一种调控玉米干旱应激抗性的基因及其应用的制作方法

本发明涉及植物基因工程技术领域，具体而言，涉及一种调控玉米干旱应激抗性的基因及其应用。

背景技术：

玉米是重要的粮食作物之一，在我国，玉米的种植面积已经超过了水稻，跃居第一大作物。玉米(Zea may L.)同株异花，属于异花授粉的一年生禾本科植物。在分类学上属于禾本科(Graminease)玉蜀黍族(Maydeae)玉蜀黍属(Zea L.)，起源于中美洲，16世纪初期传入到中国。玉米不仅仅是重要的粮食作物，而且也是重要的饲料和工业原料，最近几年作为能源作物受到了很大的青睐。自然环境的改变严重影响玉米产量的提升，干旱是影响植物生长发育及其作物产量的主要逆境因素之一，每年都会导致作物减产带来巨大的经济损失。我国是一个干旱和半干旱面积很大的国家，干旱半干旱地区占全国土地面积50％左右。深入研究玉米抗旱遗传与分子机制、发掘抗旱新基因，是进一步提高玉米产量、保障国家粮食安全的迫切需要。

近年来的研究表明，控制ABA信号传导是玉米应对干旱胁迫的重要机制之一，其中PYR/PYL/RCAR蛋白、A簇PP2C磷酸酶(PP2CA)和3型SnRK2激酶组成ABA受体或其它蛋白复合物介导ABA信号的早期传导，但其相关编码基因的自然变异及其抗旱作用机理至今仍鲜为人知。另外，已鉴定的玉米抗旱基因主要基于转基因过表达或缺失突变体，但在生产上还难以利用。

有鉴于此，特提出本发明。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种具有调控玉米抗旱功能的基因，以解决上述问题。

为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

一种调控玉米干旱应激抗性的基因，所述基因为ZmPP2CA10的缺失突变基因，所缺失的片段为距ZmPP2CA10起始密码子ATG上游301bp的连续碱基序列；所述连续碱基序列如SEQ ID NO:1所示；

突变后的ZmPP2CA10的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

所缺失的片段位于ZmPP2CA10起始密码子上游5’UTR启动子区域的启动子区域。

蛋白磷酸酶类型2C(PP2C)家族的很多成员已经被广泛报道，它们参与了包括干旱反应在内的逆境胁迫过程。申请人在之前的研究中使用来自热带和温带的368个品种的玉米组成一个多样的玉米群体并找到了一个候选基因ZmPP2CA10(Genome-Wide Analysis of ZmDREB Genes and Their Association with Natural Variation in Drought Tolerance at Seedling Stage of Zea mays L；PLoS Genet，2013-9-26，Liu S et al)。

而在本申请中，通过对玉米的自然变异群体抗旱能力的分析，申请人发现了一个缺失突变基因，其缺失的片段位于ZmPP2CA10基因启动子上，该基因所缺失的片段是一个参与内质网胁迫信号通路的保守元件，通过影响ZmPP2CA10的表达而调控玉米的抗旱能力。

如上所述的缺失突变基因在玉米抗旱性相关分子标记辅助育种中的应用。

ZmPP2CA10基因位于玉米基因组第6号染色体上，其基因ID为GRMZM2G177386；因此该缺失突变基因也位于相同位置，可作为分子标记应用于辅助育种中。

如上所述的缺失突变基因在玉米抗旱性辅助鉴定中的应用。

由于ZmPP2CA10在玉米中是一个对玉米抗旱能力具有负向调控功能的基因，而申请人发现，该缺失突变基因可以显著增加玉米的耐旱能力，这说明内质网胁迫信号通路与干旱应激之间存在着密切的关联。且本领域技术人员可根据该研究将ZmPP2CA10基因及所述缺失突变基因应用于抗旱性相关分子标记辅助育种及玉米抗旱性辅助鉴定领域。

以下为方便描述，以下在本申请中，将所述缺失突变基因命名为A10pΔERSE基因。

一种辅助鉴定玉米抗旱性的方法，包括如下步骤：

在如上所述的连续碱基序列的上游和下游分别设计上游引物及下游引物；

用所述上游引物和所述下游引物对待测玉米样品的基因组DNA、所述缺失突变基因纯合子的阳性对照DNA以及ZmPP2CA10基因纯合子的阴性对照DNA同时进行电泳鉴定；根据待测样扩增产物与阳性对照及阴性对照的扩增产物的分子量辅助判断待测玉米样品的抗旱能力。

从本申请的一个实施例中可知，A10pΔERSE基因可显著增强增加玉米的抗旱能力，因此可用该基因的存在与否对玉米抗旱性进行辅助鉴定。

上述辅助鉴定玉米抗旱性的方法的判断方式为：

若待测样扩增产物与阳性对照DNA的分子量一致，而比阴性对照DNA的分子量小，则说明待测样本为A10pΔERSE基因纯合子，具有较强的抗旱能力；

若待测样扩增产物与阴性对照DNA的分子量一致，而比阳性对照DNA的分子量大，则说明待测样本为ZmPP2CA10基因纯合子，具有较弱的抗旱能力；

若待测样扩增产物出现两条带，分别与阴性对照DNA及阳性对照DNA的分子量一致，则说明待测样本为ZmPP2CA10基因/A10ΔERSE基因杂合子，具有较弱的抗旱能力。

需要作出说明的是，本领域技术人员有能力根据本发明说明书公开文本中的内容判断A10pΔERSE基因及ZmPP2CA10基因对玉米抗旱能力强弱的影响，因此该判断方法并不仅限于PCR方法，还包括其他的针对这两个基因的各调控阶段，如DNA水平的检测、mRNA表达水平的检测以及蛋白表达水平等的任何检测方法。

优选的，如上所述的辅助鉴定玉米抗旱性的方法，所述上游引物和下游引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示。

由于A10pΔERSE基因实质上是ZmPP2CA10缺失了SEQ ID NO:2所示基因片段，因此所采用的引物可为改缺失片段的任何引物对，优选为SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物对。

优选的，如上所述的辅助鉴定玉米抗旱性的方法，在其扩增的反应体系中，上游引物和下游引物的浓度为8～12μM，DNA模板的浓度≥80ng/μl。

更优选的，上游引物和下游引物的浓度为10μM，DNA模板的浓度为100ng/μl。

优选的，如上所述的辅助鉴定玉米抗旱性的方法，在所述扩增的反应程序中，Tm值为55～59℃，反应循环次数为30～40次；

更优选的，反应程序为：

更优选的，Tm值为57℃，反应循环次数为35次。

通常PCR扩增时的退火温度为40℃～60℃。退火温度是由引物的Tm值来决定的，在Tm值允许范围内，选择较高的退火温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。本发明所采用的引物退火温度为56℃，具有较高的特异性。

随着反应的进行，酶会逐渐失活、dNTPs等原料会逐渐消耗掉，此外有一些非特异产物的扩增也会相应增加。因此虽然随着反应循环数的增加，产物会增多，但循环次数依然不宜过多，因而本发明限定为38～42个循环。

优选的，如上所述的辅助鉴定玉米抗旱性的方法，在所述电泳鉴定时，所用的凝胶为3％～4％的琼脂糖凝胶；

更优选的，电泳条件为恒压110～130V，电流140～150mA跑45～75min

如上所述的辅助鉴定玉米抗旱性的方法在检测ZmPP2CA10基因ERSE反应元件缺失突变中的应用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中ZmPP2CA10玉米超表达转基因材料干旱表型；A：转基因材料ZmPP2CA10蛋白表达情况，CO1为转基因的转化背景材料；B：ZmPP2CA10玉米转基因材料家系6和家系12叶片离体脱水实验；C：对ZmPP2CA10玉米转基因材料家系6和家系12苗期材料做干旱处理2周并复水材料生长情况；

图2为本发明实施例2中ZmPP2CA10遗传变异与玉米不同自交系干旱处理后存活率数据做关联分析；A：ZmPP2CA10整个基因组序列中的SNP/InDels位点与不同自交系干旱处理后存活率的关联分析，发现InDel-338显著与干旱相关；代表非编码区，代表外显子，代表内含子和启动子区域；B：InDel-308与InDel-338连锁不平衡：C:抗旱材料和对干旱敏感材料中ZmPP2CA10序列的-338位点和-754位点的序列比对；ERSE(ER Stress Response element):内质网胁迫响应元件；AREB(ABA Response element):脱落酸响应元件；

图3为本发明实施例2中对玉米苗期材料干旱处理检测InDel-338与ZmPP2CA10表达量的关系；A-C：抗旱材料和敏感材料在苗期正常生长条件下ZmPP2CA10表达量(A)，ZmPP2CA10干旱处理后表达量(B)和干旱处理后表达量增长倍数(C)；+代表在ZmPP2CA10的InDel-338位点存在ERSE位点，-代表在ZmPP2CA10的InDel-338位点不存在ERSE位点；D-F：玉米自交系ZHENG653(653)，CIMBL17(17)，CIMBL70(70)干旱处理后存活率(D)以及两个F2分离群体CIMBL17 X ZHENG653(17 X 653)，CIMBL70 X ZHENG653(70 X 653)干旱处理后存活率(E,F)；+/+，-/-，+/-分别代表纯合敏感基因型，纯合耐旱基因型，杂合子基因型；

图4为本发明实施例3中荧光素酶活性实验；ZmPP2CA10启动子区域的ERSE元件特异性对内质网胁迫信号途径有响应(TM依霉素：特异性激活内质网胁迫信号途径)，并且不参与脱落酸信号通路(ABA脱落酸：特异性激活脱落酸信号通路)；EV代表空载，A10p代表ZmPP2CA10启动子；

图5为本发明实施例4中的代表性电泳结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1 过表达ZmPP2CA10减弱玉米干旱耐受能力

ZmPP2CA10基因的CDS全长以玉米B73参考序列为模板设计引物，同时在引物两端加上部分载体序列，以B73叶片cDNA为模板在体外克隆获得片段，通过同源重组的方法连接到超表达载体pZZ0153-3HA上，并测序验证获得正确的克隆。将该超表达载体质粒送到中国种子集团有限公司(武汉)获得该基因的转基因植株。通过除草剂筛选申请人获得了两个纯合的超表达ZmPP2CA10玉米转基因材料家系6和12。

提取转基因材料家系6和家系12，及野生型C01材料的RNA，做反转录，通过荧光定量PCR检测目标基因是否在转录水平超表达。实验结果显示在转基因材料家系6和家系12中A10的表达量高于野生型C01，说明转基因材料在转录水平确实超表达了(图1A)。

提取ZmPP2CA10玉米转基因材料家系6和家系12及野生型C01材料叶片的总蛋白，通过蛋白质免疫印迹技术，用3HA抗体杂交检测转基因材料中目标基因A10是否超表达。实验结果表明在转基因材料中目标基因确实在蛋白水平超表达(图1B)。

在玉米长到三叶一心心时，分别取家系6，家系12和野生型C01的第三片叶子，在离体情况下在不同时间点称叶片重量，最后统计每个时间点叶片的失水率。实验结果显示转基因材料相对于野生型C01材料在相同实验内失水更快，说明转基因材料相比与野生型失水更快(图1C)。

将转基因材料和野生型材料在同一个盆子里对半种植，当长到三叶一心心时开始将水浇透，此后不再浇水做干旱处理，干旱处理20天后，对材料复水并浇透，观察不同材料生长情况。实验结果显示转基因材料萎焉程度明显强于野生型材料C01，说明转基因材料相比于野生型对干旱更敏感，A10在植物对干旱的响应中做负调控因子(图1D)。

实施例2 鉴定ZmPP2CA10与耐旱相关的偏好等位基因

为了进一步确认ZmPP2CA10的基因突变细节，申请人从玉米不同自交系材料中随机选择100份材料对ZmPP2CA10基因进行重测序。以这100份材料的基因组DNA为模板，以B73参考基因组序列为准设计引物扩增，分别测了ZmPP2CA10启动子区和基因区(包括外显子和内含子)。

将每个材料的ZmPP2CA10序列进行多序列比对，将其中所有的SNP/InDel位点与关联群体存活率数据(数据来源于前期别人发表的文章)做候选基因关联分析，发现一个位点InDel-338与干旱显著相关(图2A)。

在InDel-338位点附近有一个InDel-308位点，通过连锁不平衡发现InDel-308位点与InDel-338位点不连锁，即InDel-338位点是单独影响植物抗旱的，而不是与InDel-308共同影响抗旱(图2B)。

抗旱材料和敏感材料中ZmPP2CA10的-338位点基因型。ERSE(ER Stress Response element):内质网胁迫响应元件。AREB(ABA Response element):脱落酸响应元件(图2C)。其中，CIMBL55、CIMBL70、ZHENG653等分别代表不同的玉米自交系。

为了了解ZmPP2CA10的表达水平是如何对玉米的抗旱能力造成影响的，申请人从敏感材料和抗旱材料中分别选择18份和22份材料用于干旱处理。敏感材料在ZmPP2CA10的InDel-338位点基因型为有ERSE位点插入(+/+)。抗旱材料ZmPP2CA10的InDel-338位点缺失ERSE元件(-/-)。将这些材料播种于沙土中，正常浇水当生长到三叶一心时取样，并且将植物根上沙用清水洗干净，将整颗植株暴露于空气中做干旱处理，处理三小时后取样。分别抽提正常生长条件下样品和干旱处理后样品的RNA，反转录，做荧光定量PCR检测ZmPP2CA10在敏感材料和抗旱材料中干旱处理前后表达量变化情况。

从图3可知：在正常生长条件下，敏感材料和抗旱材料中ZmPP2CA10表达量无明显差异(图3A)；干旱处理后，敏感材料中ZmPP2CA10表达量高于抗旱材料中ZmPP2CA10的表达量(图3B)；干旱处理后，敏感材料中ZmPP2CA10表达量增长倍数显著高于抗旱材料中ZmPP2CA10表达量增加倍数(图3C)。以上实验结果说明，ERSE元件在植物收到干旱胁迫时能增强ZmPP2CA10的表达。

接下来，申请人选择抗旱材料CIMBL17和CIMBL70与对干旱敏感材料ZHENG653杂交，构建F2分离群体。将这两个F2分离群体种子播到土里，当长到一叶一心时开始做干旱处理，同时将每个单株取样做基因型鉴定，当植物叶片泛白时进行复水处理并统计存活率。

对ZHENG653，CIMBL17，CIMBL70材料做干旱处理，并统计存活率，发现ZHENG653对干旱敏感，CIMBL17，CIMBL70相对耐旱，则选择这三个亲本构建F2分离群体(图3D)；CIMBL17 X ZHENG653分离群体中基因型为InDel-338 ERSE-/-，InDel-338ERSE+/-的材料存活率明显高于InDel-338ERSE+/+，说明ZmPP2CA10在InDel-338位点缺失ERSE是一个优良等位基因，能增强玉米苗期抗旱能力(图3E)；CIMBL70 X ZHENG653分离群体中基因型为InDel-338 ERSE-/-，InDel-338 ERSE+/-的材料存活率明显高于InDel-338ERSE+/+，说明ZmPP2CA10在InDel-338位点缺失ERSE是一个优良等位基因，能增强玉米苗期抗旱能力(图3F)。

实施例3 荧光素酶实验验证启动子区域的ERSE元件是内质网胁迫信号激活ZmPP2CA10所必须的，但不影响ABA通路对ZmPP2CA10的激活

克隆CIMBL55材料中ZmPP2CA10基因ATG上游1000bp启动子片段，这个材料ZmPP2CA10的InDel-338位点缺失ERSE元件，这个片段命名为A10pΔERSE，缺失部分的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，突变后的ZmPP2CA10的启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。对A10pΔERSE做点突变，将InDel-338位点突变为含有ERSE元件，命名为A10pERSE。将这两个片段通过酶切连接，连接到pGL-Basic-LUC载体上，构建pGL-Basic-A10pΔERSE-LUC，pGL-Basic-A10pERSE-LUC。将这两种质粒分别转入玉米原生质体中培养过夜，第二天检测报告基因荧光素酶酶活。

在过夜培养细胞时，对细胞做衣霉素(TM)处理，TM能特异性激活内质网胁迫信号通路。实验结果表明在TM处理时，转有pGL-Basic-A10pERSE-LUC质粒的细胞中荧光素酶活性明显高于转有pGL-Basic-A10pΔERSE-LUC质粒的细胞酶活活性，说明ERSE元件能响应内质网胁迫信号途径，并能增强ZmPP2CA10启动子的转录活性(图4A)。

在过夜培养细胞时，对细胞做脱落酸(ABA)处理，ABA能特异性激活脱落酸信号通路。实验结果表明在ABA处理时，转有pGL-Basic-A10pERSE-LUC质粒的细胞中荧光素酶活性于转有pGL-Basic-A10pΔERSE-LUC质粒的细胞的荧光素酶活性无明显差异，说明ERSE元件不能响应ABA信号通路，只能特异性响应内质网胁迫信号通路(图4B)。

实施例4 A10pΔERSE片段在抗旱表型鉴定中的应用

实施例1～3已经证明了A10pΔERSE片段可以显著增加玉米的耐旱能力，本实施例中提供了A10pΔERSE片段的应用。

采集抗旱型玉米品系60份、敏感型玉米品系50份植物的嫩叶片，提取植株基因组DNA；对110份DNA样本进行扩增。

其中，抗旱型玉米品系选自：CIMBL55、CIMBL54、CIMBL17、CIMBL22、CIMBL115以及CIMBL91各10株；

敏感型玉米品系选自：CIMBL140、CIMBL121、CIMBL119、ZHENG653 X CIMBL17杂交F1代以及ZHENG653X CIMBL70F1代各10株；

阳性对照选自CIMBL70的基因组DNA(ERSE-/-)，阴性对照选自ZHENG653的基因组DNA(ERSE+/+)。

以15μl反应体系计，所述扩增的反应体系包括：

所用上游引物的序列如SEQ ID NO:3所示，所用下游引物的序列如SEQ ID NO:4所示。

PCR扩增程序为：

图5显示了实验结果中其中一块胶的电泳图：

其中，7泳道和8泳道分别为阳性对照和阴性对照；

1、5、10、13、14、17、20泳道对应的样品分别为：CIMBL55、CIMBL54、CIMBL17、CIMBL22、CIMBL54、CIMBL115以及CIMBL91；

2、9、11、24泳道对应的样品均来自ZHENG653 X CIMBL70F1代；

4、6、12、16泳道对应的样品均来自ZHENG653 X CIMBL17杂交F1；

3、15、18、19、21、22、23泳道对应的样品分别为：CIMBL140、CIMBL121、CIMBL119、CIMBL121、CIMBL140、CIMBL121、CIMBL119样本。

这些结果与申请人在实施例1～3研究得到的结果一致。即CIMBL55、CIMBL54、CIMBL17、CIMBL115以及CIMBL91均为ERSE-/-纯合子；ZHENG653 X CIMBL17杂交F1代以及ZHENG653 X CIMBL70F1代均为ERSE+/-杂合子；CIMBL140、CIMBL121、CIMBL119均为ERSE+/+纯合子。实际扩增时，抗旱表型仅有两个样本没有扩增出来条带，敏感表型仅有一个样本没有扩增出条带，其余样本的基因型均与其表型及存活率结果相一致。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。