一种抗菌肽的制作方法
【专利摘要】本发明属于生物技术制药工业中基因工程生产药物的【技术领域】，具体为一种抗菌肽。该抗菌肽的一级结构为GLPLLISWIKRKRQQ-AGP-GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM。新设计的抗菌肽，同时具备死亡素和蜂毒素的优点，不但抗菌谱广，而且能抗金黄色葡萄球菌，同时避免了蜂毒素溶血性强的弱点。
【专利说明】一种抗菌肽
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术制药工业中基因工程生产药物的【技术领域】，具体为一种抗菌肽。
【背景技术】
[0002]抗菌肽(antibacterial peptide)是一类分子量较小的多肽，它们大多数是由13-45个氨基酸组成，有些抗菌肽全部由L-氨基酸组成，有些抗菌肽分子中则同时包含了L-氨基酸和D-氨基酸，分子量一般为几千道尔顿，常带正电荷，1980年Hultmark等首先在天蚕(Hyatophoracecropia)蛹中分离得到一种杀菌肽，并将其命名为cecropin。抗菌肽具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤等活性，水溶性好，耐高温，是一种比较理想的抗生素代用品，特别是其主要抑菌机制是破坏细胞膜的稳定性，难以产生耐药性，而且抗菌肽一般是小肽，可以被动物完全消化，不存在残留性的问题，所以，抗菌肽无论是作为饲料添加剂，兽药还是人药，都是抗生素的理想代用品。
[0003]死亡素(Thanatin)是昆虫抗菌肽中最广谱的抗菌肽，它对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和某些真菌有抗菌作用，但是对金黄色葡萄球菌没有抑制作用。
[0004]蜂毒素(Melittin)是意大利蜂(Apismellifera)毒液的主要活性成分，由Habermanm等首先从蜂毒中分离出来的一种抗菌肽,具抗菌、消炎、抗福射、抗关节炎、抗肿瘤、抗艾滋病以及对心血管等方面的作用特别是可以抗金黄色葡萄球菌，但是蜂毒素有很强的溶血性，限制了临床上的进一步使用。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是设计一种新的抗菌肽，使其同时具备死亡素和蜂毒素的优点，避免各自缺陷，即设计的抗菌肽具有死亡素的抗菌广谱性和蜂毒素的抗金黄色葡萄球菌优势，克服了死亡素不抗金黄色葡萄球菌抗性和蜂毒素溶血性的缺陷。
[0006]实现上述发明的技术解决方案是:一种抗菌肽，该抗菌肽的一级结构为GLPLLISWIKRKRQQ-AGP-GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM。
[0007]本发明的主要有益效果有:新设计的抗菌肽，同时具备死亡素和蜂毒素的优点，不但抗菌谱广，而且能抗金黄色葡萄球菌，同时避免了蜂毒素溶血性强的弱点。
[0008]说明书附图
[0009]图1为重组表达载体的构建过程。
【具体实施方式】
[0010]下面结合实施例对本发明做进一步说明。
[0011]实施例1:
[0012]蜂毒素一级结构:GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ，死亡素一级结构:GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM，设计出新的抗菌肽:N_末端为蜂毒素的12-26号位氨基酸，并突变成GLPLLISWIKRKRQQ9，斜体氨基酸为突变氨基酸；C_末端为完整的死亡素，中间用AGP连接后，所设计的抗菌肽一级结构为GLPLLISWIKRKRQQ-AGP-GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM。(氨基酸简写规则:甘氨酸G，丝氨酸S，丙氨酸A，苏氨酸T，缬氨酸V，异亮氨酸I，亮氨酸L，酪氨酸Y，苯丙氨酸F，组氨酸H，脯氨酸P,天冬氨酸D，甲硫氨酸M，谷氨酸E，色氨酸W，赖氨酸K，半胱氨酸C，精氨酸R)
[0013](I)重组表达载体的构建
[0014]构建过程见图1。
[0015]I)设计引物五段引物:
[0016]引物1:5-CTCGAGATGGGTCTTCCTCTTCTTATTTCTTGGATTAAGCGTAAGCGTCAACAAGCTGG
[0017]引物2:5 — AAGCGTCAACAAGCTGGTCCTGGTTCTAAGAAGCCTGTTCCTATTATTTACTGCAACCG
[0018]引物3:3 — GGATAATAAATGACGTTGGCAGCATGACCATTCACGGTTGCATACATTATTCCTAGG
[0019]引物4:5-ACGCGGATCCGACCCCGGTCTTCCTCTTCTT ATTTCTTGG
[0020]引物5:5-ACCGCTCGAGTTATTACATACGTTGGCACTTACC
[0021]2) PCR 反应
[0022]按照表1的反应体系进行PCR反应，反应产物连接在PMD-18载体上(图1中的PMD-18MT)并保存于大肠杆 菌DH5a中；提取重组PMD-18MT质粒，按照表2的反应体系进行PCR反应，反应产物连接在PMD-18载体上(图1中的PMD-18MTE)并保存于大肠杆菌DH5 a中。
[0023]表1 PCR反应体系I
[0024]
【权利要求】
1.一 种抗菌肽，其特征在于:该抗菌肽的一级结构为GLPLLISWIKRKRQQ-AGP-GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM。
【文档编号】C07K14/435GK103641901SQ201310631774
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2014年1月7日 优先权日:2014年1月7日
【发明者】钱坤, 周国庆, 文良柱, 沈子龙, 葛海霞, 孙来玉, 肖莉, 张海洋, 徐秀芳 申请人:钱坤