用于检测C‑KIT基因1675‑1681位突变的引物、探针及试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术领域，具体地说，涉及一种用于检测c-kit基因突变的引物、探针及相关试剂盒。

背景技术：

c-kit是一种原癌基因，位于染色体4q11-12，全长约80kb。c-kit编码的c-kit蛋白属于iii型受体酪氨酸激酶家族成员，它是分子量约为145kd的跨膜蛋白，包含了胞内的酪氨酸激酶区、跨膜区和配体结合位点胞外区。当配体与其结合后能激活自身酪氨酸蛋白激酶活性，通过一系列反应激活下游信号转导通路，从而调节细胞的生长与增殖。

胃肠道间质瘤(gist)是消化道最常见的间叶源性肿瘤。研究表明，在gist患者中c-kit基因突变率约为90％。

目前sanger测序法是c-kit基因突变检测的主要方法。然而，该方法的灵敏度低，会导致漏检及假阴性的发生，而且检测时间长，无法满足临床检测的实际需求。临床上迫切需要开发一种高灵敏度、快速的c-kit基因突变检测技术。

本发明的发明人在胃肠道间质瘤(gist)的日常检测中发现了与胃肠道间质瘤有关的位于c-kit基因的新突变位点，即1675-1681位替换突变。本发明的发明人针对该突变开发了一种快速、高灵敏、操作简便的检测试剂盒及相关的检测方法，可以用于gist化疗预后。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种用于检测c-kit基因突变的引物和探针，所述突变是1675-1681位替换为a(碱基突变：1675_1681＞a，蛋白突变：v559_e561＞a)。本发明的引物与探针包括如下序列：

正向引物(f)：ccatgtatgaagtacagtggaagaag(seqidno：1)

反向引物(r)：aagtcactgttatgtgtacccaa(seqidno：2)

探针(pb)：catggaaagcccctgtttcatactgacc(seqidno：3)

本发明另一方面提供一种用于检测c-kit基因1675-1681位突变的检测试剂盒，所述试剂盒包括seqidno.1-seqidno.2所示的引物和seqidno.3所示的探针。

根据所采用的pcr方法，本发明的试剂盒还可以包括内参基因和内控基因。

本发明另一方面提供一种检测c-kit基因1675-1681位突变的方法，其包括以下步骤：

(1)提取样本中的基因组dna，检测样本包括新鲜病理组织、石蜡包埋组织、全血和血浆等；

(2)用本发明的试剂盒对dna进行扩增；

(3)根据荧光pcr仪显示的ct值判断检测结果：检测反应体系的fam荧光强度，以fam达到设定的阈值时所需要的循环次数ct值作为阴性、阳性判定标准，ct值＞38或无扩增为阴性，ct值≤38为阳性。

本发明采用了特异性引物和探针技术，可以特异性检测c-kit基因突变。此方法灵敏度高、特异性强、检测速度快。

附图说明

图1为检测阴性样本(野生型)的pcr图。

图2为检测突变阳性样本的pcr图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明进一步阐述。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照本领域技术人员熟知的常规条件，或者按照制造厂商建议的条件。

一.原理

本发明的特异性引物与探针同dna模板结合后，taqdna聚合酶以脱氧核苷酸(dntp)为底物，对内参基因(internalreference，ir)及c-kit基因突变型基因进行体外扩增。检测采用荧光pcr技术，通过特异性探针水解释放荧光，监测pcr反应的进行，确定c-kit基因突变情况。

本发明的试剂盒单独设置了内参基因检测体系。内参基因是区别于待检c-kit基因的管家基因。通过检测内参基因的扩增情况(fam通道)，可分析待检dna是否能被正常扩增，从而排除dna纯度、浓度不佳，或者含有pcr抑制剂等造成pcr检测失败的情况。

本发明的试剂盒在c-kit基因突变型检测体系中同时设置了内控基因(internalcontrol，ic)检测体系。两种体系在同一pcr管中同时进行反应。内控基因也是区别于待检基因c-kit的管家基因。将识别c-kit基因突变模板的探针修饰为fam荧光基团，而将识别内控基因模板的探针修饰为hex荧光基团。通过检测内控基因扩增情况(hex通道)，可分析待检dna是否能被正常扩增，从而排除漏加试剂或样本、样本含有pcr抑制剂等造成pcr检测失败的情况。

进行本试剂盒检测结果判定时，阴性质控品(nc)中fam、hex通道检测均应无扩增(不呈典型的s型曲线。注：典型的s型曲线依次表现为指数期、直线期及平台期)或无ct值，阳性质控品(pc)中fam、hex通道检测均应有扩增(呈典型的s型曲线)且ct值≤28；否则认为实验无效，需重复实验。

二.实验材料和设备

1.针对突变位点设计合成特异性引物和探针

针对c-kit基因突变位点设计特异引物和探针。通过特异性引物和探针优化，以便实现高灵敏和快速检测。

优化后的引物与探针如下：

正向引物(f)：ccatgtatgaagtacagtggaagaag(seqidno：1)

反向引物(r)：aagtcactgttatgtgtacccaa(seqidno：2)

探针(pb)：catggaaagcccctgtttcatactgacc(seqidno：3)

2.检测样本处理与dna的提取

检测样本可以是新鲜病理组织、石蜡包埋组织、全血、血浆和腹腔积液。以下仅以石蜡包埋组织样本为例进行说明。

在样本采集之前，病人未经过酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitors，tkis)类药物治疗；由于dna样品质量会影响检测结果，因此应确定dna样品来源的石蜡包埋组织样本中含有癌组织细胞，并且不少于整个样本的25％；且dna样品od260/od280＝1.8±0.2，od260/od230≥1.7；浓度为5-10ng/μl。

石蜡包埋组织样本在室温下保存时限不超过12个月，提取后的dna样品在-20℃冷冻条件下保存时限不超过6个月。

3.适用仪器

stratagenemx3000p。

4.试剂盒的组成

试剂盒组成见表1。试剂盒中不含核酸提取成份，使用qiaampdnaffpetissuekit(qiagen公司生产，货号：56404)试剂盒完成石蜡包埋组织样本dna提取。检测试剂组成及c-kit基因待检突变位点见表2。ir检测试剂只含内参基因检测体系(fam通道)，c-kit检测试剂同时含有c-kit基因突变检测体系(fam通道)及内控基因检测体系(hex通道)。

表1：试剂盒组成

其中所述内参基因和内控基因的具体序列可以由本领域技术人员根据实验情况容易地确定或者由北京雅康博生物科技有限公司提供。

三.检测方法

1.使用qiaampdnaffpetissuekit(qiagen公司生产)试剂盒，按照使用说明书进行石蜡包埋组织样本dna提取。

2.取试剂盒中的检测试剂以及阳性质控品(pc)。待检测试剂及阳性质控品pc融化后短暂离心，置于冰上。

3.按17∶0.3的体积比例混合ir检测试剂和taqdna聚合酶，按17∶0.3的体积比例混合c-kit检测试剂和taqdna聚合酶。按17.3/孔分装ir检测试剂和c-kit检测试剂至八连管中。向装有ir检测试剂和c-kit检测试剂的八连管中分别加入2.7μl待检dna样品、阴性质控品(nc，溶解dna的缓冲液，由使用者自备)及阳性质控品pc，吹打混匀，盖紧管盖后短暂离心。注意：混匀时不要使用漩涡振荡仪；混匀后立即进行后续操作。

4.荧光pcr仪检测通道设定需同时选择fam、hex通道(参比染料设置为“无”)。反应程序设置如下(表2)：

表2：

四.检测结果的解释

1.ct值确定：首先设定stratagenemx3000p荧光pcr仪的基线：选择“适合基线(adaptivebaseline)”设定时的荧光信号，阈值(threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性质控品nc扩增曲线(无规则的噪音线)的最高点，即令阴性质控品nc扩增曲线显示“noct”为准。从软件中读取各样本在各位点检测的ct值。

2.定性分析：

(1)实验质量评判：若nc中fam、hex通道检测均无扩增(不呈典型的s型曲线。注：典型的s型曲线依次表现为指数期、直线期及平台期)或无ct值，pc中fam、hex通道检测均有扩增(呈典型的s型曲线)且ct值≤28，则可继续分析；否则认为实验无效，需重复实验。

(2)待检dna样品中内参基因(ir)检测情况评判：若内参基因检测(fam通道)有扩增且19≤ct值≤25，则可继续分析；若其ct值较小，则认为dna样品浓度过高；若其ct值较大或无扩增，则认为dna样品浓度过低、发生降解，或其中可能含有pcr抑制剂。

(3)待检dna样品中内控基因检测情况评判：若内控基因检测(hex通道)有扩增且ct值≤25，则可继续分析；若内控基因检测(hex通道)ct值较大或无扩增，但突变位点检测(fam通道)有扩增且ct值≤38，则可继续分析(可能由于突变位点扩增对内控基因扩增产生抑制)；若内控基因检测(hex通道)ct值较大或无扩增，而突变位点检测(fam通道)无扩增或有扩增但ct值＞38，则无法继续分析，需重复实验(可能由于dna样品发生降解、其中含有pcr抑制剂或未加样品)。

(4)待检dna样品中基因突变情况评判：若样品中某突变位点检测(fam通道)有扩增且ct值≤38，则判定该样本突变结果为阳性；若ct值＞38或无扩增，则判定该样本突变结果为阴性。

注意：同一dna样品中可能同时存在多种突变。

图1为检测结果为阴性的样本(野生型样本)的pcr图，图2为检测结果为阳性的样本(突变型样本)的pcr图。

通过对比检测，证实本发明的荧光pcr方法和传统测序方法的结果是相符的，而本发明的荧光pcr方法的灵敏度和选择性高于传统测序方法。

因此，本发明荧光pcr反应体系可检测c-kit基因1675-1681位替换为a突变，检测方便快捷，准确性高，可满足c-kit基因突变快速检测的要求。