一种纳豆枯草芽孢杆菌以及由该菌株提纯维生素甲萘醌-7的方法
【专利摘要】本发明提供了一种纳豆枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis natto)ST188,CGMCC No.8400以及一种用该菌株提纯高纯度的维生素甲萘醌-7的高收率方法。该方法包括以下步骤：1)将所述纳豆菌发酵液喷雾干燥，用溶剂提取或浸溶纳豆菌发酵液喷干粉，获得浸溶液；2)将步骤1)获得的浸溶液浓缩得到浸膏；3)将步骤2)获得的浸膏通过柱层析，并进行梯度或等度洗脱，收集液浓缩，得到甲萘醌-7粗品；4)将步骤3)得到的甲萘醌-7粗品结晶提纯，即得所述维生素甲萘醌-7纯品。CGMCC No.84002013.10.31
【专利说明】-种纳豆枯草芽抱杆菌W及由该菌株提纯维生轰甲寨 醒-7的方法
[0001] 本申请要求2014年03月31日提交的中国专利申请号为201410129217. 2,发明名 称为"一种纳豆枯草芽抱杆菌W及由该菌株提纯维生素甲蔡酿-7的方法"的发明专利申请 的优先权。
【技术领域】
[0002] 本发明涉及一种纳豆枯草芽抱杆菌炬acillus subtilis natto)ST188, CGMCC No. 8400, W及由该菌株提纯维生素甲蔡酿-7的方法。
【背景技术】
[0003] 由于维生素K具有促进凝血的作用，又被称为凝血维生素。近半个世纪W来，人 们对维生素K的认识仅限于其对凝血系统的影响，直到1960年Bouckaed发现维生素K可 W促进兔子的骨折愈合。1975年，Pettifor等首次提出维生素K参与人体骨代谢的假说之 后，人们对维生素K在骨骼新陈代谢的作用才有了深入的认识。
[0004] 维生素K族包括数个脂溶性的2-甲基-1，4-蔡酿衍生物。天然的维生素K包括 维生素Kl (即叶绿酿）和维生素K2 (即甲蔡酿类），其W在2-甲基-1，4-蔡酿环状结构的 3号位置上的亲脂性侧链为特征。叶绿酿的侧链是确定长度的不饱和姪链，甲蔡酿的侧链则 是不确定长度的不饱和姪链。（维生素Kl即叶绿酿为一种化合物，维生素K2为一系列化合 物）。
[0005] 维生素K2不单有促进凝血、改善动脉硬化的作用，国外也有作者在研究其对肝癌 和白血病的作用。现在我国已进入老龄化社会，骨质疏松患者发病率较高。大量资料研究 表明，维生素K2缺乏可导致老年人髓骨骨折和骨密度降低。维生素K2缺乏，血清未駿化骨 巧蛋白水平降低，血清駿化骨巧蛋白水平也可能降低，从而可能导致老年人骨密度降低发 生髓骨骨折危险。
[0006] 维生素K2作为一种营养物质，并可W作为骨代谢调整物质，覆盖全身的作用；畐山 作用较少，呈脂溶性，可W饭后服用，不论什么年龄都适宜使用。（邹志强，维生素K2的研究 进展，中国骨质疏松杂志，2005,11 (3) :389-392)
[0007] 1995年日本开始将维生素K2制剂作为改善骨量减少、疼痛的骨质疏松症的药物 销售。（王理明，维生素K2与骨质疏松，2007, 26 (4) =293-295)
[0008] 维生素K2 (2-甲基-3-全反式-聚戊帰-1，4-蔡酿）或甲蔡酿类是一族异戊帰基 衍生物。由5个碳原子组成的异戊二帰残基的数量可用于区分甲蔡酿系化合物。其命名规 则是基于异戊二帰基的数量，例如"甲蔡酿"或"MK"之后加上基团的数量。尽管甲蔡酿侧 链上已经被发现最多达到15个异戊二帰基，但在人类和动物组织中出现的只有含有2到13 个异戊二帰基的甲蔡酿。脱甲基化的甲蔡酿，即在2号碳原子位点上未结合的甲蔡酿也已 经被发现。
[0009] 维生素K2的一般性名称或常用名为甲蔡酿，其基本成分为甲蔡酿-4(MK-4)和甲 蔡酿-7 (MK-7)。已知MK-7是活性最强的维生素K2中的一种。
[0010] 叶绿酿及2种常见的甲蔡酿结构图如下所示。
[0011] 维生素Kl [001引 分子量；450
【权利要求】
1. 一种提纯维生素甲萘醌-7的方法，该方法包括以下步骤： 1) 将纳豆菌发酵液喷雾干燥，用溶剂提取或浸溶纳豆菌发酵液喷干粉，获得浸溶液， 所述纳豆菌为纳豆枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis natto)ST188,保藏号为：CGMCC No.8400 ； 2) 将步骤1)获得的浸溶液浓缩得到浸膏； 3) 将步骤2)获得的浸膏通过柱层析，并进行梯度或等度洗脱，将收集液浓缩，得到甲 萘醌-7粗品； 4) 将步骤3)得到的甲萘醌-7粗品结晶提纯，即得所述维生素甲萘醌-7纯品。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1)中，将纳豆菌发酵液喷雾干燥前，向所 述纳豆菌发酵液中添加〇. 1-1重量％的大豆油。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤3)中，所述柱层析的方法包括：首先将步 骤2)获得的所述浸膏以湿法上柱脱色，并以第一淋洗剂洗脱；然后将脱色后的产物以湿法 干法混合上柱方式进行纯化，即先以湿法装柱，再将脱色后的产物以干法装柱的方式装填 于湿法装柱的上层，并以第二淋洗剂洗脱，其中湿法干法混合上柱的柱中，所述湿法装柱与 所述干法装柱的体积比为1 :〇. 2-2。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中，在步骤1)中，所述提取或浸溶条件包括：将纳豆 菌发酵液喷干粉与溶剂按1 :3_8的质量比混合，在15-40°C的温度下，以20-60rpm搅拌速 率搅拌20-40min，固液分离，所得清液即为浸溶液。
5. 根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，在步骤1)中，所述溶剂选自甲醇、 石油醚、丙酮、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醇、乙酸乙酯、乙酸丁酯和75-100体积％乙醇中的 一种或多种。
6. 根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其中，在步骤2)以及步骤3)中，所述浓 缩为减压浓缩，所述减压浓缩的条件包括：温度为40-95°C，真空度小于3000Pa。
7. 根据权利要求3所述的方法，其中，将步骤2)获得的所述浸膏以湿法上柱脱色包 括：将硅胶和石油醚按1 :1. 5-2质量比混匀后装柱，再将步骤2)获得的浸膏和石油醚按1 : 0. 5-1质量比混匀后上柱。
8. 根据权利要求3或7所述的方法，其中，所述第一淋洗剂为非极性溶剂；所述第一淋 洗剂的用量为层析柱体积的2-3倍。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中，所述第一淋洗剂为石油醚、正己烷和环己烷中的 一种或多种。
10. 根据权利要求3所述的方法，其中，将脱色后的产物以湿法干法混合上柱方式进行 纯化包括：先将硅胶和石油醚以1 :1. 5-2的质量比混匀后装柱；再将所述脱色后的产物与 硅胶和石油醚以1 :3-4 :4-5的质量比混合、阴干后装填在先以湿法装填的柱中。
11. 根据权利要求3或10所述的方法，其中，所述第二淋洗剂选自石油醚、体积比为1 : 9的二氯甲烷和石油醚的混合物或者体积比为1 :9的三氯甲烷和石油醚的混合物，其中，所 述石油醚的用量为层析柱体积的10-15倍，所述体积比为1 :9的二氯甲烷和石油醚的混合 物的用量为层析柱体积的4-5倍，所述体积比为1 :9的三氯甲烷和石油醚的混合物的用量 为层析柱体积的4-5倍。
12. 根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述纳豆菌发酵液为将所述纳豆枯 草芽孢杆菌ST188接种在含有10-50g/1000mL黄豆粉和5-45g/1000mL蔗糖的培养基中，在 30-40°C，经过20-48小时发酵获得纳豆菌发酵液，其中所述纳豆枯草芽孢杆菌ST188的接 种浓度为5-20%。
13. 一种纳豆枯草芽抱杆菌（Bacillus subtilis natto) ST188,保藏号为：CGMCC No.8400。
【文档编号】C07C50/14GK104262129SQ201410564384
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年3月31日
【发明者】陈杰鹏, 段丽丽, 陈煜藩, 陈鸿锐, 邱雪莲, 蔡桂珠, 洪琳, 胡留松, 黄晓莹, 张岳霖, 许志锴 申请人:广东双骏生物科技有限公司