与缺血性脑卒中组织特异性结合的HGG多肽及其应用的制造方法与工艺

本发明属于蛋白质多肽技术领域，涉及一种与病理组织特异性结合肽，特别是一种与缺血性脑卒中组织特异性结合的HGG多肽。本发明还涉及该多肽筛选及制备的方法，以及该多肽在制备缺血性脑卒中分子成像探针上的应用。

背景技术：
脑卒中是一种突然起病的脑血液循环障碍性疾病，它是全球第二位致死原因和首位致残原因，约一半左右的幸存者永久残疾。中国疾病预防控制中心数据显示脑卒中也是我国首位致残原因和“头号杀手”，我国脑卒中病人700多万，发病率每年上升8.7％。脑卒中患者救治需要快速恢复脑血流、抢救缺血脑组织，迄今唯一有效治疗方法是血管再通，而重组组织型纤溶酶原激活剂(rt-PA)疗效呈时间依赖性，治疗时间窗短，目前美国仅有5％、中国仅有1.2％患者可获得有效的再通治疗。在许多情况下，开通闭塞的颅内大血管非但不能使患者获益，甚至有害，原因包括患者无半暗带、脑微循环内继发血栓沉积和血管再通伴随的再灌注损伤等。目前指导脑卒中早期溶栓治疗的“金标准”是正电子发射断层扫描成像(PET)，但PET空间分辨率低、扫描速度慢、费用昂贵及普及率低等缺点限制了其临床应用。磁共振成像(MRI)的灌注加权成像/弥散加权成像(PWI/DWI)不匹配法已在临床开始用于指导急性缺血性卒中超早期的溶栓治疗，但该法既高估了梗死灶，又高估了半暗带，依据其判定溶栓的有效性、准确性以及对治疗的指导作用尚有待进一步研究。因此，开发高灵敏度指导急性缺血性卒中超早期的溶栓治疗的分子探针则显得尤为重要。开发针对缺血性脑卒中的神经保护药物对脑卒中患者的救治具有革命性意义。DouglasJ.Cook报道突触后致密物蛋白质95(PSD-95)抑制剂可以减小食蟹猴缺血性脑卒中组织面积，保护神经功能损伤。而若通过靶向性肽段递送这类神经保护类分子有望实现缺血性脑卒中组织更好的药物富集，达到更显著的神经保护效果。国家“十二五”规划明确指出，在生物药领域，将重点支持单克隆抗体药物、新型基因工程重组蛋白质及多肽药物、基因治疗药物、新型疫苗等。多肽药物可以通过人工方法合成，由于其分子量小、活性高、穿透力强、特异性高、毒性低等特点使其在肿瘤治疗上有重要应用价值。目前，全世界获批上市的多肽类药物已经超过50个，如目前国际市场上畅销的亮丙瑞林、戈瑞林、布舍瑞林、促黄体激素拮抗剂等。目前，有140个多肽类药物在临床研究中，而在临床前研发阶段中的多肽类药物达到500至600个，2010年多肽类药物的全球市场规模约为130亿美元。国内市场方面，我国多肽药物的市场销售额从2006年的110.82亿元上升至2009年的194.79亿元，复合年增长率达到20.68％。目前，还没有靶向缺血性脑卒中组织的多肽。该多肽获得对开发高灵敏度指导急性缺血性卒中超早期的溶栓治疗的分子探针及靶向递送神经保护类药物以达到更好的疗效都具有重要的应用价值。

技术实现要素：
发明目的：本发明的目的是针对缺乏缺血性脑卒中组织特异性靶向多肽的现状，提供一种与缺血性脑卒中组织特异性结合的HGG多肽。本发明的另一个目的是提供了上述HGG多肽的筛选方法。本发明的另一个目的是将该HGG多肽偶联磁性纳米材料构建特异性分子探针，在体内水平通过MRI成像评价该探针的特异性及功能。本发明利用生物信息学方法分析上述多肽的理化性质。本发明通过全方位、多层次鉴定多肽的靶向性：噬菌体-肽水平，通过与体内回输后噬菌体滴度测定及免疫荧光染色鉴定噬菌体单克隆的特异性，通过免疫荧光双标实验验证该噬菌体-肽结合的细胞类型特异性；在合成多肽水平方面，通过免疫荧光实验鉴定该多肽的缺血脑组织靶向性。技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种与缺血性脑卒中组织特异性结合的HGG多肽，所述HGG多肽的氨基酸序列如SEQIDNO:1所示。上述HGG多肽分子量为800.9，理论等电点为8.75，是由113个原子构成，在哺乳动物的网织红细胞半衰期为3.5h，该多肽脂溶系数为97.14，总平均亲水性为-0.257。上述HGG多肽是通过体内噬菌体展示肽库筛选技术获得，并通过化学方法大量标准化合成。上述的HGG多肽的筛选方法，包括以下步骤：1)MCAO模型鼠构建；2)尾静脉注射噬菌体展示七肽库：MCAO模型鼠再灌注1h后，通过尾静脉注射1×1011pfu噬菌体展示七肽库，体内循环1h；3)灌流洗涤：戊巴比妥钠腹腔麻醉后，打开胸腔，左心室进针灌注PBS，充分洗涤去除非特异性结合的噬菌体克隆；4)解剖取脑：解剖取出全脑，分离缺血侧及对侧半脑，投入装有LB液体培养基中；5)组织匀浆释放噬菌体克隆：组织称重后充分匀浆，释放出噬菌体克隆；6)噬菌体克隆扩增：将匀浆液测滴度，剩余匀浆液加入处于对数生长前期的E.coliER2738培养物中进行扩增；7)扩增的噬菌体次级库再投入下一轮筛选，方法同步骤1)～6)，总共经过四轮筛选即得含有与缺血性脑卒中组织特异性结合的多肽的噬菌体克隆。上述的与缺血性脑卒中组织特异性结合的HGG多肽在MCAO模型体内的靶向性及成像方面的应用。上述的与缺血性脑卒中组织特异性结合的HGG多肽在制备高灵敏度分子成像探针方面的应用。在制备高灵敏度分子成像探针方面的应用中，上述HGG多肽与磁性氧化铁纳米颗粒偶联后构建磁共振成像分子探针。上述的与缺血性脑卒中组织特异性结合的HGG多肽在制备靶向递送神经保护药物载体方面的应用。有益效果：本发明具有以下优点：1、本发明筛选得到了一种特异性与缺血性脑卒中组织结合的HGG多肽，填补了国内目前缺乏与缺血性脑卒中组织特异性结合的多肽的空白。2、本发明筛选获得的七肽可通过人工方法合成，小分子多肽分子量小、活性高、穿透力强、特异性高、毒性低，适合构建体内成像分子探针及用于靶向药物递送。3、本发明筛选得到的HGG多肽在噬菌体肽及合成肽水平体内实验均证实具有良好的特异性，为该多肽的临床前深入研究奠定了坚实的基础。4、本发明筛选得到的HGG多肽可构建特异性分子探针用于缺血性脑卒中分子成像并可以靶向递送神经保护类药物至神经元细胞，增强药物的神经保护作用。附图说明图1为滴度测定法鉴定HGG-M13体内与缺血性脑卒中组织结合特异性图(*表示P值小于0.05，**表示P值小于0.001)；图2为噬菌体免疫荧光染色法鉴定HGG-M13体内与缺血性脑卒中组织结合特异性图(标尺长度代表100μm)；图3为HGG-M13结合的细胞类型特异性鉴定图(标尺长度代表100μm)；图4为荧光标记HGG多肽体内与缺血性脑卒中组织结合特异性鉴定图(标尺长度代表100μm)；图5为HGG-NPs磁共振分子探针在MCAO模型中小动物活体成像图。具体实施方式本发明通实施例中所用的实验材料、试剂及试剂配方如下：主要实验材料：1、噬菌体展示肽库Ph.D.-7：购自NewEnglandBioLabs公司。复杂度～2.7×109个转化子。其-96gIII测序引物为5’-HOCCCTCATAGTTAGCGTAACG-3’。随库所带的宿主菌E.coliER2738为四环素抗性的雄性大肠杆菌，以含50％甘油的菌体培养物形式提供。2、C57小鼠：雄性，20g体重，购自军事医学科学院，饲养于东南大学SPF级动物房。主要试剂及配方：主要试剂1、噬菌体展示肽库筛选主要试剂：X-gal、DMF、NaN3、Tween-20、BSA、甘氨酸、四环素均购自Amresco；蛋白胨、酵母提取物购自OXOID。2、特异性鉴定主要试剂：HRP标记鼠抗M13抗体购自Parmacia公司；AlexaFluor555标记羊抗小鼠抗体购自MolecularProbes公司；兔抗小鼠NeuN(神经元Marker)及兔抗小鼠GFAP抗体(星形胶质细胞Marker)购自Millipore公司。主要试剂配方1、LB培养基：每升含10gBacto-Tryptone(细菌用胰蛋白胨)，5gyeastextract(酵母膏)，5gNaCl。高压灭菌，室温贮存。2、LB/IPTG/Xgal平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mLIPTG/Xgal，混匀倒平板。平板4℃避光贮存。3、顶层琼脂：每升含10gBacto-Tryptone，5gyeastextract，5gNaCl，1gMgCl2·6H2O，7g琼脂粉。高压灭菌，分成5mL等份。固体培养基室温贮存，用时微波炉融化。4、四环素贮液：以20mg/mL的浓度溶于50％乙醇中。-20℃避光贮存。用前摇匀。5、LB-Tet平板：LB培养基+15g/L琼脂粉。高压灭菌，冷却至低于70℃时，加入1mL四环素贮液，混匀倒平板。平板4℃避光贮存。6、PBS：每升含NaCl：8.00g，KCl：0.20g，Na2HPO4·12H2O：3.58g、KH2PO4：0.24g，PH＝7.2。高压灭菌，室温存储。7、PEG/NaCl：20％(w/v)PEG-8000，2.5MNaCl。高压灭菌，室温贮存。8、碘化物缓冲液：10mMTris-HCl(pH8.0)，1mMEDTA，4MNaI。室温避光贮存。9、IPTG/X-gal配方：将1.25gIPTG(isopropylβ–D-thiogalactoside)和1gX-gal溶于25mL二甲基甲酰胺中。溶液-20℃避光贮存。以上为本发明8个实施例中所用主要材料和试剂。下面详细介绍具体实施方式。实施例1HGG多肽的筛选及制备本实例采用体内噬菌体展示肽库筛选技术获得与缺血性脑卒中组织特异性结合的HGG多肽，具体步骤如下：1、MCAO模型构建：C57小鼠用0.4％戊巴比妥钠(40mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定。颈正中线切口，沿胸锁乳突肌内缘分离肌肉和筋膜，分离右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)和颈内动脉(ICA)。近心端结扎CCA，远心端结扎ECA，用微动脉夹暂时夹闭ICA，然后在ECA分叉部2mm处剪一小口，将拴线插入到ICA，用纤维外科镊轻推拴线，从血管分叉处开始算距离，当插入深度在1cm时，紧紧系牢ECA远心端的细线。缺血1h，解开ECA远心端的细线，轻轻将栓线拔出，立即紧紧系牢ECA远心端的细线，防止出血。同时，松开CCA近心端细线，恢复CCA供血。通过Longa法对模型进行神经功能评分。Longa法神经功能评分分5个等级：0分，正常，无神经功能缺损；1分，左侧前爪不能完全伸展，轻度神经功能缺损；2分，行走时，向左侧(瘫痪侧)转圈，中度神经功能缺损；3分，行走时，身体向左侧(瘫痪侧)倾倒，重度神经功能缺损；4分，不能自发行走，有意识丧失。选取神经功能评分2分的MCAO模型鼠(中度神经功能缺损)进行体内噬菌体展示肽库的筛选。2、尾静脉注射噬菌体展示七肽库：MCAO模型鼠再灌注1h后，通过尾静脉注射1×1011pfu噬菌体展示七肽库，体内循环1h。3、灌流洗涤：0.4％戊巴比妥钠腹腔麻醉后，打开胸腔，左心室进针灌注PBS合计200mL，充分洗涤去除非特异性结合的噬菌体克隆。4、解剖取脑：解剖取出全脑，分离缺血侧及对侧半脑，投入装有500μLLB液体培养基的1.5mLEppendorf管中。5、组织匀浆释放噬菌体克隆：组织称重后充分匀浆，释放出噬菌体克隆。6、噬菌体克隆扩增：将匀浆液测滴度，剩余匀浆液加入处于对数生长前期的20mLE.coliER2738培养物中进行扩增。7、扩增后的噬菌体次级库用于下一轮筛选，筛选方法同上；其中，N轮筛选投入的噬菌体是N-1轮洗脱液扩增后的噬菌体次级库；四轮筛选后，在LB/IPTG/Xgal平板上测定第四轮淘选所得匀浆液滴度。从第四轮筛选所得匀浆液滴度板上用灭菌牙签或吸头挑取120个蓝色噬菌斑到至1mL对数生长前期的E.coliER2738培养管中，扩增单克隆噬菌体。根据每轮筛选噬菌体匀浆液的滴度，计算每g组织的得率及富集度。每g组织的得率＝每g组织回收的噬菌体数/总投入噬菌体数。富集度＝第n轮筛选每g组织的得率/第n-1轮筛选每g组织的得率(n≥2)。整个筛选过程的选择压及富集情况如表1所示，四轮筛选后，与缺血性脑卒中组织结合的噬菌体克隆合计富集了10.4倍。表1与缺血性脑卒中组织结合的多肽体内筛选的选择压控制及噬菌体克隆的富集情况实施例2噬菌体单克隆DNA提取及序列测定本实施例提取120个候选噬菌体单克隆的DNA并进行序列测定。实施例1中挑取的单克隆噬菌体扩增后，离心去除细菌，取500μL噬菌体上清加入200μLPEG/NaCl，混匀冰上静置10min，4℃14000rpm离心10min，沉淀物彻底重悬于100μL碘化物缓冲液，加250μL乙醇，室温温育10min后，离心10min，弃上清，用70％乙醇洗沉淀，短暂真空干燥后沉淀重悬于30μLTE，进行测序。本实施例中所有测序均由华大基因完成。测序引物为-96gIII：5’-HOGTATGGGATTTTGCTAAACAAC-3’。利用SeqMan软件分析噬菌体克隆测序结果，并根据遗传密码表将碱基序列翻译为氨基酸序列。统计发现测序成功的106个噬菌体克隆共有17种序列，其中有59个噬菌体克隆携带外源插入序列如SEQIDNO:1所示，占55.66％，命名为HGG。实施例3HGG多肽的合成及荧光修饰HGG多肽由吉尔生化(上海)有限公司按照所述氨基酸序列通过化学方法人工合成。合成产物通过高效液相色谱(HPLC)纯化，经质谱(MS)鉴定。本发明所述多肽的纯度均在95％以上。HGG多肽荧光标记由吉尔生化(上海)有限公司完成。修饰方式为HGG肽-COOH端增加一个赖氨酸K，通过其侧链氨基与5-TAMRA荧光染料连接。本发明所述5-TAMRA荧光标记肽通过高效液相色谱(HPLC)纯化，经质谱(MS)鉴定，纯度均在95％以上。实施例4HGG多肽理化性质本实施例利用ExPASy网站提供的ProtParamtool(http://web.expasy.org/protparam/)分析HGG多肽理化性质。如表2所示，该多肽分子量为800.9，理论等电点为8.75，是由113个原子构成，在哺乳动物的网织红细胞半衰期约为3.5h，该多肽较稳定，该多肽脂溶系数为97.14，总平均亲水性为-0.257。表2HGG肽理化特征分析实施例5HGG-M13噬菌体-肽克隆与缺血性脑卒中组织结合特异性鉴定本实施例选取携带HGG外源插入片段的噬菌体-肽克隆(命名为HGG-M13)，通过噬菌体体内回输实验鉴定其与缺血性脑卒中组织结合的特异性。1.滴度测定法鉴定HGG-M13的特异性构建MCAO模型，尾静脉注射1×1011pfu噬菌体，循环1h后异氟烷麻醉，左心室PBS灌流200mL，解剖分离全脑后一分为二(缺血侧及对侧)，称重后组织匀浆，释放噬菌体。测定噬菌体滴度。计算并比较单位质量的组织中噬菌体的滴度值。本实验中实验组注射HGG-M13，对照组注射不含外源插入片段的Insertless-M13，假手术组拴线插入颈内但不入脑。如图1所示，HGG-M13在MCAO模型组，缺血同侧单位质量(g)脑组织的滴度值显著高于对侧脑组织，二者比值为1.85，差异具有统计学意义。在假手术组，HGG-M13在缺血同侧及对侧脑组织的分布并没有显著差异。以上结果说明了HGG-M13与缺血性脑卒中组织结合的特异性。同时，在缺血同侧HGG-M13在单位质量的脑组织中的滴度也显著高于Insertless-M13的滴度，进一步说明了HGG-M13与缺血脑卒中组织特异性结合是依赖于外源的插入片段HGG。2.免疫荧光法鉴定HGG-M13的特异性构建MCAO模型，尾静脉注射1×1011pfu噬菌体，循环1h后异氟烷麻醉，左心室灌流PBS200mL充分去除未结合的噬菌体克隆，继续4％PFA50mL灌注固定，解剖分离全脑，PFA过夜固定后蔗糖梯度脱水，OCT包埋，冰冻切片。冰冻切片组织与鼠抗M13抗体37℃孵育1h，洗涤6次后，加入AlexaFluor555荧光标记抗小鼠二抗，37℃孵育1h。洗涤6次后，DAPI进行细胞核染色，封片观察。如图2所示，在MCAO模型缺血同侧有明显HGG-M13红色荧光信号，且远高于对侧荧光信号强度，说明HGG-M13在脑卒中缺血侧的特异性分布。同时，HGG-M13在脑卒中缺血侧的荧光信号明显高于Control-M13的荧光信号，进一步说明了HGG-M13与缺血脑卒中组织结合的特异性，且这种特异性的结合是依赖于外源的插入片段HGG。实施例6HGG-M13结合的细胞类型特异性鉴定本实施例通过免疫荧光双染方法研究HGG-M13与神经元及星形胶质细胞的共定位情况，鉴定HGG-M13结合的细胞类型特异性。构建MCAO模型，尾静脉注射1×1011pfu噬菌体-肽HGG-M13，循环1h后异氟烷麻醉，左心室灌流PBS200mL充分去除未结合的噬菌体克隆，继续4％PFA50mL灌注固定，解剖分离全脑，PFA过夜固定后蔗糖梯度脱水，OCT包埋，冰冻切片。冰冻切片组织与鼠抗M13抗体及兔抗小鼠NeuN(神经元Marker)或兔抗小鼠GFAP抗体(星形胶质细胞Marker)37℃孵育1h，洗涤6次后，加入AlexaFluor555荧光标记抗小鼠二抗及AlexaFluor488荧光标记抗兔二抗，37℃孵育1h。洗涤6次后，DAPI进行细胞核染色，封片观察。如图3所示，在MCAO模型缺血同侧HGG-M13的荧光信号与NeuN(神经元Marker)共定位，而不与GFAP(星形胶质细胞Marker)共标，说明HGG-M13主要与缺血脑卒中组织中的神经元细胞结合。HGG-M13与缺血脑卒中组织中的神经元细胞结合提示该肽段可以用于靶向递送神经保护药物，更好保护脑缺血后受损的神经元。实施例7外源合成的HGG肽与缺血性脑卒中组织结合的特异性构建MCAO模型，尾静脉注射荧光标记HGG肽HGG-(5-TAMRA)，循环15min后异氟烷麻醉，左心室灌流PBS100mL充分去除未结合的肽段，继续4％PFA50mL灌注固定，解剖分离全脑，PFA过夜固定后蔗糖梯度脱水，OCT包埋，冰冻切片。DAPI进行细胞核染色，封片观察。如图4所示，在MCAO模型缺血同侧有明显HGG-(5-TAMRA)红色荧光信号，且远高于对侧荧光信号强度，而在假手术组，HGG-(5-TAMRA)荧光信号不明显，说明HGG肽在脑卒中缺血侧的特异性分布。同时，HGG多肽在脑卒中缺血侧的荧光信号明显高于对照肽GGG-(5-TAMRA)的荧光信号，进一步说明了HGG多肽与缺血脑卒中组织结合的特异性。实施例8HGG多肽MRI分子成像探针的构建、表征及Micro-MRI成像本实施例将HGG多肽偶联顺磁性氧化铁纳米颗粒构建磁共振分子探针用于脑卒中缺血性脑组织Micro-MRI成像。合成的分子探针命名为HGG-NPs。通过常规方法对该分子探针进行表征，结果显示该探针水合粒径均值为187nm，具有良好的磁共振造影效能。构建MCAO模型，尾静脉注射荧光标记HGG-NPs及非靶向性对照探针NPs，在预设时间点行磁共振扫描，扫描序列为T2WI的turboRARE-T2序列，参数为参数为：TR2500ms，TE50ms，FOV2.0×2.0cm，反转角(FA)180°，矩阵256×256，层厚1mm。如图5所示，HGG-NPs探针注射30min即可在缺血性脑卒中组织中可发现明显的暗信号，随着时间延长，HGG-NPs在缺血性脑卒中组织中逐渐主动富集，说明探针具有良好的特异性和主动靶向性。而非靶向性对照探针NPs在缺血性脑卒中组织则没有明显的信号分布，进一步说明了HGG-NPs分子探针的特异性。该实施例提示可以基于HGG多肽构建特异性分子探针，用于缺血性脑卒中组织分子成像。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。