本发明属于基因工程领域，其涉及利用crispr-cas9系统对细胞，尤其是t细胞进行基因编辑的方法，具体为利用crispr-cas9特异性敲除人t细胞中的tim-3基因的方法。
背景技术：
：免疫检查点是一系列的免疫抑制分子。正常情况下，免疫检查点对于维持自身免疫耐受、避免免疫系统在对抗病原性感染时对自身器官的攻击起到重要作用，而多种癌症正是通过免疫检查点蛋白表达失调来实现免疫逃避的。通过阻断免疫检查点，恢复机体自身抗肿瘤免疫应答，借助机体免疫功能来清除体内癌细胞一直是肿瘤学家和肿瘤患者的梦想。目前，在癌症免疫治疗中最重要、研究最多的两个免疫检查点分子是t淋巴细胞抗原-4(cytotoxict-lymphocyteantigen-4，ctla-4)和程序性死亡-1(programmeddeath-1，pd-1)。lag-3、tim-3、lag-3h(vista)、btla、cd160、2b4、lair1、tigit、kirs等免疫检查点也逐渐成为肿瘤免疫治疗所关注的重点对象，相继有多种针对上述靶点的抗体药物处于临床前或临床研究阶段。lag-3分子主要表达于活化的nk细胞、t淋巴细胞表面，与hla-ii高亲和力结合，参与淋巴细胞的活化。lag-3与哮喘、i型糖尿病、肿瘤、慢性病毒感染等多种疾病之间存在紧密联系。tim-3在th1，tc1，treg以及nk，树突状细胞，肥大细胞，单核巨噬细胞和淋巴管内皮细胞均组成性或诱导性表达，而这些细胞恰恰是构成肿瘤微环境的主要成分，因此该分子在肿瘤免疫中的作用备受重视。但是，利用抗体进行靶基因的治疗受到一些因素的限制：(1)抗体的作用只是暂时阻断的作用；(2)抑制性受体有多种，如何利用多种抗体同时阻断多种抑制性受体还没有对策；(3)不容易研发出有效的抗体；(4)肿瘤突变多样化，抗体的抑制作用存在局限性；(5)只针对细胞外靶点；(6)抗体药物昂贵等等。clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(crispr)/crispr-associated(cas)被称为第三代人工核酸内切酶，可用于各种复杂基因组的编辑。由于其突变效率高、靶向精准、操作简单、周期短及成本低的特点，被认为是一种具有广阔应用前景的基因组定点改造分子工具。cas9靶向切割dna是通过两种小rna-crrna(crisprrna)和tracrrna(trans-activatingcrrna)和靶序列互补识别的原理实现的。现在已经把两种小rna融合成一条rna链，简称sgrna(singleguiderna)。因此，sgrna能否做到特异性、精确靶向目标基因是crispr-cas9能否特异性敲除目标基因的先决条件。因此，能够设计、制备出精确性和特异性靶向目标基因的sgrna成为crispr-cas9基因敲除的关键技术。利用crispr系统进行针对免疫检查点的基因编辑则为实现肿瘤免疫治疗提供了另外一种快速、简便、高效的可行策略。本发明的目的即在于提供精确、特异靶向lag-3、tim-3、pd-1基因的sgrna的设计筛选方法，以及根据相应方法设计获得的sgrna序列，使用上述sgrna特异性敲除t细胞中lag-3、tim-3、pd-1基因，并使用上述多基因敲除的t细胞处理肿瘤细胞，为实现肿瘤免疫治疗提供一种新的路径。参考文献：drewm.pardoll.theblockadeofimmunecheckpointsincancerimmunotherapy.naturerev.cancer，2012；12:252-264.liepingchenetal.molecularmechanismsoftcellco-stimulationandco-inhibition.naturerev.immunology，2013；13:227-242.padmaneesharmaetal.immunecheckpointtargetingincancertherapy:towardcombinationstrategieswithcurativepotential.cell，161，april9，2015.fengzetal.efficientgenomeeditinginplantsusingacrispr/cassystem.cellres.2013oct；23(10):1229-32.zetscheb，cpf1isasinglerna-guidedendonucleaseofaclass2crispr-cassystem.cell.2015oct22；163(3):759-71.技术实现要素：为解决上述问题，本发明根据一定原则设计、合成、筛选了多组利用crispr-cas9、crispr-cpf1特异性敲除人lag-3基因(seqidno.1)的靶向sgrna；构建包含cas9内切酶或者cpf1的cds序列的载体pmh001-cas9(seqidno.478)或者pmh002-cpf1(seqidno.479)；将上述sgrna分别与线性的pmh001-cas9或者pmh002-cpf1质粒连接构建为pmh001-cas9-sglag3或者pmh002-cpf1-sglag3基因编辑载体；将构建好的基因编辑载体成功转染细胞即可实现lag-3基因的敲除。本发明还设计了针对tim-3(seqidno.2)靶点的sgrna，可实现tim-3基因的敲除。本发明设计了针对pd-1(seqidno.3)的sgrna，将靶向lag-3、pd-1、tim-3基因的sgrna进行组合，分别或共同连接入载体质粒，构建为能够同时敲除多个靶基因的基因编辑系统。本发明所述基因编辑系统可使用逆转录病毒载体、慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、非病毒载体等。本发明提供了一种经过上述基因编辑系统编辑后的细胞(非人类胚胎干细胞)，尤其是人类t细胞。本发明提供了一种对人类t细胞进行免疫检查点基因编辑的方法，其中涉及对选自pd-1、lag-3和/或tim-3中一个或多个靶点的基因编辑。本发明提供了一种抑制人肿瘤细胞增殖的方法，使用免疫检查点经过基因编辑的t细胞与人肿瘤细胞共培养；所述人肿瘤选自肺癌、胃癌、肝癌和/或乳腺癌；所述肿瘤细胞可选自mhcc97h，lm3，smcc7721，hepg2，hep3b，a549,spc-a1,nci-h1650,nci-h1975，nci-h460，sk-mes-1，mkn-45，mgc-803，nci-n87，snu-5，katoiii，hgc-27，bgc-823，sgc-7901，ags，bcap-37，mcf-7或skbr3。本发明提供了一种使用多靶点基因编辑t细胞治疗肿瘤的方法，所述肿瘤选自肺癌、肝癌、胃癌等。本申请的具体技术方案如下：一、sgrna寡核苷酸的设计和选择1、靶向靶基因的sgrna的设计：所述靶基因涉及pd-1、lag-3、tim-3等。因为没有使用体外转录，只是构建普通载体的方式制作，所以如无特殊说明，文中的sgrna序列指的是sgrna对应dna序列。a.cas-sgrna的设计原则：(1)在靶基因上选择5’-n(21)gg或者5’-n(21)ag。(2)sgrna在靶基因上的靶向位点或者剪切位点位于基因的外显子。(3)sgrna在靶基因上的靶向位点或者剪切位点位于不同的各种剪切形式的共有外显子上。(4)在ucsc数据库中用blat或ncbi数据库中用blast，确定sgrna的靶序列是否唯一。b.cpf-sgrna的设计原则：(1)在靶基因上选择5’tttn(20)序列。步骤(2)-(4)同设计原则a。2、靶向靶基因的sgrna的选择：cas-sgrna和cpf-sgrna的初筛原则：(1)选择的sgrna切点保证位于基因编码区。(2)sgrna在靶基因上的靶向位点位于整个基因的前半段，尤其宜在基因的功能结构域中；(3)选择相隔一定距离(10-30bp)成对的位点。这样有利于形成特异性的片段缺失，也有利于降低脱靶效应。(4)如果基因有多种剪切形式，选择靶向不同剪切形式中的相同序列区域的sgrna。二、构建合成sgrna的寡聚核苷酸双链1、crispr/cas9sgrna寡核苷酸双链构建合成：根据选择的sgrna，在其5’端加上caccg得到正向寡核苷酸(forwardoligo)(如果序列本身在5’端已经有1个g，那么就对应的省略1个g)；根据选择的sgrna，获得其对应dna的互补链，并且在其5’端加上aaac得到反向寡核苷酸(reverseoligo)(如果正向链的5’加的是caccg，则要在反向寡核苷酸链的3’端加c)。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgrna寡聚核苷酸的forwardoligo和reverseoligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入表达载体的双链，如下：forwardoligo:5′-caccgnnnnnnnnnnnnnnnnnnreverseoligo:-------------cnnnnnnnnnnnnnnnnnncaaa-5′2、crispr/cpf1sgrna寡核苷酸双链构建合成：根据选择的sgrna，在其5’端加上agat得到正向寡核苷酸(forwardoligo)；根据选择的sgrna，获得其对应dna的互补链，并且在其5’端加上aaaa得到反向寡核苷酸(reverseoligo)。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgrna寡聚核苷酸的forwardoligo和reverseoligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入表达载体的双链，如下：forwardoligo:5′-agatnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnreverseoligo:----------------nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnaaaa-5′三、sgrna基因编辑质粒的构建1、用限制性内切酶bbsi线性化pmh001-cas9或者pmh002-cpf1质粒(质粒结构如图1、2所示)。2、将退火的sgrna寡聚核苷酸双链与线性化pmh001-cas9或者pmh002-cpf1质粒连接获得基因编辑质粒，例如，pmh001-cas9-sglag3或者pmh002-cpf1-sglag3质粒。3、转化并涂amp+平板(100μg/ml)。4、37℃摇床摇菌过夜，用快速质粒小提试剂盒(dp105)提取质粒dna。5、用通用引物hu6.f测序的方法鉴定阳性克隆。四、转染细胞获得靶基因敲除细胞1、依照lipofectaminetm2000transfectionreagent(invitrogen，11668-019)的操作手册，将分别带有对应sgrna寡聚核苷酸的基因编辑质粒(例如，pmh001-cas9-sglag3或者pmh002-cpf1-sglag3质粒(可以携带1种或者多种sgrna)转染细胞。培养一段时间后提取细胞基因组dna，pcr扩增sgrna编辑区域。2、用t7en1酶切检测和ta克隆测序确认靶基因已经被敲除。五、免疫检查点靶基因敲除t细胞的制备1、靶向敲除lag-3/tim-3/pd-1基因的重组病毒的制备2、重组慢病毒lenti-pd-1-puro的包装3、t细胞的分离纯化4、利用基因重组病毒对t细胞感染和基因编辑5、facs鉴定处理后t细胞表面免疫检查点的敲除效率。六、基因编辑t细胞与肿瘤细胞共培养进行功能验证检测lag-3/tim-3/pd-1多基因敲除的t细胞(mh-t)及感染空载体lenti-crispr/cas9-puro的t细胞(ck-t)对肝癌细胞(mhcc97h，lm3，smcc7721，hepg2，hep3b)、肺癌细胞(a549,spc-a1,nci-h1650,nci-h1975，nci-h460，sk-mes-1)、胃癌细胞(mkn-45，mgc-803，nci-n87，snu-5，katoiii，hgc-27，bgc-823，sgc-7901，ags)、乳腺癌细胞(bcap-37和mcf-7、skbr3)的体外杀伤效果，按效靶比(3-10):1、1:1或1:(3-10)分别将ck-t或mh-t与肿瘤细胞混合；各组均设3个重复，取3个重复的平均值进行分析。检测时间为共培养第18-24h。检测ifn-γ、tnf-α和il-2细胞因子的特异性释放和细胞毒性功能。采用cytotox96非放射性细胞毒性检测试剂盒(promega公司)检测肿瘤细胞裂解。本申请提供了一种利用cas9/sgrna、cpf1/sgrna快速、简便、高效、特异性敲除lag-3、tim-3，或同时敲除pd-1、lag-3和tim-3基因中多个靶基因的策略和方法，并使用经过上述基因编辑的t细胞有效的抑制了肺癌、胃癌、肝癌、乳腺癌肿瘤细胞的增殖，为肿瘤免疫治疗提供了新的路径。本发明有效地解决了利用抗体治疗存在的问题，存在以下优势：1)直接敲除靶基因，可以实现永久抑制效果；2)既可以针对靶基因上的多个编码序列进行同时敲除，也可以同时针对多个靶基因进行敲除；3)提供了高效的sgrna或sgrna的组合；4)sgrna人工合成，能够实现大批量、快速生产；5)特定免疫检查点组合敲除的t细胞与肿瘤细胞共培养时，能够更高效的诱导t细胞分泌ifn-γ、tnf-α和il-2细胞因子，并对肿瘤细胞具有更强的杀伤效果。附图说明图1.pmh001-cas9质粒结构图。图2.pmh002-cpf1质粒结构图。图3a.t7en1酶切鉴定cas-sgrna介导的人lag-3基因特异性切割。图3b.t7en1酶切鉴定cpf-sgrna介导的人lag-3基因特异性切割。图3c.t7en1酶切鉴定cas-sgrna介导的人tim-3基因特异性切割。图3d.t7en1酶切鉴定cpf-sgrna介导的人tim-3基因特异性切割。图4a.cas-sgrna介导的位点特异性人lag-3切割测序结果，(-)表示敲除区域；sglag3-1#即对应cas-lag3-sg#6(seqidno.9)。图4b.cpf-sgrna介导的位点特异性人lag-3切割测序结果，(-)表示敲除区域；sglag3-1#cpf1即对应cpf-lag3-sg#1(seqidno.281)。图5a.cas-sgrna介导的多基因特异性切割酶切鉴定图：同时编辑lag-3和pd-1。图5b.cas-sgrna介导的多基因特异性切割酶切鉴定图：同时编辑tim-3和pd-1。图5c.cas-sgrna介导的多基因特异性切割酶切鉴定图：同时编辑lag-3、tim-3和pd-1。图6a.facs分析t细胞处理前后细胞表面pd-1的敲除率：左侧图示处理前t细胞，右侧图示基因编辑处理后t细胞。图6b.facs分析t细胞处理前后细胞表面lag-3的敲除率：左侧图示处理前t细胞，右侧图示基因编辑处理后t细胞。图6c.facs分析t细胞处理前后细胞表面tim-3的敲除率：左侧图示处理前t细胞，右侧图示基因编辑处理后t细胞。图7a.ifn-γ细胞因子的效应检测结果。图7b.tnf-α细胞因子的效应检测结果。图7c.il-2细胞因子的效应检测结果。图8.cytotox96非放射性细胞毒性检测结果。具体实施方式下面结合附图和具体的实施例对本发明的技术方案做进一步介绍。实施例1crispr-cas9/cpf1特异性敲除人lag-3、tim-3或pd-1基因的靶向性sgrna的设计和合成1、靶向人lag-3、tim-3或pd-1基因的cas-sgrna的设计：(1)在lag-3、tim-3或pd-1基因上选择5’-n(21)gg的序列，或者5’-n(21)ag。(2)sgrna在lag-3、tim-3或pd-1基因上的靶向位点或者剪切位点位于基因的外显子，这样更容易引起片段的缺失或移框突变，从而达到基因完全失活的目的。(3)sgrna在lag-3、tim-3或pd-1基因上的靶向位点或者剪切位点位于不同的各种剪切形式的共有外显子上。(4)在ucsc数据库中用blat或ncbi数据库中用blast，确定sgrna的靶序列是否唯一，减少潜在的脱靶位点。根据以上方法，本发明共设计了277个靶向人lag-3基因的sgrna，命名为cas-lag3-sg#1-#277，序列分别如序列表seqidno.4-280所示；设计了129个靶向人tim-3基因的sgrna，命名为cas-tim3-sg#1-#129，序列分别如序列表seqidno.302-430所示；设计了10个靶向人pd-1基因的sgrna，命名为cas-pd1-sg#1-#10，序列分别如序列表seqidno.468-477所示。2、靶向人lag-3、tim-3或pd-1基因的cas-sgrna的选择：(1)靶向lag-3、tim-3或pd-1基因的cas-sgrna的切点保证位于基因编码区。(2)sgrna在lag-3、tim-3或pd-1基因上的靶向位点位于整个基因的前半段，尤其宜在基因的功能结构域中。(3)在lag-3、tim-3或pd-1基因上选择相隔一定距离(10-30bp)成对的位点。这样有利于形成特异性的片段缺失，也有利于降低脱靶效应。(4)如果基因有多种剪切形式，选择靶向不同剪切形式中的相同序列区域的sgrna。根据以上方法，在277个靶向人lag-3基因的cas-sgrna(序列分别如序列表seqidno.4-280所示)中符合要求的序列有数十个，从中选择了6个cas-sgrna(分别如序列表seqidno.9、46-50所示)进行后续实验。同样的，在129个靶向人tim-3基因的cas-sgrna(序列分别如序列表seqidno.302-430所示)中符合要求的序列大于10个，从中选择了6个(分别如序列表seqidno.305-307、310、312、313所示)进行后续实验。选择了靶向人pd-1基因的cas-sgrna(序列分别如序列表seqidno.468-477所示)中的2个序列，分别如序列表seqidno.472、474所示)进行后续实验。3、靶向人lag-3或tim-3基因的cpf-sgrna的设计：(1)lag-3或tim-3基因上选择5’tttn(20)序列。步骤(2)-(4)同上述方法1。根据以上方法，本发明共设计了21个靶向人lag-3基因的sgrna，命名为cpf-lag3-sg#1-#21，序列分别如序列表seqidno.281-301所示；设计了37个靶向人tim-3基因的sgrna，命名为cpf-tim3-sg#1-#37，序列分别如序列表seqidno.431-467所示。4、靶向人lag-3或tim-3基因的cpf-sgrna的选择原则同上述方法2。根据以上方法，在21个靶向人lag-3基因的cpf-sgrna中选择了6个(分别如序列表seqidno.281-286所示)进行后续实验。在37个靶向人tim-3基因的cpf-sgrna中选择了6个(分别如序列表seqidno.431-436所示)进行后续实验。5、靶向人lag-3、tim-3或pd-1基因的sgrna寡聚核苷酸的合成：根据前述方法选择的14个cas-sgrna(分别如序列表seqidno.6、43-47、305-307、310、312、313、472、474所示)，在其5’端加上caccg得到正向寡核苷酸(forwardoligo)(如果序列本身在5’端已经有1个g，那么就对应的省略1个g)；根据选择的sgrna，获得其对应dna的互补链，并且在其5’端加上aaac得到反向寡核苷酸(reverseoligo)(如果正向链的5’加的是caccg，则要在反向寡核苷酸链的3’端加c)。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgrna寡聚核苷酸的forwardoligo和reverseoligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入表达载体的双链，如下：forwardoligo:5′-caccgnnnnnnnnnnnnnnnnnnreverseoligo:-----------------cnnnnnnnnnnnnnnnnnncaaa-5′根据前述方法选择的6个cpf-sgrna(分别如序列表seqidno.281-286、431-436所示)，在其5’端加上agat得到正向寡核苷酸(forwardoligo)；根据选择的sgrna，获得其对应dna的互补链，并且在其5’端加上aaaa得到反向寡核苷酸(reverseoligo)。分别合成上述正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将合成的sgrna寡聚核苷酸的forwardoligo和reverseoligo成对变性、退火，退火之后形成可以连入表达载体的双链，如下：forwardoligo:5′-agatnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnreverseoligo:---------------nnnnnnnnnnnnnnnnnnnnaaaa-5′上述变性、退火体系为：在pcr仪中按照以下touchdown程序运行：95℃，5min；95-85℃at-2℃/s；85-25℃at-0.1℃/s；holdat4℃。分别获得用于后续实验验证的cas-lag3-sg#6、#43-#47；cpf-lag3-sg#1-#6；cas-tim3-sg#4-#6、#9、#11、#12；cpf-tim3-sg#1-#6；cas-pd1-sg#5、#7sgrna寡聚核苷酸。实施例2sgrna基因编辑质粒的构建1、cas9质粒的构建：质粒pmh001-cas9的制备方法参见文献：lecongetal.multiplexgenomeengineeringusingcrispr/cassystemsscience339，819(2013)；(doi:10.1126/science.1231143)，质粒pmh001-cas9结构图请见图1，完整序列如seqidno.478所示。2、cpf1质粒的构建：质粒pmh002-cpf1的制备方法参见文献：zetschebetal.cpf1isasinglerna-guidedendonucleaseofaclass2crispr-cassystem.cell.2015；163:759–71.，质粒pmh002-cpf1结构图请见图2，完整序列如seqidno.479所示。3、单sgrna基因编辑质粒的构建：(1)线性化上述步骤1、2制备的pmh001-cas9或者pmh002-cpf1质粒。酶切体系和条件如下：2μgpmh001-cas9或者pmh002-cpf1(400ng/μl)；5μl10xfastdigestbuffer/fastdigestgreenbuffer；1μlbbsi(fermentas，fd1014)；补水至50μl，37℃孵育3-4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。酶切完成后纯化回收至20-40μl灭菌水中。(2)将实施例1构建获得的变性、退火之后的双链sgrna寡聚核苷酸与线性化的pmh001-cas9或者pmh002-cpf1质粒相连获得基因编辑质粒。连接体系如下：25℃孵育10分钟。(3)将上述步骤获得的连接产物转化dh5α感受态细胞并涂amp+平板，并挑取克隆。(4)用通用引物hu6.f，常规测序方法鉴定获得阳性克隆。(5)37℃摇床摇菌过夜培养阳性克隆，抽提质粒，获得：pmh001-cas9-sglag3#6、#43-#47、pmh002-cpf1-sglag3#1-#6、pmh001-cas9-sgtim3#4-#6、#9、#11、#12、pmh002-cpf1-sgtim3#1-#6、pmh001-cas9-sgpd1#5、#7。4、双sgrna基因编辑质粒的构建：(1)按照实施例2步骤1-3中所述方法分别构建单sgrna表达载体，例如，pmh001-cas9-sglag3-#6或pmh001-cas9-sgtim3-#5。(2)以pmh001-cas9-sglag3-#6为模板，通过pcr扩增获得包含u6启动子和转录终止信号的pu6-sglag3-#6-t序列。(3)用xbai限制性内切酶线性化pmh001-cas9-sgtim3-#5载体。具体反应体系如下2μgpmh001-cas9-sgtim3-#5；5μl10xfastdigestbuffer/fastdigestgreenbuffer；1μlxbai(fermentas，fd0684)；补水至50μl，37℃孵育3-4小时，每隔一段时间振荡一下并离心以防液滴蒸发至管盖上。酶切完成后纯化回收至20-40μl灭菌水中。(4)将步骤(2)中得到的片段与步骤(3)中对应的线性化载体重组后，转化top10大肠杆菌感受态细胞。具体反应体系如下：(5)摇菌扩增，并提取质粒dna测序鉴定阳性克隆pmh001-cas9-sgtim3-#5-sglag3-#6。本发明中所使用的其余双/多sgrna基因编辑质粒均参照上述方式构建，在此并不一一描述。实施例3利用crispr-cas9特异性敲除人lag-3或tim-3基因1、细胞培养与转染(1)hek293t细胞接种培养于dmem培养基中，其中含10％fbs，penicillin(100u/ml)和streptomycin(100μg/ml)。(2)在转染前分至12孔板中，待60％-80％密度时进行转染。(3)按照lipofectaminetm2000transfectionreagent(invitrogen，11668-019)的操作手册，将2μg携带靶向lag-3sgrna或tim-3sgrna的质粒转染至每孔细胞中，6-8小时后换液，并加入puromycin(merck，540411)药筛，48小时后收取细胞。设计实验组和对照组如表1：表1.crispr-cas9特异性敲除人lag-3或tim-3基因实验组设计2、t7en1酶切检测(1)将收集的细胞在裂解液(10μmtris-hcl，0.4mnacl，2μmedta，1％sds)中用100μg/ml蛋白酶k裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50μl去离子水中。(2)使用引物hlag-3test和htim-3test进行pcr扩增(引物序列请见表2)，回收纯化pcr产物，取200ng统一稀释到20μl进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95–85℃at-2℃/s；85–25℃at-0.1℃/s；holdat4℃。表2.cas9酶系统hlag-3test和htim-3test引物序列(3)在20μl体系中加入t7en10.3μl，37℃酶切30分钟后，加入2μl10×loadingbuffer，用2.5％的琼脂糖胶电泳检测。酶切结果请见图3a、3c，加入针对人lag-3、tim-3的sgrna的样品都出现了切割条带，并且具有较高的切割效率，使用双sgrna进行编辑的实验组的切割效率明显优于单sgrna切割组。3、ta克隆测序(1)将t7en1酶切检测步骤(2)获得的pcr回收产物用rtaq进行加a反应。加a反应体系为：补水至50μl体系，37℃温育30分钟后，取1μl产物与pmd19-tvector连接并转化dh5α感受态细胞。(2)挑取单克隆以通用引物u6测序，根据测序结果发现：靶基因lag-3、tim-3缺失了sgrna靶向的一段序列，基因敲除成功，见图4。实施例4利用crispr-cpf1特异性敲除人lag-3或tim-3基因1、细胞培养与转染细胞培养与转染方法与实施例3相同，设计实验组和对照组如表3所示：表3.crispr-cpf1特异性敲除人lag-3或tim-3基因实验组设计实验组sgrna编号seqidno.cpf1cpf-lag3-sg#1281cpf2cpf-lag3-sg#2282cpf3cpf-lag3-sg#3283cpf4cpf-lag3-sg#1+#4281、284cpf5cpf-lag3-sg#2+#5282、285cpf6cpf-lag3-sg#3+#6283、286cpf7cpf-lag3-sg#5+#6285、286cpf8cpf-tim3-sg#1431cpf9cpf-tim3-sg#2432cpf10cpf-tim3-sg#3433cpf11cpf-tim3-sg#1+#3431、433cpf12cpf-tim3-sg#2+#4432、434cpf13cpf-tim3-sg#3+#5433、435cpf14cpf-tim3-sg#5+#6435、436对照组pmh002-cpf1空载体4792、t7en1酶切检测(1)将收集的细胞在裂解液(10μmtris-hcl，0.4mnacl，2μmedta，1％sds)中用100μg/ml蛋白酶k裂解消化后，酚-氯仿抽提后溶解到50μl去离子水中。(2)使用引物hlag-3test和htim-3test进行pcr扩增(引物序列请见表4)，回收纯化pcr产物，取200ng统一稀释到20μl进行变性、退火，程序如：95℃，5min；95–85℃at-2℃/s；85–25℃at-0.1℃/s；holdat4℃。表4.cpf1酶系统hlag-3test和htim-3test引物序列(3)在20μl体系中加入t7en10.3μl，37℃酶切30分钟后，加入2μl10×loadingbuffer，用2.5％的琼脂糖胶电泳检测。酶切结果请见图3b、3d，加入针对人lag-3、tim-3的sgrna的样品都出现了切割条带，并且具有较高的切割效率，使用双sgrna进行编辑的实验组的切割效率明显优于单sgrna切割组。3、ta克隆测序ta克隆测序的方法与实施例3相同，根据测序结果发现：靶基因lag-3、tim-3缺失了sgrna靶向的一段序列，基因敲除成功。实施例5利用crispr-cas9特异性敲除多个靶基因细胞培养与转染、t7en1酶切检测、ta克隆测序的具体方法与实施例3-4相同，设计实验组和对照组如表5所示：表5.crispr-cas9特异性敲除多个靶基因实验组设计实验组sgrna编号seqidno.cas15cas-pd1-#5-lag3-#6472、9cas16cas-pd1-#7-tim3-#5474、306cas17cas-pd1-#5-tim3-#5-lag3-#46472、306、49对照组pmh001-cas9空载体478酶切结果请见图5a-c，加入针对人lag-3、tim-3、pd-1的sgrna的样品都出现了切割条带，并且具有较高的切割效率；测序结果亦显示靶基因敲除成功，即实现了同时敲除人类细胞上的多个免疫检查点基因。实施例6利用crispr-cas9特异性敲除多个靶基因的t细胞的制备1、靶向敲除lag-3/tim-3/pd-1基因的重组病毒的制备1)采用ecor1、age1核酸内切酶和磷酸酶37℃处理30分钟使lenti-crispr/cas9质粒(addgene52961)去磷酸化，得到lenti-crispr/cas9-puro质粒；2)以cas-pd1-#5、tim3-#5、lag3-#46sgrna序列作为lag-3/tim-3/pd-1特异性引导rna，依照实施例1、2、5所述方法合成构建双链sgrna寡聚核苷酸；3)使用t4连接酶将上述步骤2)获得的双链sgrna寡聚核苷酸与步骤1)所得lenti-crispr/cas9-puro质粒连接，室温孵育10分钟即可得到重组病毒质粒lenti-crispr/cas-sgrna-puro。2、重组逆转录病毒lenti-pd-1-puro的包装1)将重组病毒质粒lenti-crispr/cas-sgrna-puro转入stbl3细菌，经氨苄青霉素筛选，菌种扩增，病毒质粒纯化，测序鉴定，具体步骤如下：菌种筛选：将转入质粒的细菌种在含氨苄青霉素(100微克/毫升)的琼脂板上，37℃孵育12-16小时后长出菌落，选择3到6个的菌落进行扩增；菌种扩增：将上述选择的菌落放入300毫升含氨苄青霉素(100微克/毫升)的lb细菌培养液，37℃摇床孵育12-16小时，细菌大量扩增；质粒纯化：用质粒大抽试剂盒进行提纯，得到1到2毫克病毒质粒；测序鉴定：将提取的病毒质粒进行测序，选择序列100％正确匹配的病毒质粒进行后续实验验证。2)转染前一天接种293t细胞到10cm培养皿中，细胞密度以第二天长到细胞70-80％汇合为宜；细胞培养基为dmem，其中含10％胎牛血清、5000u/ml抗生素(3000u/ml氨苄青霉素和2000u/ml链霉素)；3)转染前2小时换新鲜细胞培养基，将重组病毒质粒lenti-crispr/cas-sgrna-puro与辅助包装质粒pspax、pmd2.g转染试剂混合到1.5ml离心管中；其中，lenti-crispr/cas-sgrna-puro、pspax、pmd2.g的混合比例为4:3:1；4)将混合液轻轻混匀后室温放置10分钟，加入10ml细胞培养基中，轻摇混匀；5)细胞培养箱37℃，5％co2培养6小时后，更换新鲜细胞培养基；6)再培养48小时后收集富含病毒的培养基，用0.45um的滤器过滤后分装保存于-80℃，可直接用于感染t细胞。3、t细胞的分离与富集t细胞分离的样本来自于健康志愿者的外周血，具体分离纯化步骤如下：1)静脉采血30毫升，并加入含50u/毫升肝素的pbs溶液30毫升；2)在2个50毫升离心管中分别加入20毫升ficoll-paqueplus，3)将步骤1)稀释后的静脉血30毫升分别加到ficoll的上层，应注意保持两者界面清晰；4)20℃，400g/分钟离心30分钟，明显分层，取中间层细胞到50毫升离心管中；5)加入30毫升pbs重悬细胞后，100g/分钟，离心5分钟；6)重复步骤4)后，计数培养t细胞。4、利用基因重组病毒对肿瘤t细胞进行感染和基因编辑1)用30ng/毫升il-2活化t细胞72小时；2)将步骤2收集的病毒培养基与t细胞培养基(rpmi1640含10％胎牛血清)按1:1(v/v)混合后感染t细胞，同时加入10μg/毫升polybrener增加感染效率；3)感染t细胞24小时后，收集并离心t细胞，更换新鲜培养基(含10％胎牛血清的rpmi1640)培养48小时，收集并离心t细胞，经细胞记数后用生理盐水冲洗2-3次。4)使用lag-3、tim-3、pd-1荧光抗体标记，采用流式分析(facs)鉴定基因编辑效率：经上述多基因编辑修饰过的t细胞(mh-t)鉴定结果见图6，左侧图片均为处理前t细胞，右侧图片为经过基因编辑处理的t细胞(mh-t)。由图6a-c可见，t细胞(cd3+)经过基因编辑后，pd-1的表达量由对照组的65.77％下降至处理组的8.46％，敲除率可达87.14％；lag-3的表达量由对照组的44.66％下降至处理组的4.49％，敲除率可达89.95％；tim-3的表达量由对照组的62.31％下降至处理组的32.68％，敲除率可达47.55％。实施例7lag-3/tim-3/pd-1多基因敲除的t细胞功能验证检测实施例6获得的lag-3/tim-3/pd-1多基因敲除的t细胞(mh-t)及感染空载体lenti-crispr/cas9-puro的t细胞(ck-t)对对肝癌细胞(mhcc97h，lm3，smcc7721，hepg2，hep3b)、肺癌细胞(a549,spc-a1,nci-h1650,nci-h1975，nci-h460，sk-mes-1)、胃癌细胞(mkn-45，mgc-803，nci-n87，snu-5，katoiii，hgc-27，bgc-823，sgc-7901，ags)、乳腺癌细胞(bcap-37和mcf-7、skbr3)的体外杀伤效果。具体操作步骤如下：(1)靶细胞培养：分别接种a549、hepg2、mkn-45、及skbr3于96/孔板；(2)效应细胞接种：按效靶比1:5、1:1或5:1分别加入ck-t或mh-t；(3)实验设计：实验分组情况请详见表6，各组均设3个重复，取平均值进行分析，检测时间为接种效应细胞后培养20h。表6.基因编辑t细胞功能验证实验分组(4)检测方法：a.检测ifn-γ、tnf-α和il-2细胞因子的靶-特异性释放。实验结果如图7所示，由图中可以看出，不论效靶比的高低，经过基因编辑的mh-t较对照组的ifn-γ的分泌量都明显增高，随效靶比的增加，ifn-γ分泌量显著提升。mh-t组的il-2、tnf-g也都表现出高水平表达的趋势，证明基因编辑后的t细胞确实能够对多种肿瘤细胞产生更强的应答反应。b.采用cytotox96非放射性细胞毒性检测试剂盒(promega)检测肿瘤细胞体外裂解情况。该方法是基于比色法的定量地测量乳酸脱氢酶(ldh)的检测方法，可替代51cr释放法。ldh是一种稳定的胞质酶，在细胞裂解时会释放出来，其释放方式与51cr在放射性分析中的释放方式基本相同。释放出的ldh培养基上清中，可通过30分钟偶联的酶反应来检测，在酶反应中ldh可使一种四唑盐(int)转化为红色的甲臜产物。生成的红色产物的量与裂解的细胞数成正比。常用的96孔读板仪可以收集可见光的吸光度值，该方法可以检测细胞介导的细胞毒作用中(该作用中靶细胞被效应细胞所裂解)的胞膜完整性。具体操作参照cytotox96非放射性细胞毒性检测试剂盒说明书进行。测量参数a实验组释放ldh测量参数b靶细胞自发释放ldh测量参数c效应细胞自发释放ldh测量参数d靶细胞最大释放ldh细胞毒性计算公式如下：mh-t细胞对a549、hepg2、mkn-45、及skbr3的杀伤效果如图8所示。结果显示，lag-3/tim-3/pd-1多基因敲除的t细胞对a549、hepg2、mkn-45、及skbr3细胞的杀伤作用明显优于对照t细胞，效靶比5:1时均可杀伤60％以上的肿瘤细胞，具体肿瘤细胞杀伤效率请见下表。本文引用的所有专利、专利申请和出版物的公开内容在此都通过引用全文并入。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。sequencelisting<110>北京微旋基因技术有限公司<120>特异性靶向tim-3基因的sgrna和特异性敲除tim-3基因的方法<160>497<170>patentinversion3.3<210>1<211>1578<212>dna<213>lag-3<400>1atgtgggaggctcagttcctgggcttgctgtttctgcagccgctttgggtggctccagtg60aagcctctccagccaggggctgaggtcccggtggtgtgggcccaggagggggctcctgcc120cagctcccctgcagccccacaatccccctccaggatctcagccttctgcgaagagcaggg180gtcacttggcagcatcagccagacagtggcccgcccgctgccgcccccggccatcccctg240gcccccggccctcacccggcggcgccctcctcctgggggcccaggccccgccgctacacg300gtgctgagcgtgggtcccggaggcctgcgcagcgggaggctgcccctgcagccccgcgtc360cagctggatgagcgcggccggcagcgcggggacttctcgctatggctgcgcccagcccgg420cgcgcggacgccggcgagtaccgcgccgcggtgcacctcagggaccgcgccctctcctgc480cgcctccgtctgcgcctgggccaggcctcgatgactgccagccccccaggatctctcaga540gcctccgactgggtcattttgaactgctccttcagccgccctgaccgcccagcctctgtg600cattggttccggaaccggggccagggccgagtccctgtccgggagtccccccatcaccac660ttagcggaaagcttcctcttcctgccccaagtcagccccatggactctgggccctggggc720tgcatcctcacctacagagatggcttcaacgtctccatcatgtataacctcactgttctg780ggtctggagcccccaactcccttgacagtgtacgctggagcaggttccagggtggggctg840ccctgccgcctgcctgctggtgtggggacccggtctttcctcactgccaagtggactcct900cctgggggaggccctgacctcctggtgactggagacaatggcgactttacccttcgacta960gaggatgtgagccaggcccaggctgggacctacacctgccatatccatctgcaggaacag1020cagctcaatgccactgtcacattggcaatcatcacagtgactcccaaatcctttgggtca1080cctggatccctggggaagctgctttgtgaggtgactccagtatctggacaagaacgcttt1140gtgtggagctctctggacaccccatcccagaggagtttctcaggaccttggctggaggca1200caggaggcccagctcctttcccagccttggcaatgccagctgtaccagggggagaggctt1260cttggagcagcagtgtacttcacagagctgtctagcccaggtgcccaacgctctgggaga1320gccccaggtgccctcccagcaggccacctcctgctgtttctcatccttggtgtcctttct1380ctgctccttttggtgactggagcctttggctttcacctttggagaagacagtggcgacca1440agacgattttctgccttagagcaagggattcaccctccgcaggctcagagcaagatagag1500gagctggagcaagaaccggagccggagccggagccggaaccggagcccgagcccgagccc1560gagccggagcagctctga1578<210>2<211>906<212>dna<213>tim-3<400>2atgttttcacatcttccctttgactgtgtcctgctgctgctgctgctactacttacaagg60tcctcagaagtggaatacagagcggaggtcggtcagaatgcctatctgccctgcttctac120accccagccgccccagggaacctcgtgcccgtctgctggggcaaaggagcctgtcctgtg180tttgaatgtggcaacgtggtgctcaggactgatgaaagggatgtgaattattggacatcc240agatactggctaaatggggatttccgcaaaggagatgtgtccctgaccatagagaatgtg300actctagcagacagtgggatctactgctgccggatccaaatcccaggcataatgaatgat360gaaaaatttaacctgaagttggtcatcaaaccagccaaggtcacccctgcaccgactcgg420cagagagacttcactgcagcctttccaaggatgcttaccaccaggggacatggcccagca480gagacacagacactggggagcctccctgatataaatctaacacaaatatccacattggcc540aatgagttacgggactctagattggccaatgacttacgggactctggagcaaccatcaga600ataggcatctacatcggagcagggatctgtgctgggctggctctggctcttatcttcggc660gctttaattttcaaatggtattctcatagcaaagagaagatacagaatttaagcctcatc720tctttggccaacctccctccctcaggattggcaaatgcagtagcagagggaattcgctca780gaagaaaacatctataccattgaagagaacgtatatgaagtggaggagcccaatgagtat840tattgctatgtcagcagcaggcagcaaccctcacaacctttgggttgtcgctttgcaatg900ccatag906<210>3<211>921<212>dna<213>pd-1<400>3cactctggtggggctgctccaggcatgcagatcccacaggcgccctggccagtcgtctgg60gcggtgctacaactgggctggcggccaggatggttcttagactccccagacaggccctgg120aacccccccaccttctccccagccctgctcgtggtgaccgaaggggacaacgccaccttc180acctgcagcttctccaacacatcggagagcttcgtgctaaactggtaccgcatgagcccc240agcaaccagacggacaagctggccgccttccccgaggaccgcagccagcccggccaggac300tgccgcttccgtgtcacacaactgcccaacgggcgtgacttccacatgagcgtggtcagg360gcccggcgcaatgacagcggcacctacctctgtggggccatctccctggcccccaaggcg420cagatcaaagagagcctgcgggcagagctcagggtgacagagagaagggcagaagtgccc480acagcccaccccagcccctcacccaggtcagccggccagttccaaaccctggtggttggt540gtcgtgggcggcctgctgggcagcctggtgctgctagtctgggtcctggccgtcatctgc600tcccgggccgcacgagggacaataggagccaggcgcaccggccagcccctgaaggaggac660ccctcagccgtgcctgtgttctctgtggactatggggagctggatttccagtggcgagag720aagaccccggagccccccgtgccctgtgtccctgagcagacggagtatgccaccattgtc780tttcctagcggaatgggcacctcatcccccgcccgcaggggctcagctgacggccctcgg840agtgcccagccactgaggcctgaggatggacactgctcttggcccctctgaccggcttcc900ttggccaccagtgttctgcag921<210>4<211>20<212>dna<213>cas-lag3-sg#1<400>4atgtgggaggctcagttcct20<210>5<211>20<212>dna<213>cas-lag3-sg#2<400>5tgctgtttctgcagccgctt20<210>6<211>20<212>dna<213>cas-lag3-sg#3<400>6gctgcagaaacagcaagccc20<210>7<211>20<212>dna<213>cas-lag3-sg#4<400>7gctgtttctgcagccgcttt20<210>8<211>20<212>dna<213>cas-lag3-sg#5<400>8gtttctgcagccgctttggg20<210>9<211>20<212>dna<213>cas-lag3-sg#6<400>9tgacccctgctcttcgcaga20<210>10<211>20<212>dna<213>cas-lag3-sg#7<400>10c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