除保护基；
⑨以乙醚将多肽从TFA中析出，清洗，形成固体相粗品表位肽；
(2)表位肽的纯化、鉴定:
①将步骤(1)，即上面的整个反应步骤①-⑨，得到的粗表位肽进行质谱检测，并采用反相液相色谱进行纯化；②将质谱与反相液相色谱联合使用，对粗表位肽进行纯化；
③将液相色谱中纯化的目标峰放置于冻干机中冻干；
④冻干后的产品再次采用质谱检测确认是否正确，用液相色谱进行纯度检测。
[0012]相比现有技术，本发明具有如下优点:
1、本发明猪圆环病毒2型表位肽疫苗，包含有三种B细胞表位，用MAP (Multipleantigenic peptide system,多重抗原肽结构)连接4个分支，并串联有一个通用性Th表位，分子量为13 kDa，使用固相自动肽合成仪化学合成表位肽。PCV2表位肽疫苗主要由I份多肽和1份弗氏佐剂组成。该疫苗免疫小鼠后产生较强的免疫应答，产生高效价的病毒中和性抗体。本发明的表位肽疫苗具有价廉、安全、特异性强、容易保存和应用的优点，将在防控猪圆环病毒病发挥重要作用。
[0013]2、由于PCV2 0RF2编码的CAP蛋白，是PCV2的主要结构蛋白，具有较好的免疫原性，PCV2 CAP蛋白免疫动物后能产生较好的中和抗体，所以本发明猪圆环病毒2型表位肽疫苗以PCV2 CAP蛋白的氨基酸序列为基础，采用Kyte- Doolittle的亲水性方案，Emini方案,Karplus方案和Jameson-wolf抗原指数方案，辅以对CAP蛋白的二级结构柔性区域分析，并结合吴玉章氨基酸抗原指数计算方法预测CAP蛋白的B细胞表位，其预测结果的可靠性高。[0014]3、本发明方法通过表位肽的预测、筛选，表位肽疫苗的设计，多肽的合成、纯化及鉴定，以及表位肽疫苗的制备四个步骤制备出一种猪圆环病毒2型(PCV2)表位肽疫苗，该方法原料易得、成本较低、容易控制，具有较好的操作性，适应推广应用。
[0015]
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为本发明猪圆环病毒2型表位肽疫苗中MAP结构示意图。
[0017]图2为本发明猪圆环病毒2型表位肽疫苗PCV2 CAP蛋白的氨基酸序列。
[0018]图3为图2中CAP蛋白的亲水性分析，按Kyte-Doolittle的氨基酸亲水性标准分析PCV2病毒CAP蛋白分子的亲水性区域。
[0019]图4为图2中CAP蛋白的表面可能性区域，按Emini方案预测CAP蛋白氨基酸残基位于蛋白质的表面可能性。
[0020]图5为图2中CAP蛋白的抗原指数，按Jameson-wolf方案预测CAP蛋白序列中抗原指数较高的区段。
[0021]
【具体实施方式】
[0022]下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细说明。
[0023]一、猪圆环病毒2型CAP蛋白B细胞表位预测与分析:
PCV2 0RF2是编码病毒主要结构蛋白-Cap蛋白的基因，该蛋白具有良好的抗原性，可引起感染猪产生很高的抗体水平，可以作为疫苗候选抗原。本发明选用PCV2b (国内90%PMWS猪群均因PCV2b感染)CAP蛋白作为候选抗原，对其氨基酸序列进行B细胞表位预测分析。[0024]PCV2 CAP蛋白的氨基酸序如下(由基因组序列推导)共有233个氨基酸残基，检索自 GenBank,序列编号为 AAF35305.1。
[0025]I MTYPRRRYRR RRHRPRSHLG QILRRRPffLV HPRHRVRffRR KNGIFNTRLS RTFGVTVKRT
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基于PCV2 CAP蛋白的氨基酸序列，按Kyte-Doolittle的氨基酸亲水性标准分析PCV2病毒CAP蛋白分子的亲水性区域，预测结果见图1。按Emini方案预测CAP蛋白氨基酸残基位于蛋白质的表面可能性，预测结果见图2。以及按Jameson-wolf方案预测CAP蛋白序列中抗原指数较高的区段，预测结果图3。经抗原指数，亲水性指数和蛋白质表面可能性指数筛选出的氨基酸区段中(抗原指数> 0，亲水性指数> O,以及氨基酸的表面可能性指数^ I)，如果其内部或附近具有柔性结构，则较有可能是B细胞表位。综合分析以上预测结果，CAP蛋白较有可能为B细胞表位的区段位于N端第4-18，23-28，32-41，57-64，85-90，96-103，156-163，175-182，205-212 区段和第 224-233 区段。结果参见表 I。
[0026]表1 PCV2 CAP蛋白的B细胞表位区域的平均抗原性指数
【权利要求】
1.一种猪圆环病毒2型表位肽疫苗，其特征在于，该疫苗含有三种B细胞表位，其赖氨酸为核心基质构建表位单体相同的四分支肽，并串联一个通用T辅助细胞(Th)表位，分子量为13 kDa，该表位肽命名为PCV CP98_156_228 ； 所述三种B细胞表位具体氨基酸序列如下:B98 IRKVKV7B156 YHSRYFT，B228 DPPLNP ； 所述表位肽结构如下:
2.如权利要求1所述猪圆环病毒2型表位肽疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤: O表位肽的预测、筛选: 选用PCV2b CAP蛋白作为候选抗原，对其氨基酸序列采用BcePred和DNAStar软件进行B细胞表位预测；结合PCV2b CAP B细胞表位，筛选出3种抗原指数较高的表位，即98-103aa(命名为 B98), 1 56_162aa(命名为 B156)，228_233aa (命名为 B228) ;3 种表位具体氨基酸序列如下:B98 IRKVKV, B156 YHSRYFT, B228 DPPLNP ； 2)表位肽疫苗的设计: 以步骤I)所选序列为基础，赖氨酸为核心基质构建表位单体相同的四分支肽，同时串联一个通用型Th表位，该表位肽命名为PCVCP98_156_228，结构式如上； 3)多肽的合成、纯化及鉴定: 用多功能多肽合成仪分别合成表位肽PCV CP98_156_228，对其进行质谱检测，高效液相色谱检测纯度； 4)表位肽疫苗的制备: 首先，将上述步骤3)合成的表位肽PCV CP98_156_228用0.01M, pH7.4 PBS稀释到IOOug/ml，过滤，制得水相； 然后，选择油乳剂在121°C下灭菌15min得到油相；所述油乳剂为Span-80, Tween-80或Arlacel-80中的一种； 再之，在乳化器中加入油相，在80-100r/min下搅拌2min后，加入同等质量的水相采用8500r/min的速度搅拌6min，制得油包水乳剂； 最后，将所得油包水乳剂在无菌条件下定量分装，得猪圆环病毒2型表位肽疫苗成品。
3.根据权利要求1所述猪圆环病毒2型表位肽疫苗的制备方法，其特征在于，步骤3)中，(I)表位肽的合成具体步骤为: ①选择RinkAmide-AM Resin树脂作为载体,与表位肽C段氨基酸相连接,合成方向是C端向N端延伸； ②将步骤①中与树脂载体相连的氨基酸脱除Fmoc保护基团，裸露出活性氨基，与下一个氨基酸相连接；③游离出的COOH进行活化后与步骤②中的裸露氨基相交联； ④将步骤②步骤③循环进行，直至指定表位肽序列合成片段为全保护的KKISISEIKGVIVHKIEGILF-树脂，再连接下一个氨基酸原料Fmoc-Lys (Dde) -0H,形成Fmoc-Lys (Dde) - KKISISEIKGVIVHKIEGILF-树脂； ⑤用20%哌啶脱除步骤④得到的表位肽中的Fmoc基团，用含2%水合肼的DMF脱除其Dde基团，得到主链和侧链氨基； 游离的氨基与下一个Fmoc-Lys (Dde) -OH的C端羧基进行偶联； ⑥偶联完毕后，重复脱除Fmoc和Dde的步骤，得到全保护的肽树脂； ⑦加入保护性氨基酸，进入“偶联-去保护-偶联”循环步骤，得到最终的全保护多肽； ⑧将多肽从载体上洗脱下来，三氟乙酸(TFA)脱除保护基； ⑨以乙醚将多肽从TFA中析出，清洗，形成固体相粗品表位肽； (2)表位肽的纯化、鉴定: ①将步骤(1)，即上面的整个反应步骤①-⑨，得到的粗表位肽进行质谱检测，并采用反相液相色谱进行纯化； ②将质谱与反相液相色谱联合使用，对粗表位肽进行纯化； ③将液相色谱中纯化的目标峰放置于冻干机中冻干； ④冻干后的产品再次采用质谱检测确认是否正确，用液相色谱进行纯度检测。
【文档编号】C07K1/04GK103536912SQ201310457212
【公开日】2014年1月29日 申请日期:2013年9月30日 优先权日:2013年9月30日
【发明者】吴胜昔, 吴玉章, 曾政, 熊仲良, 蔡家利, 梁望旺, 蔺露, 董春霞 申请人:重庆理工大学, 中国人民解放军免疫学研究所, 重庆市动物疫病预防控制中心