技术领域
本发明涉及一种混源单萜生物碱类化合物(hybrid monoterpenoid-alkaloid)化合物及其制备方法与应用，特别是涉及一种对海洋污损生物藤壶Balanus amphitrite幼虫具有极强的抑制活性的混源单萜生物碱类化合物及其制备方法与应用。
背景技术：
海洋生物污损是有机分子、微生物、动物、植物、以及它们的副产物在海洋潜没设施表面的危害性积聚。这种危害性积聚经常发生在没有保护的海洋潜没设施的表面，包括海运和旅游的船舶，海军军舰，热交换器，海洋传感器以及水产养殖基地等。生物污损引起了巨大的经济损失，仅以美国海军军舰为例，每年在这方面的经济损失在18到26亿美元之间，而美国海军军舰数量仅占全球船舶数量的0.5%，因此海洋生物污损是极其严重的自然危害。藤壶因其很强的黏附能力是目前所知的污损生物中非常普遍的代表性生物。自2008年全球取消了有毒防污剂有机锡的使用后，寻找安全高效的海洋防污剂成为国际上急需解决的课题。海洋天然产物被认为是新型海洋防污剂的重要来源。实际上，在过去的几十年里已经从海绵，珊瑚和海藻等海洋生物中发现了很多有强抗污损活性的化合物。然而，从上述大型生物中发现的活性化合物由于受到量的限制而大大影响了其潜在的应用。海洋微生物由于在实验室中可以大规模发酵，不易破坏自然环境，而成为活性海洋化合物的最重要来源。然而，近年来尚未见到从海洋微生物中获得有重要抗污损活性的混源单萜生物碱类化合物作为防污剂的使用。（J.A. Callow, M.E. Callow, Nat. Commun. 2011, 2, 244–253； C.M. Kirschner, A.B. Brennan, Annu. Rev. Mater. Res.2012, 42, 1–19； M. Schultz, J. Bendick, E. Holm, W. Hertel, Biofouling2011, 27, 87–98；N. Fusetani, Nat. Prod. Rep.2004, 21, 94–104；N. Fusetani, Nat. Prod. Rep. 2011, 28, 400–410；P.-Y. Qian, Y. Xu, N. Fusetani, Biofouling2010, 26, 223–234。）
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种来源于海洋真菌的混源单萜生物碱类化合物及其制备方法与作为海洋防污剂的应用，它能满足现有技术的上述需求。菌种保藏信息：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号 中国科学院微生物研究所；保藏日期：2012年12月17日；保藏编号：CGMCC6959；分类命名：Scopulariopsis sp.。
本发明提供式I化合物或其药学上可接受的盐:
，或其药学上可接受的盐。
本发明提供式I化合物的制备方法，其特征在于先在菌种培养基中对分离自柳珊瑚Carijoa sp.的内生真菌Scopulariopsis sp. (TA01-33) 进行菌种培养，再在发酵培养基中对该真菌进行发酵培养，然后将所得发酵液过滤，除去菌体，将滤液浓缩后，用乙酸乙酯萃取；萃取液浓缩后分别进行正相硅胶柱层析、Sephadex LH-20 凝胶柱层析后，再经HPLC高效液相制备色谱，将所得洗脱液浓缩，即为式I化合物。
上述制备方法中菌种培养基优选含有葡萄糖0.1%–5.0%（重量百分比，下同）、酵母膏0.01%–1%、蛋白胨0.01%–1%、琼脂0.1%–3.0%、氯化钠0.05%–5%，其余为水，培养温度优选为0–30°C，培养时间优选为3–15天；发酵培养基优选含有葡萄糖0.1%–5.0%（重量百分比，下同）、酵母膏0.01%–1%、蛋白胨0.01%–1%、氯化钠0.05%–5%，其余为水，培养温度优选为0–30°C，培养时间优选为10–60天；所述的正相硅胶柱层析采用的固定相优选200–300目硅胶，流动相优选体积比为5%–95%的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂；所述Sephadex LH-20 凝胶柱层析采用的流动相优选体积比为石油醚:氯仿:甲醇=2:1:1的混合溶剂；所述HPLC高效液相制备色谱中采用的色谱柱为本领域常规ODS C18柱，优选为Kromasil 10×250 mm, 7 μm，流速优选为1.0–5.0 mL/min，流动相优选体积比为5%–95%的甲醇-水混合溶剂。
本发明从海洋真菌中获得的混源单萜二氢喹啉酮化合物对海洋污损生物藤壶Balanus amphitrite幼虫具有极强的抑制活性，可用于开发海洋防污剂，应用前景广阔。
本发明的另一实施方案提供式I化合物或其药学上可接受的盐在制备海洋防污剂中的应用。
本发明中术语“药学上可接受的盐”是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成盐。可参见“Salt selection for basic drugs”, Int. J. Pharm. (1986), 33, 201–217。
为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
实施例1
柳珊瑚内生真菌Scopulariopsis sp.(TA01-33)的菌种培养
菌种培养所用的培养基含有葡萄糖1.0%（重量百分比，下同）、酵母膏0.2%、蛋白胨0.2%、琼脂1.0%、氯化钠3.0%，其余为水，使用时制成试管斜面，真菌菌株在30℃ 下培养5天。
柳珊瑚内生真菌Scopulariopsis sp.(TA01-33)的发酵
发酵培养所用的培养基含有葡萄糖1.0%（重量百分比，下同）、酵母膏0.2%、蛋白胨0.2%、氯化钠3.0%，其余为水；真菌菌株于28℃培养60天。
(3) 式I化合物的提取分离
取10 L步骤（2）得到的发酵液过滤，除去菌体，将滤液浓缩后，用等体积的乙酸乙酯萃取5次；萃取液浓缩后分别进行正相硅胶柱层析（固定相为200–300目硅胶；流动相为30%乙酸乙酯/石油醚混合溶剂，体积比）、Sephadex LH-20 凝胶柱层析（石油醚：氯仿：甲醇=2：1：1的混合溶剂，体积比）后，再经HPLC高效液相制备色谱分离（色谱柱为Kromasil 10×250 mm，7μm，流速为 2.0 mL/min，流动相为75%的甲醇-水混合溶剂，体积比），将所得洗脱液浓缩，得无色结晶，即为式I化合物。
式I化合物的结构确证数据: 无色结晶; [α]24D = +133.5 (c 0.017, MeOH); 1H NMR (acetone-d6, 400 MHz, TMS) 和 13C NMR (acetone-d6, 100 MHz, TMS), 见表1; 红外IR(KBr) νmax 3366, 2926, 1687, 1600, 1421 and 1107 cm–1; 紫外UV (MeOH) λmax (log ε): 204.8 (0.69), 211.2 (0.64), 252.8 (0.13), 281.6 (0.05) nm; 质谱EIMS m/z 437 [M]+; 高分辨质谱HREIMS m/z 437.2200 [M]+ (calcd for C26H31NO5, 437.2197).
表1 式I化合物的核磁数据
实施例2
（1）柳珊瑚内生真菌Scopulariopsis sp.(TA01-33)的菌种培养
菌种培养所用的培养基含有葡萄糖0.1%–5.0%（重量百分比，下同）、酵母膏0.01%–1%、蛋白胨0.01%–1%、琼脂0.1%–3.0%、氯化钠0.05%–5%，其余为水，使用时制成试管斜面，真菌菌株在0–30℃下培养3–15天。
（2）柳珊瑚内生真菌Scopulariopsis sp.(TA01-33)的发酵
发酵培养所用的培养基含有葡萄糖0.1%–5.0%（重量百分比，下同）、酵母膏0.01%–1%、蛋白胨0.01%–1%、氯化钠0.05%–5%，其余为水，真菌菌株于0–30℃培养10–60天。
(3) 式I化合物的提取分离
取5–50 L步骤（2）所得的发酵液过滤，除去菌体，将滤液浓缩后，用1–3倍体积的乙酸乙酯萃取2–5次；萃取液浓缩后分别进行正相硅胶柱层析（固定相为本领域常规正相硅胶，流动相为5%–95%的乙酸乙酯-石油醚混合溶剂，体积比）、Sephadex LH-20 凝胶柱层析（流动相为石油醚:氯仿:甲醇=2:1:1的混合溶剂，体积比）后，再经HPLC高效液相制备色谱（色谱柱为本领域常规ODS C18柱，流速为1.0–5.0 mL/min，流动相为5%–95%的甲醇-水混合溶剂，体积比），将所得洗脱液浓缩，得无色结晶，即为式I化合物。其中式Ⅰ化合物的结构确证数据与实施例1中相应数据一致。
实施例1–2中未具体指明的其他菌种培养、发酵条件，以及正相硅胶柱色谱分离、Sephadex LH-20 凝胶柱层析分离、高效液相色谱分离等其他实验操作条件均为本领域常规的实验操作条件，本领域的技术人员可以根据实际需要，进行合理的选择。
实施例3
在菌种培养基中对海洋真菌Scopulariopsis sp.(TA01-33)进行菌种培养，再在发酵培养基中对该真菌进行发酵培养，将所得发酵液过滤，除去菌体，将滤液浓缩后，用乙酸乙酯萃取；萃取液浓缩后分别进行正相硅胶柱层析、Sephadex LH-20 凝胶柱层析后，再经HPLC高效液相制备色谱，将所得洗脱液浓缩，得无色晶体，即为式I化合物，其结构确证数据与实施例1中相应数据一致。其中所述菌种培养基中含有葡萄糖、酵母膏、蛋白胨、琼脂、粗海盐、水，所述发酵培养基中含有大米、粗海盐、蛋白胨、水；所述的色谱分离为正相硅胶柱色谱分离、Sephadex LH-20 凝胶柱层析和高效液相色谱分离。
为了探索更广泛的适用于制备本发明式Ⅰ化合物的方法，本实施例中菌种培养基、发酵培养基中各成分的添加，均按本领域中常规比例添加或按任意比例添加，色谱分离时所用硅胶的规格、Sephadex LH-20 凝胶的规格、色谱柱的型号及洗脱溶剂的选择，均为本领域的常规选择。实验结果表明，上述常规选择的制备方法，均能得到发明的无色晶体，即式Ⅰ化合物，其结构确证数据与实施例1中相应数据一致，仅仅存在个别化合物在纯度及收率方面的微小差异。
实施例1–3的结果表明，按照本领域常规的菌种培养、发酵条件，常规的正相硅胶柱色谱分离、Sephadex LH-20 凝胶柱色谱分离、高效液相色谱分离的条件对海洋真菌Scopulariopsis sp.(TA01-33)进行菌种培养、发酵、分离纯化，均能得到本发明式Ⅰ结构的化合物。本发明式Ⅰ化合物的制备方法，优选实施例1–2中记载的方法。
实施例4
本发明的式I化合物对藤壶Balanus amphitrite幼虫附着活性试验按照如下文献方法测试：Thiyagarajan, V.; Harder, T.; Qiu, J. W.; Qian, P. Y. Mar. Biol. (Berlin) 2003, 143, 543–554.
本发明的式I化合物及其晶体藤壶B. amphitrite幼虫附着具有极强的抑制活性，其EC50 值为0.045 μg/mL，而具有很高的安全性，其毒性功效比值LC50/EC50值222。上述活性远远强于美国海军规定的潜在的天然防污损化合物EC50值25 μg/mL的标准。更重要的是，它的毒性功效比值 (LC50/EC50) 远大于15，而LC50/EC50 大于15就被认为具有开发成安全防污剂的潜力。这表明式I化合物或其药学上可接受的盐可用于制备高效低毒的海洋防污剂，并且柳珊瑚内生真菌Scopulariopsis sp.(TA01-33)可进行大规模发酵生产，保证了式I化合物的天然来源，具有广阔的应用前景。