一种杂交瘤细胞株11a2及其应用的制作方法

一种杂交瘤细胞株11a2及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种杂交瘤细胞株11A2及其应用。该杂交瘤细胞株11A2能够产生抗人血清白蛋白（humanserumalbumin,HSA）的单克隆抗体。其特征在于，其保藏编号为CGMCC?NO.9243。本发明的优点在于：杂交瘤细胞株11A2能够特异性的产生抗HSA的单克隆抗体，该抗体对抗原HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性，可以达到0.0012pg/ml（1.2fg/ml）的水平。利用本发明获得的细胞株11A2所产生的单克隆抗体，可用于人极微量白蛋白的检测、药物中残留人白蛋白的检测和纯化白蛋白等多种用途，具有很好的应用价值。
【专利说明】—种杂交瘤细胞株11A2及其应用

【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】。涉及一种杂交瘤细胞株及其应用，该杂交瘤细胞能够产生抗人白蛋白的单克隆抗体。

【背景技术】
[0002]人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)是人体血液中最为重要的成份,含量达到42 g/L的水平。其主要功能是维持血液渗透压的平衡、运输人体营养物质、保持细胞中内含物的稳定性等多种功能。人白蛋白是一种血液中的正常蛋白质，但在生理条件下尿液中仅出现极少量白蛋白。微量白蛋白尿反映肾脏异常渗漏蛋白质。尿微量白蛋白作为糖尿病、肾病、心血管疾病等慢性病的早期诊断指标，对尿中白蛋白定量检测具有重要的临床意义。因此，建立特异、灵敏的检测尿微量白蛋白的方法具有重要的应用价值，而该方法的关键在于抗白蛋白单克隆抗体的灵敏度和特异性，即白蛋白单克隆抗体的对抗原白蛋白特异性的高低，就决定了检测尿中白蛋白的灵敏度和特异性，在临床上决定了是否能及早地发现病人代谢白蛋白出现异常，从而推测病人是否患有糖尿病、肾病、心脑血管等慢性病，这对于及早发现病情，及早治疗具有重要的临床意义。
[0003]目前，用于检测尿中白蛋白含量的方法主要是酶联免疫吸附实验(ELISA)，该方法检测白蛋白要比溴甲酚紫(BCP)法和溴甲酚绿(BCG)(这两种方法的灵敏度为I μ g/ml)、蛋白质电泳法(0.5 μ g/ml)的灵敏度和特异性要高的多，是目前检测尿中白蛋白早期诊断的主要方法。据报道， 专利ZL2009201520440所述的一种人极微量白蛋白ELISA检测试剂盒，其灵敏度可以达到0.15 ng/ml的水平。目前开发出的ELISA检测试剂盒中，最为灵敏的检测白蛋白的试剂盒是美国Cloud-Clone Corp公司生产的高敏人血清白蛋白检测试剂盒(货号HEB028HU)，其灵敏度可以达到0.048 ng/ml(48 pg/ml)的水平。因此，美国Cloud-CloneCorp公司开发的检测微量人白蛋白试剂盒灵敏度是专利ZL2009201520440试剂盒的3.13倍，这对于尿中微量白蛋白的检测水平明显的提高了一个台阶。但是，在临床上，检测白蛋白灵敏度在Pg级水平(48 pg/ml)仍然难于达到一些慢性疾病的早期检测要求，如妊娠子痫前期、2型糖尿病等疾病。在一些药物中，如人的细胞因子中残留的白蛋白的检测，要求其检测试剂盒具有更高的灵敏度。因此，开发出更为灵敏的白蛋白检测试剂盒具有重要的临床价值。而解决这一问题最佳的途径，就是通过高灵敏度白蛋白单克隆抗体的开发，以提高检测白蛋白灵敏度。
[0004]另一方面，由于人白蛋白在临床上可以治疗休克、烧伤、创伤、低蛋白血症、急性血容量减少、癌症化疗、腹水、癌症晚期及提高老龄人的机体免疫力等多种疾病。因此，人白蛋白使用量越来越大，每针剂量通常达1g或者25g，而大多数蛋白质药物，如细胞因子、激素的剂量仅为yg或Hg级，因此相对其他蛋白药物来说，人白蛋白的纯度要求更为严格。利用抗体、抗原具有特异性识别的特点而进行的亲和层析技术，不仅可以大幅度的简化蛋白质的纯化步骤，而且纯化的效率更高，蛋白质的纯度更高，成本更低，这对于临床病人用药的安全性和经济性具有重要的实用意义。
[0005]本发明的目的在于:提供一种能产生与人白蛋白(HSA)发生抗原抗体反应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，其特征在于，该杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体要对抗原HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性。
[0006]本发明的目的是这样实现的:一种杂交瘤细胞株11A2，其特征在于:在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏，其保藏编号为CGMCC N0.9243。保藏日期为2014年5月28日，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。
[0007]本发明中，一种杂交瘤细胞株的制备方法，其特征如下所述。
[0008]①将免疫抗原HSA与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，腹腔注射Bal B/c小鼠，每次注射体积为0.2ml，蛋白质用量为50 μ g/只，对小鼠实施基础免疫。
[0009]②将免疫抗原HSA与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化，每隔2周腹腔注射I次，重复4次，每次注射体积为0.2 ml, HSA用量为40 μ g/只。将免疫原HSA与浓度为
0.9%的生理盐水混合，在进行细胞融合前3天，对小鼠进行加强免疫，腹腔注射，HSA用量为100 yg/只。
[0010]③按常规技术收集免疫小鼠的脾细胞与Sp2/0骨髓瘤细胞按6:1的比例，用PEG3350进行融合；用HAT培养液选择培养。融合后7_14天，取细胞培养上清，采用间接ELISA方法筛选分泌抗HSA的杂交瘤细胞株，对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。 [0011 ] ④重复进行6次亚克隆和间接ELISA筛选，得到一株分泌HSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株11A2。
[0012]本发明中，一种杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体，其特征在于是通过如下方法获得的。
[0013]①通过细胞培养液获得:将杂交瘤细胞株11A2按IX 16接种量接种到6 ml含20%胎牛血清的RPM1-1640培养基中，在37°C含5% CO2的细胞培养箱中培养3_5天，然后将细胞培养液在500 Xg离心5分钟，收集上清液，通过ProteinA或ProteinG亲和层析纯化，获得单克隆抗体。
[0014]②通过动物腹水获得:将Bal B/c小鼠腹腔注射0.5 ml石蜡油，7_14天后，每只小鼠腹腔注射上述①所得的细胞1-2X 16个，待小鼠腹部明显膨大后抽取腹水，在4°C下，8000 X g离心20分钟，收集上清,通过ProteinA或ProteinG亲和层析纯化,获得单克隆抗体。
[0015]本发明中，一种杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体，其特征在于是通过如下方法进行鉴定抗体亚型的。
[0016]①抗体纯度鉴定:将单抗用12% SDS-PAGE电泳进行纯度鉴定，如图1所示。通过Quantity-One (版本4.62)软件计算,抗体纯度为95%。
[0017]②抗体亚型鉴定:采用小鼠抗体分型试剂盒(Sigma公司生产)鉴定抗体亚型，测定结果表明，抗体亚型为IgGl K型。
[0018]本发明中，一种杂交瘤细胞株11A2的应用，其特征在于，将杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体对HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性。采用抗原HSA直接包被96孔板(Corning公司生产)，直接ELISA法测定杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体(mAb 11A2)特异性的识别能力。具体叙述如下。
[0019]用不同浓度的HSA直接包被96孔ELISA检测板，检测中设有空白对照、阴性对照和阳性对照。用3%脱脂奶粉(Non-fat milk)封闭检测板,依次加入mAb 11A2抗体、生物素标记的羊抗鼠抗体(B1tin-Goat ant1-mouse IgGl )、链霉亲和素标记辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)0然后加入TMB显色液后，用硫酸终止反应，最后在酶标仪450nm比色。结果表明(图2)，杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体(mAb 11A2)对抗原HSA识别的灵敏度和特异性可以达到0.0012 pg/ml (1.2 fg/ml HSA)的水平，而与牛血清白蛋白(BSA)没有任何反应。可见，mAb 11A2识别HSA具有超闻的灵敏度和超强的特异性。
[0020]杂交瘤细胞11A2细胞产生的单克隆抗体(mAb 11A2)对HSA特异性的识别能力和超高的灵敏度，具有多种应用，如下所述。
[0021]①用于极微量或残留人白蛋白的检测。
[0022]用商业化的人白蛋白单克隆抗体I (Sigma公司生产)包被96孔ELISA检测板，用3%脱脂奶粉(Non-fat milk)封闭检测板，然后加入待检测的样品，如人尿液(含极微量人白蛋白)或人细胞因子溶液(含残留人白蛋白)。检测中设有空白对照，即用PBS代替HSA;设有阴性对照，即用小牛血清白蛋白(BSA)，浓度为50 mg/ml。用商业化的人血清白蛋白单克隆抗体2 (Sigma公司生产)为阳性对照。依次加入mAb 11A2抗体、生物素标记的羊抗鼠抗体(B1tin-Goat ant1-mouse IgGl)、链霉亲和素标记辣根过氧化物酶(Avidin_HRP)。加入TMB显色液后，用硫酸终止反应，最后在酶标仪450nm比色。同时，在96孔板中，建立不同浓度的HSA，制作人白蛋白浓度标准曲线。
[0023]结果表明，杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体(mAb 11A2)用于ELISA试剂盒的检测，可以检测到稀释后的尿液HSA的含量为1.4 fg/ml，人细胞因子溶液中HSA的残留量为 2.6 fg/ml ο
[0024]②用于免疫亲和层析:用杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体(mAb 11A2，纯度为95%)，与活化的基质或微珠交联后，制备抗体亲和层析柱。然后，将含HSA的样品加入层析柱上，弃掉流穿液和清洗液，最后把目的蛋白质，即与单克隆抗体具有高度特异性的HSA从层析柱上洗脱下来，达到纯化HSA的目的。结果发现，用mAb 11A2抗体免疫亲和层析，HSA的收率为95%，纯度为99%。与其他纯化方法相比，免疫亲和层析纯化HSA的效率要比阳离子交换层析、阴离子交换层析和疏水层析三者之和(HSA的收率为72%，纯度为94%)还要高，因为以上三者都是非特异性的，而抗体抗原亲和层析，是特异性的。
[0025]综合上述，本发明的优点在于，本发明所获得的一种杂交瘤细胞株11A2能够特异性的分泌针对HSA的单克隆抗体，对HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性。
[0026]本发明的优点还在于，利用本发明所获得的细胞株所产生的单克隆抗体，具有多种用途，对实际生产和临床应用上具有非常好的价值。

【专利附图】

【附图说明】
[0027]图1:杂交瘤细胞株11A2产生的特异性单克隆抗体纯化后的SDS-PAGE电泳图。I表示低分子量蛋白质标准；2为单克隆抗体(不加还原剂DTT，也不加热煮沸);3为单克隆抗体在还原剂DTT的存在下，煮沸10分钟后，单克隆抗体分成了两个大小的片段。
[0028]图2 =ELISA检测杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体对抗原HSA的灵敏度和特异性实验。图中横坐标表示不同的浓度的HSA。其中，I是阳性对照；2是阴性对照；3是空白对照。4-12 表示不同浓度的 HSA:4 是 I ng/ml ；5 是 100 pg/ml ；6 是 10 pg/ml ；7 是 I pg/ml ；8 是 100 fg/ml ；9 是 10 fg/ml ；10 是 I fg/ml ;11 是 0.1 fg/ml 和 12 是 0.01 fg/ml。

【具体实施方式】
[0029]实施例1杂交瘤细胞株的建立。
[0030]一、材料与试剂。
[0031]1、材料:Bal B/c小鼠，6-8周龄，雌性。购自北京医科大学动物中心。Sp2/0_Agl4骨髓瘤细胞购自美国ATCC。人血清白蛋白(HSA，用做免疫原)购自Sigma公司。
[0032]2、试剂:RPM1-1640、胎牛血清、双抗(青霉素和链霉素)、HAT和HT培养液购自Invitrogen公司。弗氏完全、不完全佐剂、石油醚、PEG3350、HRP_羊抗鼠抗体购自Sigma公司。其他试剂为分析纯，均购自国药集团公司。
[0033]二、杂交瘤细胞株的建立。
[0034]1、动物免疫:基础免疫是将免疫原HSA与弗氏完全佐剂等体积混合并充分乳化，腹腔注射Bal B/c小鼠。每只每次注射体积为0.2 ml，HSA的用量为50 μ g/只。加强免疫是将免疫抗原HSA与弗氏不完全佐剂等体积混合并充分乳化，每隔2周腹腔注射I次，重复4次，每次注射体积为0.2 ml，HSA用量为40 μ g/只。将免疫原HSA与浓度为0.9%的生理盐水混合，在进行细胞融合前3天，对小鼠进行加强免疫，腹腔注射，HSA用量为100 μ g/只。
[0035]2、杂交瘤细胞的制备。
[0036]①Sp2/0骨髓瘤细胞的准备:选择生长状态良好的细胞，浑圆透亮，排列整齐，呈半致密分布。用培养液洗涤一次后，用10 ml培养液将Sp2/0骨髓瘤细胞轻轻吹下。
[0037]②脾细胞的准备:取加强免疫后3天的小鼠，摘除眼球采血供分离阳性血清。颈脱位将小鼠致死，用75%酒精消毒小鼠体表5分钟，随即放入超净台内小鼠解剖板上，左侧卧位，用7号针头固定四肢。无菌打开腹腔取出脾脏，用DMEM培养液洗涤，并仔细去掉周围附着的结缔组织。随后将脾脏转移到另一个盛有DMEM培养液的平皿中。以弯头针头压住脾脏，用小针头在脾脏上插孔，并用镊子挤压，使脾细胞充分释放，制成脾细胞悬液。
[0038]③饲养细胞的制备:取一只健康的小鼠，摘眼球采血，颈脱白处死，体表消毒和固定后，从大腿上剪开皮肤，暴露腹膜，酒精棉球消毒腹膜。用10 ml注射器，12号针头，注射5-10 ml HAT培养基到腹腔，右手固定注射器，左手持酒精棉球轻轻按摩腹部，抽回腹腔内液体，注入已准备好的容器中。
[0039]④细胞融合:将上述制备的Sp2/0骨髓瘤细胞与脾细胞混合于一支50 ml的带盖的无菌离心管中，500 Xg离心5分钟，上清要充分吸净，以免影响PEG3350的作用。将融合管置于手掌中，轻轻振荡底部，使两种细胞充分混匀。用I ml吸管将预热的PEG3350在60秒内缓慢加到融合管中，轻轻摇匀，立即滴加37°C预热的DMEM，使PEG3350失去作用。加入5 ml的HAT培养基，轻轻悬浮沉淀细胞，再加入适量的腹腔巨噬细胞，最后补加HAT至50ml ο分装于96孔细胞培养板，然后将培养板置37°C，5% CO2细胞培养箱内培养。5天后用HAT培养基换出一半培养基。融合后7-14天，观察杂交瘤细胞的生长情况，待其细胞培养上清变黄或克隆分布至孔底面积的1/10以上时，吸取适量细胞上清，采用间接ELISA法筛选分泌抗HSA的杂交瘤细胞株，对所得阳性克隆株采用有限稀释法进行亚克隆。
[0040]⑤杂交瘤细胞株的筛选:经过上述6次亚克隆和间接ELISA筛选，得到一株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株，命名为11A2，并于2014年5月28日在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏，其保藏编号为CGMCC N0.9243。保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所。
[0041]三、杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体的效价测定。
[0042]将11A2细胞在含20%胎牛血清的RPM1-1640培养基中培养传代，每3天传代一次，传代到20代后进行单克隆抗体测定。
[0043]①细胞培养液上清效价测定:将20代细胞按I X 16接种量接种到6 ml含20%胎牛血清的RPM1-1640培养基中，在37°C含5% CO2细胞培养箱中培养3_5天，然后将细胞培养液在500 X g离心5分钟，收集上清，用间接ELISA法测定细胞上清液中单克隆抗体效价，结果表明上清效价为1:10, 000-1:80, OOO0
[0044]②小鼠腹水效价测定:将Bal B/c小鼠腹腔注射0.5 ml石蜡油，7_14天后，每只小鼠腹腔注射上述①所得的细胞1-2X 16个，待小鼠腹部明显膨大后抽取腹水，在4°C下，8000Xg离心20分钟，收集上清液。用间接ELISA法测定上清中单克隆抗体，效价为1:1X 15-1:4X 150
[0045]四、杂交瘤细胞株的传代培养。
[0046]将细胞株11A2在含有20%胎牛血清的RPM1-1640培养基中培养传代，每3天传代一次，传代到90代后，细胞株11A2仍然能生长良好、稳定传代，培养液上清效价仍然可以达到1:10，000-1:80，000的水平。可见，本发明所得的细胞株11A2能够稳定传代，可以持续、稳定产生抗HSA的单克隆抗体。
[0047]实施例2应用细胞株11A2制备抗HSA的单克隆抗体。
[0048]一、单克隆抗体的制备。
[0049]将Bal B/c小鼠腹腔注射0.5 ml石蜡油，7-14天后，每只小鼠腹腔注射1-2 X 16个杂交瘤11A2细胞，待小鼠腹部明显膨大后抽取腹水，在4°C下，8000 X g离心20分钟，收集上清。然后，用 nProteinA Sepharose 4 Fast Flow 填料(GE Healthcare 公司生产)纯化腹水上清。弃掉流穿液和冲洗液，然后用甘氨酸-HC1，pH3.0洗脱液洗脱。收集洗脱液，用Tris-HCl，1M，pH9.0缓冲液中和至pH7.0，最后得到抗HSA的单克隆抗体(mAb 11A2)。
[0050]二、单克隆抗体mAb 11A2的鉴定。
[0051]1、抗体纯度鉴定:用12%SDS-PAGE电泳鉴定mAb 11A2的纯度。电泳图如图1所示，I表示低分子量蛋白质标准；2为单克隆抗体(不加还原剂DTT，也不加热煮沸);3为单克隆抗体在还原剂DTT的存在下，煮沸10分钟后，单克隆抗体分成了两个大小的片段。电泳凝胶照片通过Quantity-One (版本4.62 ；B1Rad公司)软件计算，单克隆抗体mAb 11A2的纯度为95%。
[0052]2、抗体亚型鉴定:采用小鼠抗体分型试剂盒(Sigma公司生产)鉴定抗体亚型，具体操作参照厂家提供的说明书进行。测定结果表明，抗体亚型为IgGl K型。
[0053]3、抗体与抗原的灵敏度和特异性鉴定:采用抗原HSA直接包被96孔板(Corning公司生产)，直接ELISA法测定单克隆抗体mAb 11A2特异性的识别能力。本实验重复3次，每个样品有3个复孔。具体方法如下所述。
[0054]①用HSA直接包被96 孔板,浓度依次为 I ng/ml, 100 pg/ml, 10 pg/ml, I pg/ml,100 fg/ml, 10 fg/ml, I fg/ml,0.1 fg/ml 和 0.01 fg/ml。检测中设有空白对照，即用 PBS代替HSA ;设有阴性对照，即用小牛血清白蛋白(BSA)，浓度为50 mg/ml。用商业化的人血清白蛋白单克隆抗体(Sigma公司生产)为阳性对照。4°C包被过夜。
[0055]②用3%脱脂奶粉(Non-fat milk)于37°C封闭60分钟。用TBS缓冲液洗板3次。加入浓度为0.5 μ g/ml的mAb 11A2抗体，在37°C培养60分钟，用TBS缓冲液洗板3次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。然后，加入生物素标记的羊抗鼠抗体(B1tin-Goat ant1-mouse IgGl, 1:50，000 稀释)，在 37°C 培养 60 分钟，用 TBS 缓冲液洗板6次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。再加入链霉亲和素标记辣根过氧化物酶(Avidin-HRP，1: 5，000稀释)，在37°C培养60分钟，用TBS缓冲液洗板6次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。
[0056]③加入100 μ I TMB显色，用I N硫酸终止反应，最后在酶标仪450 nm比色。
[0057]结果判断标准采用:P / N值(阳性孔OD值/阴性孔OD值)大于2.1为阳性；P /N值等于或小于2.1为阴性。
[0058]根据以上结果判断的标准和进一步数据分析显示(图2)，杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体(mAb 11A2)对抗原HSA识别的灵敏度和特异性可以达到0.0012 pg/ml (1.2fg/ml HSA)的水平，而与BSA没有任何反应。由此可见，mAb 11A2识别HSA具有超高的灵敏度和超强的特异性。
[0059]实施例3细胞株11A2产生的单克隆抗体用于人白蛋白检测试剂盒。
[0060]由于本发明基于所述的细胞株11A2产生的单克隆抗体(mAb 11A2)对抗原HSA具有超高灵敏度和超强的特异性，可以应用于检测极其微量或残留的HSA的含量。具体方法叙述如下。
[0061]1、检测试剂盒的试剂。
[0062]①包被抗体:商业化的人血清白蛋白(HSA)单克隆抗体I和2(Sigma公司生产)，抗体浓度为I μ g/ml。
[0063]②检测样品:人尿样(微量HSA)或人细胞因子溶液(残留HSA )。
[0064]③检测抗体:本发明所述的一种mAb 11A2单克隆抗体,浓度为0.5 μ g/ml。
[0065]④底物:四甲基联苯胺(TMB):100 ml/瓶。
[0066]⑤封闭液:3%脱脂奶粉。
[0067]⑥TBS 缓冲液:Tween-20 为 0.05%, Na2HPO4 和 NaH2PO4 缓冲液，ρΗ7.4，20 mM。
[0068]⑦生物素标记的羊抗鼠抗体(B1tin-Goatant1-mouse IgGl): 1:50，000 稀释。Thermo Fisher 公司生产。
[0069]⑧链霉亲和素标记辣根过氧化物酶(Avidin-HRP):1:5，000稀释。Thermo Fisher公司生产。
[0070]2、检测试剂盒的检测方法。
[0071]①用商业化的人血清白蛋白单克隆抗体I (Sigma公司生产)包被96孔板(Corning公司生产)。4°C包被过夜。
[0072]②用3%脱脂奶粉(Non-fat milk)于37°C封闭60分钟。用TBS缓冲液洗板3次。
[0073]③加入待检测的样品，人尿液用0.9%生理盐水稀释或人细胞因子溶液，上样量为100 μL。同时,用不同浓度的HSA做蛋白质标准曲线,分别是I ng/ml, 100 pg/ml, 10 pg/ml, I pg/ml, 100 fg/ml, 10 fg/ml, I fg/ml、0.1 fg/ml 和 0.01 fg/ml。检测中空白对照:用PBS代替HSA ;阴性对照:用小牛血清白蛋白(BSA)，浓度为50 mg/ml ;阳性对照:商业化的人血清白蛋白单克隆抗体2 (Sigma公司生产)。37°C培养60分钟，用TBS缓冲液洗板3次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。
[0074]④加入浓度为0.5 μ g/ml的mAb 11A2抗体在37°C培养60分钟，用TBS缓冲液洗板3次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。
[0075]⑤加入生物素标记的羊抗鼠抗体，在37°C培养60分钟，用TBS缓冲液洗板6次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。
[0076]⑥加入链霉亲和素标记辣根过氧化物酶(Avidin-HRP)，在37°C培养60分钟，用TBS缓冲液洗板6次，在吸水纸上用力拍打，充分除去残留的缓冲液。
[0077]⑦加入100 μ I TMB显色，用I N硫酸终止反应，最后在酶标仪450 nm比色。
[0078]本实验重复3次，每个样品有3个复孔。结果判断标准采用:P / N值(阳性孔OD值/阴性孔OD值)大于2.1为阳性；P / N值小于或等于2.1为阴性。根据不同浓度对应不同的OD值，绘制HSA标准曲线。
[0079]根据以上结果判断标准、HSA标准曲线，结果显示，该微量检测试剂盒可以检测到经过稀释后的尿液HSA的含量为1.4 fg/ml。人细胞因子溶液中HSA的残留量为2.6 fg/ml ο
[0080]实施例4细胞株 11A2产生的单克隆抗体用于免疫亲和层析。
[0081]一、免疫亲和层析柱的制备。
[0082]1、材料和试剂。
[0083]①材料:细胞株11A2产生的单克隆抗体(mAb 11A2);活化层析填料(NHS-activated Sepharose 4 Fast Flow, GE Healthcare 公司生产)；微株(GEHealthcare公司生产)。
[0084]②试剂:平衡缓冲液(0.2 M NaHCO3, 0.5 M NaCl, ρΗ8.3)。封闭缓冲液(0.5 M氨基乙醇，0.5 M NaCl，pH8.3)。冲洗缓冲液(0.1 M Tris-HCl，ρΗ8.9)。
[0085]2、制备方法。
[0086]详细的操作方法见厂家说明书。将活化层析填料或微珠用平衡缓冲液平衡后，加AmAb 11Α2单抗进行偶联。用封闭缓冲液封闭未偶联的填料或微珠，再用冲洗缓冲液冲洗层析柱或微珠，免疫亲和层析柱制备完成。
[0087]经过检测，mAb 11A2免疫亲和填料或微珠的亲和量为:40 mg HSA/ml。
[0088]二、用免疫亲和层析柱纯化HSA。
[0089]1、材料和试剂。
[0090]①材料:mAb 11A2单克隆抗体偶联的免疫亲和层析填料。
[0091]②试剂:平衡缓冲液(20mM Na2HPOjPNaH2PO4, pH7.2);冲洗缓冲液(20 mMNa2HPO4 和 NaH2PO4, ρΗ7.2);洗脱缓冲液(20 mM Na2HPO4 和 NaH2PO4, 2M NaCl, ρΗ7.2)。
[0092]2、方法。
[0093]①装柱和平衡:将偶联好mAb 11A2层析填料或微珠上柱，用平衡缓冲液平衡5个柱体积，流速为I ml/分钟。
[0094]②上样:按照亲和量40 mg HSA/ml计算样品的上样量。
[0095]③冲洗杂质:样品上样后，弃掉流穿液(Flow through),用冲洗缓冲液(WashBuffer)冲洗10个柱体积。
[0096]④洗脱目的蛋白质:用洗脱缓冲液(Elut1n Buffer)洗脱结合在填料柱上的HSA，洗脱体积为2个柱体积。
[0097]⑤平行试验:用阳离子交换柱(SP Sepharose 4 Fast Flow,GE Healthcare公司生产)、疏水柱(Phenyl Sepharose 4 Fast Flow,GE Healthcare公司生产)、阴离子交换柱(Q Sepharose Fast Flow,GE Healthcare公司生产)对照。具体操作参照生产厂家的说明书。
[0098]⑥纯度检测，用SDS-PAGE电泳检测纯化后HSA的纯度。用Quantity-One软件(版本4.62 ；B1Rad公司)计算HSA的纯度。
[0099]结果显示，上样前HSA的纯度为70%，通过mAb 11A2免疫亲和层析柱纯化后HSA的纯度为99%，收率95%。通过阳离子交换柱、疏水柱和阴离子交换柱3步纯化后，HSA的纯度为94%，收率为72%，由此可见，杂交瘤细胞11A2产生的单克隆抗体(mAb 11A2)用于免疫亲和层析，显著特征在于，纯化HSA具有更高的纯度和收率，具有很好的工业化应用价值。
【权利要求】
1.一种杂交瘤细胞株11A2，其特征在于:在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)保藏，其保藏编号为CGMCC N0.9243。
2.根据权利要求1所述的杂交瘤细胞株11A2，其制备方法的特征在于，按如下步骤获得: ①用抗原人血清白蛋白(humanserum albumin, HSA)免疫小鼠； ②收集免疫小鼠的脾细胞，并与Sp2/0骨髓瘤细胞进行融合，用HAT培养基进行选择性培养； ③用HSA抗原包被ELISA平板，采用间接ELISA方法对杂交瘤细胞培养上清中的抗体含量进行检测，筛选获得一株稳定分泌抗HSA单克隆抗体的杂交瘤细胞株11A2。
3.根据权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体，其特征在于所述的单克隆抗体与HSA发生抗原抗体反应,属IgGl亚型抗体。
4.根据权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株11A2的应用，其特征在于，杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体具有多种的应用。
5.根据权利要求4所述的一种杂交瘤细胞株11A2的应用，其特征在于，杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体用于极微量或残留量白蛋白的检测。
6.根据权利要求5所述的一种杂交瘤细胞株11A2的应用，其特征在于，将杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体用于极微量或残留量的白蛋白ELISA检测试剂盒。
7.根据权利要求4所述的一种杂交瘤细胞株11A2的应用，其特征在于，将杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体用于纯化HSA。
8.根据权利要求7所述的一种杂交瘤细胞株11A2的应用，其特征在于，将杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体制成用于纯化HSA的免疫亲和柱。
9.根据权利要求1所述的一种杂交瘤细胞株11A2产生的单克隆抗体，可应用于工业化生产。
【文档编号】C07K1/22GK104130978SQ201410232584
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年5月29日 优先权日:2014年5月29日
【发明者】齐智, 史洁, 齐晓龙, 康延申, 松井彦明, 陈仙子, 牛德云 申请人:齐智