一种iaaM基因表达载体及根系特异表达iaaM培育抗旱玉米的方法与流程

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及一种iaaM基因表达载体及通过在根系特异表达iaaM基因培育抗旱玉米的方法。

背景技术：

根系对植物的生长发育起着至关重要的作用，主要体现在从土壤中吸取水分和矿物元素，对植株起到固定支撑作用以及与其周围的多种微生物形成共生关系以提高植物的养分利用效率和抗逆性。在进化过程中，根系从根状茎等非常简单的结构逐渐进化成具有复杂结构的专门器官，这也体现了根系对植物的重要性。在某些情况下，对根系结构起调控作用的基因也能提高作物对氮、磷和水分的利用效率，从而增加产量，表明根系性状对增产的重要性。当较深层土壤中有可利用的水分时，根长得更长、扎得更深便是提升水分获取的一条有效途径。因此，植物根系的生长发育状况与抗旱性密切相关，总的来说，根系越发达、根冠比越大的植株的抗旱性能越强。

植物激素是一类对根系结构起到主要调控作用的内源性因素，它们与环境刺激因素(比如水分、营养元素等的丰度)相结合来调节根的发育。其中，生长素和细胞分裂素是已知的参与根系发育调控的最主要的两种植物激素。在组培中，细胞分裂素与生长素的比值高低影响着植物器官的分化：通常比值高时，有利于芽的分化；比值低时，利于根的分化。在植物生长发育中，生长素对根分枝及不定根形成起正调控作用，当其含量升到一定浓度后会促进根的生长和分支。

植物干旱应答的基因超过1000多个，选择哪类或哪个基因进行作物的抗旱改良一直是困扰科学界的一个难题，因此选择可以促进玉米根系生长发育，从而提高玉米的抗旱性，而又不影响正常有水分条件下玉米的产量的基因，并且控制该基因的特异性表达也是当前需要解决的重要课题之一。现有技术通常使用转录因子基因转化玉米，以获得抗旱转基因玉米。但是转录因子基因存在一定的缺陷，在增强抗旱的同时，往往带来较大的“副作用”，如导致植株变矮小。

技术实现要素：

本发明的目的在于通过根系特异启动子驱动生长素合成酶关键基因iaaM， 通过促进根系发育，促进玉米吸收土壤深层的水分，达到“根深叶茂”的目标。本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种iaaM基因表达载体，所述载体包括SEQ ID NO.1所示的启动子EXP18-D和SEQ ID NO.3所示iaaM基因。

进一步的，利用PGM-35Sbar通用载体，启动子EXP18D在HindIII/SpeI位点替代UBQI启动子，筛选如SEQ ID NO.2所示的标记基因CP4EPSP在载体SmaI/SacI之间替代标记Bar基因，目的基因iaaM位于SpeI/NotI酶切位点之间。

进一步的，所述载体的构建方法包括以下步骤：

1)PCR扩增水稻启动子EXP18D，将启动子EXP18D克隆至载体pMD18-T，得载体pMD18-T：EXP18D；

2)从农杆菌中克隆生长素合成酶关键基因iaaM，将iaaM克隆至载体pMD18-T，得载体pMD18-T：iaaM；

3)取表达载体pGreen029，限制性内切酶Hind III和Spe I酶切载体pGreen029，用同样的限制性内切酶Hind III和Spe I酶切载体pMD18-T：EXP18D，得到含Hind III和Spe I酶切位点的EXP18D片段；用T4DNA连接酶将表达载体pGreen029的酶切产物与EXP18D片段连接，得载体pGreen029：EXP18D；

4)取载体pGreen029：EXP18D，限制性内切酶Not I和Spe I酶切载体pGreen029：EXP18D，用同样的限制性内切酶Not I和Spe I酶切载体pMD18-T：iaaM，得到含Not I和Spe I酶切位点的iaaM片段；用T4 DNA连接酶将表达载体pGreen029：EXP18D的酶切产物与iaaM片段连接，得载体pGreen029：EXP18D：iaaM。

一种iaaM基因表达载体的应用，所述载体包括SEQ ID NO.1所示的启动子EXP18-D和SEQ ID NO.3所示iaaM基因，通过根系特异启动子EXP18-D，驱动生长素合成关键酶基因iaaM在玉米根系中特异性表达，促进根系生长发育，提高玉米的抗旱性。

一种通过在根系特异表达iaaM基因培育抗旱玉米的方法，包括以下步骤：

1)构建iaaM基因表达载体，所述载体包括SEQ ID NO.1所示的启动子EXP18-D和SEQ ID NO.3所示iaaM基因；

2)酶切反应验证目的基因iaaM；

3)采用PCR从质粒上扩增的方法制备线性DNA；

4)将线性DNA通过花粉管通道法转化入玉米自交系C92的基因组中；

5)转基因后代的检测。

本发明的有益效果：

本发明采用来自单子叶植物水稻的根特异启动子EXP18-D来驱动生长素合成关键酶基因iaaM表达在玉米自交系中，促进了根系生长发育，增加在干旱条件下植株对深层土壤水分吸收，提高了转基因玉米的抗旱性，该方法对转基因玉米在正常有水分条件下的生长发育没有负面效应，就是说在干旱条件下能够提高转基因玉米产量，而水分充足条件下转基因玉米产量不减产，甚至还能增产，因为玉米根系发达能够增加各种营养离子的吸收。

下面结合附图及具体实施方式对本发明作进一步详细说明。

附图说明

图1为载体pGreen029：EXP18D构建示意图；

图2为载体pGreen029：EXP18D：iaaM构建示意图；

图3为线性DNA片段pGreen029：EXP18D：iaaM示意图；

图4为构建目的载体用内切酶SpeI/NotI酶切验证图片；

图5为转基因株系目的基因iaaM的PCR扩增结果；

图6为抗性植株标记基因35S-EPSP基因的PCR检测结构；

图7为抗旱鉴定株系对照图片；

图8为抗旱鉴定植株根系对照图片；

图9为植株根长对照图片；

图10为植株穗粒数和穗粒重对照图片。

附图标记：

图5中：M.DNA标准分子量；1：质粒，2：空白对照，3：非转基因植株，4-7为转基因植株：4：株系KHC92-1-5，5：株系KHC92-1-9，6：株系KHC92-1-12，7：株系KHC92-1-20。

图6中：注：M:DL2000marker；1:空白对照；2：未转化植株；3-6：转基因植株:株系KHC92-1-5，KHC92-1-9，KHC92-1-12，KHC92-1-20。

具体实施方式

实施例1

一种iaaM基因表达载体，所述载体包括SEQ ID NO.1所示的启动子EXP18-D和SEQ ID NO.3所示iaaM基因。

利用实验室已构建PGM-35Sbar通用载体(王霄汉等安徽农业科学2012,40:12367-12370)，水稻根特异启动子EXP18D在HindIII/SpeI位点替代UBQI启动子，筛选如SEQ ID NO.2所示的标记基因CP4EPSP在载体SmaI/SacI之间替代标记Bar基因，目的基因iaaM位于SpeI/NotI酶切位点之间，载体经测序验证正确。

所述载体的构建方法包括以下步骤：

1)PCR扩增水稻启动子EXP18D，将启动子EXP18D克隆至载体pMD18-T，得载体pMD18-T：EXP18D；

2)从农杆菌中克隆生长素合成酶关键基因iaaM，将iaaM克隆至载体pMD18-T，得载体pMD18-T：iaaM；

3)取表达载体pGreen029，限制性内切酶Hind III和Spe I酶切载体pGreen029，用同样的限制性内切酶Hind III和Spe I酶切载体pMD18-T：EXP18D，得到含Hind III和Spe I酶切位点的EXP18D片段；用T4DNA连接酶将表达载体pGreen029的酶切产物与EXP18D片段连接，得载体pGreen029：EXP18D，如图1所示；

4)取载体pGreen029：EXP18D，限制性内切酶Not I和Spe I酶切载体pGreen029：EXP18D，用同样的限制性内切酶Not I和Spe I酶切载体pMD18-T：iaaM，得到含Not I和Spe I酶切位点的iaaM片段；用T4DNA连接酶将表达载体pGreen029：EXP18D的酶切产物与iaaM片段连接，得载体pGreen029：EXP18D：iaaM，如图2所示；

最终获得的用于转化玉米的线性DNA片段pGreen029：EXP18D：iaaM如图3所示。

实施例2

一种通过在根系特异表达iaaM基因培育抗旱玉米的方法：

iaaM基因来源：根据农杆菌基因BAA76346.1(NCBI序列号)cDNA序列由上海生工生物有限公司合成。

1、载体构建：

利用实验室已构建PGM-35Sbar通用载体(王霄汉等安徽农业科学2012，40：12367-12370)，水稻根特异启动子EXP18D在HindIII/SpeI位点替代UBQI启动子，筛选如SEQ ID NO.2所示的标记基因CP4EPSP在载体SmaI/SacI之间替代标记Bar基因，目的基因iaaM位于SpeI/NotI酶切位点之间，载体经测序验证正确。

构建步骤：

1)PCR扩增水稻启动子EXP18D，将启动子EXP18D克隆至载体pMD18-T，得载体pMD18-T：EXP18D；

2)从农杆菌中克隆生长素合成酶关键基因iaaM，将iaaM克隆至载体pMD18-T，得载体pMD18-T：iaaM；

3)取表达载体pGreen029，限制性内切酶Hind III和Spe I酶切载体pGreen029，用同样的限制性内切酶Hind III和Spe I酶切载体pMD18-T：EXP18D，得到含Hind III和Spe I酶切位点的EXP18D片段；用T4DNA连接酶将表达载体pGreen029的酶切产物与EXP18D片段连接，得载体pGreen029：EXP18D，如图1所示；

4)取载体pGreen029：EXP18D，限制性内切酶Not I和Spe I酶切载体pGreen029：EXP18D，用同样的限制性内切酶Not I和Spe I酶切载体pMD18-T：iaaM，得到含Not I和Spe I酶切位点的iaaM片段；用T4DNA连接酶将表达载体pGreen029：EXP18D的酶切产物与iaaM片段连接，得载体pGreen029：EXP18D：iaaM，如图2所示；

最终获得的用于转化玉米的线性DNA片段pGreen029：EXP18D：iaaM如图3所示。

2、酶切反应验证目的基因iaaM

将提取到的植物表达载体用内切酶SpeI/NotI进行酶切反应，得到酶切产物；再将酶切产物进行1.5％琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图4所示，泳道1-4中为酶切产物，条带由上至下分别为10.5kb左右的大片段和2.2kb左右的小片段，可以证明该植物表达载体构建正确，并进行测序验证无误。

3、采用PCR从质粒上扩增的方法制备线性DNA(包括目的基因和除草剂筛选基因的完整表达盒)

扩增引物为：

LacZ-F1:GTAATACGACTCACTATAGGGCGAATTGGGT

RB-R:GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCA

PCR反应程序如下：

PCR反应体系：

4、将线性DNA通过花粉管通道法转化入玉米自交系C92的基因组中，

包括如下步骤：

1)在玉米开花期时，选择发育正常的植株进行套袋授粉处理；

2)在所述的授粉处理后20h左右，对玉米植株的花穗进行修剪处理； 先将玉米植株的雌穗上的纸袋摘下，用剪刀剪去大约距离穗轴顶端1～2cm的花丝和苞叶，保持花丝切面平齐，并使苞叶内的花丝略高于苞叶；

3)然后用一次性针管在上述修剪处理形成的切口处滴注200μl浓度为30ng/μl的植物表达载体的溶液(用无菌ddH₂O配制)和筛选表达盒的线性DNA。

5、转基因后代的检测：

1)除草剂筛选：

待转化后玉米果穗成熟时，将其收获晒干脱粒，得到转化种子；该转化种子播种后，在苗期3-5叶期喷洒200mg/L农达草甘膦除草剂，获得抗性植株用于分子检测。转基因株系自交扩繁到T3代获得纯合株系。

2)分子检测：

为了确定上述iaaM基因已经整合进玉米C92自交系基因组中，对上述抗性植株进行PCR检测。

根据IAAM基因的核苷酸序列设计引物，PCR扩增引物序列如下：

引物1：(上游引物)5’-TCGCGGTGTTAGGAGG-3’；

引物2：(下游引物)5’-TAGGAAATCCATATACGTC-3’

采用SDS微量法提取玉米叶片的DNA，然后以此DNA为模板，在引物1和引物2的引导下，用PTC-100PCR扩增仪(M.J.Research公司)扩增IAAM基因片段，50μl PCR反应体系为：10Xbuffer 5μl；2mMdNTP 5μl；50μM上、下游引物各1μl，模板DNA(1μg/μl)1μl；Taq DNA聚合酶0.5μl；加水至50μl。PCR扩增条件为：先94℃5min；然后94℃1min，57℃1min，72℃2min，共30个循环；最后72℃7min。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结果如图5所示，阳性转基因植株可扩增出473bp的片段。

35S-EPSP PCR扩增引物序列如下：

35SF5’ACTATCCTTCGCAAGACCCTTCCTC 3’；

35SR 5’TCAACTGTCCAATCGTAAGCGTTCC 3’。

PCR反应条件为：94℃3min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，30个循环；72℃10min，4℃保存。扩增体系为50μl，包含：模板DNA(1μg/μl)1μl，Ex Taq Buffer 5μl，dNTPs4μl，上游引物1μl，下游引物1μl，Ex Taq聚合酶0.5μl，加水至50μl。反应结束后，对PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，检测结 果如图6所示，阳性转基因植株可扩增出340bp的片段。

以35S-EPSP基因引物进行PCR检测，扩增结果如图6，转基因阳性植株可以获得目的条带，而未转化植株未扩增到目的条带。

3)抗旱鉴定：

A.对照和转基因株系在旱棚中的生长情况：对照和转基因株系材料在北京塑料旱棚中按株距40厘米行距60厘米进行播种，3叶期间苗，播种后30天内不交水，到第30天充分浇水一次之后到收获再不浇水；如图7所示为生长60天的植株，转基因植株(株系KHC92-1-9)抗旱性比对照显著提高。

B、对照和转基因株系的根长的比较：在普通日光温室中采用盆栽试验，在每个直径20厘米高40厘米的花盆填充营养土中播种10粒对照或转基因玉米的饱满种子，每个转基因材料或对照5个重复，充分浇水等种子出苗后长到3叶期进行间苗，每个花盆中留下3株长势一致的幼苗，每3天浇水1次，保证花盆中有充足水分供应，等幼苗长到5叶期时，用水小心冲走营养土，留下玉米植株完整根系进行拍照，并对每个植株整个根系的每个侧根进行长度测量，所有侧根的长度之和作为玉米单株的总根长(图8)。

C.在普通日光温室中采用盆栽试验，在每个直径20厘米高40厘米的花盆填充营养土中播种10粒对照或转基因玉米的饱满种子，每个转基因材料或对照5个重复，充分浇水等种子出苗后长到3叶期进行间苗，每个花盆中留下3株长势一致的幼苗，每3天浇水1次，保证花盆中有充足水分供应，等幼苗长到5叶期时，用水小心冲走营养土，留下玉米植株完整根系进行拍照，并对每个植株整个根系的每个侧根进行长度测量，所有侧根的长度之和作为玉米单株的总根长，重复3次以上试验，对取得数据进行统计分析，转基因株系比对照根长有显著性增加(图9)。*表示转基因材料与对照相比有显著差异，**表示转基因材料与对照相比有极显著差异。

D.转基因株系自交扩繁到T4代获得纯合株系，在海南冬季11月5日播种，种前土壤充分浇水，然后整个玉米生长季不再浇水，按每个材料15株，株距30厘米行距60厘米，并进行自然授粉，130天后统计每个材料平均单穗的结实率和千粒重，转基因株系比对照在穗粒数和千粒重都有显著性增加(图10)。左边CK为对照，右边为转基因株系。