作为脑啡肽酶抑制剂的(2S,4R)‑5‑(5’‑氯‑2’‑氟联苯‑4‑基)‑2‑(乙氧基草酰基氨基)‑2‑羟甲基‑2‑甲基戊酸的制作方法

本发明涉及一种新颖化合物和其结晶形式，其在活体内会经过代谢形成具有作为脑啡肽酶抑制剂的效用的化合物。本发明也涉及包含化合物的医药组合物、这种化合物的制备方法和使用化合物治疗如高血压、心脏衰竭、肺高血压和肾病的疾病的方法。
背景技术：
：脑啡肽酶(中性内肽酶，ec3.4.24.11)(nep)是在多个器官和组织(包括脑、肾、肺、胃肠道、心脏和外周脉管系统)中发现的内皮膜结合zn2+金属肽酶。nep会使多种内源性肽(如脑啡肽、循环缓激肽、血管紧张素肽和利钠肽)降解并且失活，其中后者具有数种作用，包括例如血管扩张和利钠/利尿以及抑制心脏肥大和心室纤维化。因此，nep在血压内稳定和心血管健康方面发挥重要作用。已研究nep抑制剂(如塞奥芬(thiorphan)、坎沙曲(candoxatril)和坎沙曲拉(candoxatrilat))作为潜在治疗剂。也已知抑制nep与血管紧张素-i转化酶(ace)的化合物，并且其包括奥马曲拉(omapatrilat)、杰帕曲拉(gempatrilat)和山帕曲拉(sampatrilat)。称为血管肽酶抑制剂的此后一种化合物描述于罗伯(robl)等人,(1999)治疗术专利专家评论(exp.opin.ther.patents)9(12):1665-1677中。多种nep抑制剂描述于休斯(hughes)等人的美国专利申请公开案第2013/0109639号中。一种这类化合物是(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-2-羟甲基-2-甲基-4-(草酰基氨基)戊酸，其具有结构：这种化合物展现有效nep抑制活性(pki≥9)。然而，也已发现这种化合物在临床前物种中具有极低口服生物可用性，使其不适合或不适宜用于口服投药。一种提高化合物的口服生物可用性的方法是形成化合物的前药。当口服投药时，前药应具有可接受的口服吸收并且在活体内可经过裂解产生活性化合物。以nep抑制剂来说，任何这类前药快速(例如在口服投药后一小时内)并且完全裂解是优选的，如此使得活性化合物的初始快速注射可用于触发环单磷酸鸟苷(cgmp)反应。也可能需要前药自身具有nep抑制活性以使得前药在其裂解前促成药理学活性。此外，任何这类前药在长时段储存时应是化学稳定的。因此，需要具有可接受的口服吸收并且在活体内能快速裂解产生活性化合物的(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-2-羟甲基-2-甲基-4-(草酰基氨基)戊酸的前药。前药也具有一定程度的nep抑制活性。本发明涉及所述需求。另外，为有效使用nep抑制剂化合物作为治疗剂，其宜具有可容易制造并且具有可接受的化学和物理稳定性的固态形式。举例来说，其极宜具有在适当高温下热稳定的物理形式，从而促进物质的加工和储存。结晶固体通常优于非晶形式以提高制品的纯度和稳定性。然而，有机化合物的结晶形式的形成高度不可预测。尚不存在可靠方法来预测有机化合物的何种形式(如果存在)将会结晶。此外，尚不存在方法来预测何种结晶形式(如果存在)具有用作药剂所要的物理特性。因此，需要一种具有适当高的熔点的稳定结晶形式。技术实现要素：本发明提供一种新颖化合物(1)，其在活体内会转化形成具有脑啡肽酶(nep)抑制活性的化合物。因此，预期这种化合物适用作并且宜用作治疗如高血压和心脏衰竭的病状的治疗剂。本发明的一方面涉及(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-4-(乙氧基草酰基氨基)-2-羟甲基-2-甲基戊酸(1)：或其药学上可接受的盐。本发明的另一方面涉及化合物1的结晶形式。在一个实施例中，结晶形式(1')是化合物1的半钙盐。本发明的另一方面涉及如下医药组合物，其包含一或多种药学上可接受的载剂和化合物1或其结晶形式。这类组合物可任选地含有其它治疗剂，其包括(但不限于)at1受体拮抗剂、血管收缩素转化酶抑制剂、磷酸二酯酶(pde)抑制剂、肾素抑制剂、利尿剂或其组合。化合物1具有nep酶抑制活性，因此预期适用作治疗罹患通过抑制nep酶或通过提高其肽底物水平治疗的疾病或病症的患者的治疗剂。因此，本发明的一方面涉及一种治疗通过抑制nep酶治疗的疾病或病症的患者的方法，其包含向患者投与治疗有效量的化合物1。本发明的另一方面涉及一种治疗高血压、心脏衰竭或肾病的方法，其包含投与个体治疗有效量的化合物1。本发明的另一方面涉及一种抑制个体的nep酶的方法，其包含投与个体nep酶抑制量的化合物1。由于化合物1具有nep抑制活性，故其也适用作研究工具。因此，本发明的一方面涉及一种使用化合物1作为研究工具的方法，所述方法使用化合物1进行生物分析。化合物1也可用于评估新颖化合物。因此，本发明的另一方面涉及一种在生物分析中评估测试化合物的方法，其包含：(a)用测试化合物进行生物分析，得到第一分析值；(b)用本发明化合物进行生物分析，得到第二分析值；其中步骤(a)在步骤(b)之前、之后或与步骤(b)同时进行；和(c)比较来自步骤(a)的第一分析值与来自步骤(b)的第二分析值。示范性生物分析包括nep酶抑制分析。本发明的再另一方面涉及一种研究包含nep酶的生物系统或样品的方法，所述方法包含(a)使生物系统或样品与本发明化合物接触；和(b)测定由所述化合物对所述生物系统或样品所产生的影响。本发明的另一方面涉及适用于制备化合物1或其结晶形式的方法。本发明的另一方面涉及化合物1或其结晶形式用于制造药物、尤其用于制造适用于治疗高血压、心脏衰竭或肾病的药物的用途。本发明的另一个方面涉及化合物1或其结晶形式用于抑制哺乳动物的nep酶的用途。本文中揭示本发明的其它方面和实施例。附图说明本发明的各种方面通过参考附图说明。图1展示(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-乙氧基-2-氧代乙酰氨基)-2-(羟甲基)-2-甲基戊酸钙(1')的结晶形式的粉末x射线衍射(pxrd)图案。图2展示(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-乙氧基-2-氧代乙酰氨基)-2-(羟甲基)-2-甲基戊酸钙(1')的结晶形式的差示扫描热量测定(dsc)热分析图。图3展示(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-乙氧基-2-氧代乙酰氨基)-2-(羟甲基)-2-甲基戊酸钙(1')的结晶形式的热解重量分析(tga)图。图4展示(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-乙氧基-2-氧代乙酰氨基)-2-(羟甲基)-2-甲基戊酸钙(1')的结晶形式的动态湿气吸附(dms)等温线。图5是(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-乙氧基-2-氧代乙酰氨基)-2-(羟甲基)-2-甲基戊酸钙(1')的结晶形式的偏振光显微镜(plm)图像。图6展示精氨酸(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-乙氧基-2-氧代乙酰氨基)-2-(羟甲基)-2-甲基戊酸盐(1″)的结晶形式的粉末x射线衍射(pxrd)图案。图7展示精氨酸(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-乙氧基-2-氧代乙酰氨基)-2-(羟甲基)-2-甲基戊酸盐(1″)的结晶形式的差示扫描热量测定(dsc)热分析图。图8展示精氨酸(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-乙氧基-2-氧代乙酰氨基)-2-(羟甲基)-2-甲基戊酸盐(1″)的结晶形式的热解重量分析(tga)图。图9是精氨酸(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-乙氧基-2-氧代乙酰氨基)-2-(羟甲基)-2-甲基戊酸盐(1″)的结晶形式的偏振光显微镜(plm)图像。具体实施方式在一个方面中，本发明涉及(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-4-(乙氧基草酰基氨基)-2-羟甲基-2-甲基戊酸(1)或其药学上可接受的盐。本发明的化合物1含有两个手性中心，因此，这种化合物可以各种立体异构形式制备和使用。特定地说，碳原子具有特定(r,r)、(s,s)、(s,r)或(r,s)构型或富含具有这类构型的立体异构形式。所示和命名的化合物1是(s,r)构型。除非另外规定，否则所属领域的技术人员应了解少量其它立体异构体可存在于本发明的组合物中，前提是组合物整体效用不会因这类其它异构体的存在而去除。个别立体异构体可通过所属领域中熟知的大量方法获得，包括使用适合手性固定相或载体的手性色谱；或通过将其化学转化为非对映异构体，通过常规手段(如色谱或再结晶)分离所述非对映异构体，随后再生初始立体异构体来获得。化合物1是乙酯前药，其中乙基部分用以改良化合物的亲脂性，因此通过遮蔽羧酸改良活性化合物的被动膜渗透性。在体内之后，相信这个酯键由血液、肝脏和其它器官和组织中发现的酯酶水解。已发现本发明的化合物1抑制脑啡肽酶(nep)。另外，化合物在其于活体内经过代谢后具有更大nep抑制效能。因此，当论述本发明化合物的活性时，应了解，任何所述化合物可在分析中展现某一水平的活性，并且在代谢成其活性形式后展现改良的活性水平。化合物抑制nep活性的能力的一个量度是抑制常数(pki)。pki值是解离常数(ki)以10是底的负对数，其通常以摩尔为单位报道。化合物1在代谢时形成(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-2-羟甲基-2-甲基-4-(草酰基氨基)戊酸(“活性剂或活性代谢物”)，其在美国专利申请公开案第2013/0109639号中报道为对nep的pki≥9。化合物1的其它特性和效用可使用所属领域的技术人员熟知的活体外和活体内分析展现，尤其包括美国专利申请公开案第2013/0109639号中所述的分析。化合物1以及其合成中所用的那些化合物也可包括被同位素标记的化合物，即其中一或多个原子富含原子质量不同于自然界中主要发现的原子质量的原子。可并入式i化合物中的同位素的实例例如包括(但不限于)2h、3h、13c、14c、15n、18o、17o、35s、36cl和18f。尤其关注富含氚或碳-14的化合物1，其可用于例如组织分布研究；尤其在代谢部位富含氘的化合物1，例如得到具有较大代谢稳定性的化合物；和富含正电子发射同位素(如11c、18f、15o和13n)的化合物1，其可用于例如正电子发射断层摄影术(pet)研究。如化学绘图(chemdraw)软件(珀金埃尔默公司(perkinelmer,inc.)，马萨诸塞州剑桥市(cambridge,ma))中所实施，本文根据iupac公约命名本文化学结构。定义当描述本发明的化合物、组合物、方法和工艺时，除非另外指明，否则以下术语具有以下含义。另外，除非使用的情形下另外明确指示，否则如本文所使用，单数形式“一(a/an)”和“所述”包括相应复数形式。术语“包含”、“包括”和“具有”打算是包括性的并且意指可能存在除所列成分外的其它成分。除非另外指明，否则本文所使用的表示成分的量、特性(如分子量、反应条件等)的所有数值都应理解为在所有情况下均由术语“约”修饰。因此，本文中所阐述的数值是可视本发明设法获得的所需特性而变化的近似值。至少并且不试图将等效物原则的应用限于权利要求书的范围，每个数值应至少根据所报道的有效数字并且通过应用一般舍入技术来理解。当用于化合物1的热性能的情形下时，术语“约”定义为±1-3℃。当用于尿中所分泌的化合物1的剂量％的情形下时，术语“约”由通常是标准偏差约两倍或95％信赖区间的半宽的误差限界定。本发明其它部分中的术语“约”可用于指示标准偏差或变化量或一组数值的离差。如本文所用，术语“控制释放”与持续释放和延长释放同义并且涉及经长时段在个体中传递的药物的量。一般来说，控制释放的片剂和胶囊经约8、12、16和24小时的时段将活性化合物释放到个体。另一方面，术语“立即释放”是指活性化合物在通常少于约30分钟的短时段内释放于个体中。术语“延迟释放”是针对片剂和胶囊在设定时段后释放医药剂量。这些剂型通常包覆肠溶衣以防止在胃中释放但允许在肠道中释放。如本文所使用，短语“式”或“具有式”或“具有结构”不打算具有限制性并且以与常用术语“包含”相同的方式使用。举例来说，如果描绘一种结构，那么那么应了解除非另外说明，否则包涵所有立体异构体和互变异构体形式。一般来说，在描述药物固体时，术语“(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-乙氧基-2-氧代乙酰氨基)-2-(羟甲基)-2-甲基戊酸钙”意指约2:1化学计量的量的化合物1的羧酸根阴离子与钙相对离子。术语化合物1的半钙盐等效于化合物1的钙盐。在本发明的一个实施例中，化合物1'的结晶形式是非吸湿性固体。如本文所用，术语“熔点”意指通过差示扫描热量测定对于对应于固液变化的热转化观察到最大吸热热流的温度。术语“药学上可接受”是指当在本发明中使用时，物质不为生物学上不可接受或在其它方面不可接受。举例来说，术语“药学上可接受的载剂”是指可并入组合物中并且向患者投与而不引起不可接受的生物作用或以不可接受的方式与组合物的其它组分相互作用的材料。这类药学上可接受的材料通常符合毒理学和制造测试的所需标准，并且包括由美国食品和药物管理局(u.s.foodanddrugadministration)鉴别为适合非活性成分的材料。术语“药学上可接受的盐”意指由碱或酸制备的投与患者(如哺乳动物)可接受的盐(例如对给定剂量方案具有可接受的哺乳动物安全性的盐)。然而，应了解由本发明所涵盖的盐不必需是药学上可接受的盐，如不打算用于向患者投与的中间化合物的盐。药学上可接受的盐可衍生自药学上可接受的无机碱或有机碱和药学上可接受的无机酸或有机酸。另外，当化合物含有碱性部分(如胺、吡啶或咪唑)和酸性部分(如羧酸或四唑)时，可形成两性离子，并且包括在如本文所使用的术语“盐”内。衍生自药学上可接受的无机碱的盐包括铵盐、钙盐、铜盐、正铁盐、亚铁盐、锂盐、镁盐、六价锰盐、二价锰盐、钾盐、钠盐和锌盐等。衍生自药学上可接受的有机碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺的盐，包括被取代的胺、环状胺、天然产生的胺等，如精氨酸、甜菜碱、咖啡因、胆碱、n,n'-二苯甲基乙二胺、二乙胺、2-二乙氨基乙醇、2-二甲氨基乙醇、乙醇胺、乙二胺、n-乙基吗啉、n-乙基哌啶、还原葡糖胺、葡糖胺、组氨酸、海卓胺、异丙胺、赖氨酸、甲基还原葡糖胺、吗啉、哌嗪、哌啶、聚胺树脂、普鲁卡因(procaine)、嘌呤、可可豆碱、三乙胺、三甲胺、三丙胺、缓血酸胺等。衍生自药学上可接受的无机酸的盐包括以下的盐：硼酸、碳酸、氢卤酸(氢溴酸、盐酸、氢氟酸或氢碘酸)、硝酸、磷酸、胺磺酸和硫酸。衍生自药学上可接受的有机酸的盐包括以下的盐：脂肪族羟基酸(例如柠檬酸、葡萄糖酸、乙醇酸、乳酸、乳糖酸、苹果酸和酒石酸)、脂肪族单羧酸(例如乙酸、丁酸、甲酸、丙酸和三氟乙酸)、氨基酸(例如天冬氨酸和谷氨酸)、芳香族羧酸(例如苯甲酸、对氯苯甲酸、二苯基乙酸、龙胆酸、马尿酸和三苯基乙酸)、芳香族羟基酸(例如邻羟基苯甲酸、对羟基苯甲酸、1-羟基萘-2-甲酸和3-羟基萘-2-甲酸)、抗坏血酸、二羧酸(例如富马酸、马来酸、草酸和丁二酸)、葡萄糖醛酸、扁桃酸、粘液酸、烟碱酸、乳清酸、双羟萘酸、泛酸、磺酸(例如苯磺酸、樟脑磺酸、亚乙基二磺酸、乙磺酸、羟乙基磺酸、甲磺酸、萘磺酸、萘-1,5-二磺酸、萘-2,6-二磺酸和对甲苯磺酸)、辛那酸(xinafoicacid)等。术语“治疗有效量”意指在向有需要的患者投与时足以实现治疗的量，即是获得所需治疗效果所需要的药物量。举例来说，用于治疗高血压的治疗有效量是例如减轻、抑制、消除或预防高血压的症状或治疗高血压的潜在原因所需要的化合物量。在一个实施例中，治疗有效量是降低血压所需的药物量或维持正常血压所需的药物量。另一方面，术语“有效量”意指足以获得所需结果(可不必是治疗结果)的量。举例来说，当研究包含nep酶的系统时，“有效量”可以是抑制所述酶所需的量。如本文中用，术语“治疗(treating/treatment)”意指治疗患者(如哺乳动物，尤其人类)的疾病或医学病状(如高血压)，其包括以下中的一或多种：(a)预防疾病或医学病状出现，即预防疾病或医学病状复发或预防性处理易患所述疾病或医学病状的患者；(b)改善疾病或医学病状，即消除患者的疾病或医学病状或使所述疾病或医学病状消退；(c)抑制疾病或医学病状，即减缓或阻止患者的疾病或医学病状的发展；或(d)减轻患者的疾病或医学病状的症状。举例来说，术语“治疗高血压”包括预防高血压出现、改善高血压、抑制高血压和减轻高血压的症状(例如降低血压)。术语“个体”或“患者”打算包括需要治疗或疾病预防，或目前正针对疾病预防进行治疗或治疗特定疾病或医学病状的那些哺乳动物(如人类)，以及其中对结晶化合物进行评估或用于分析的测试个体(例如动物模型)。本文中所使用的所有其它术语均打算具有其相关领域的普通技术人员所理解的其普通含义。通用合成程序化合物1和其结晶钙盐形式可由容易获得的起始物质如下文和实例中所述合成。应了解，当给定典型或优选方法条件(即反应温度、时间、反应物的摩尔比率、溶剂、压力等)时，除非另外说明，否则也可使用其它方法条件。应了解，当给特定方法条件(即结晶温度、时间、反应物的摩尔比率、溶剂、压力等)时，除非另外说明，否则也可使用其它方法条件。在一些情况下，在室温下进行反应或结晶，并且不进行实际温度测量。应了解，室温可意指在通常与实验室环境中的环境温度相关的范围内的温度，并且通常在约15℃到约30℃(如约20℃到约25℃)范围内。在其它情况下，在室温下进行反应或结晶，并且实际上测量并记录温度。本发明方法中所述的任何摩尔比可通过可供所属领域的技术人员使用的各种方法容易地确定。举例来说，这类摩尔比可通过1hnmr容易地确定。或者，可使用元素分析和hplc方法测定摩尔比。在一个实施例中，本发明涉及(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-4-(乙氧基草酰基氨基)-2-羟甲基-2-甲基戊酸(1)或其药学上可接受的盐。在另一实施例中，化合物1可通过以下步骤制备：混合乙醇与草酰氯以形成溶液，使(2s,4r)-4-氨基-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-2-羟甲基-2-甲基戊酸苯甲酯与溶液反应并且在氢气下组合所得混合物与钯/碳。在另一实施例中，化合物1可通过以下步骤制备：(a)将乙醇溶解于二氯甲烷中；(b)添加草酰氯以形成溶液并且在室温下搅拌；(c)从溶液中蒸发溶剂；(d)向最初溶解于二氯甲烷中的(2s,4r)-4-氨基-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-2-羟甲基-2-甲基戊酸苯甲酯中添加剩余溶液；(e)添加n,n-二异丙基乙胺并且在室温下搅拌；(f)蒸发溶剂以形成固体；(g)于溶剂中组合固体与10wt％钯/碳以形成混合物；(h)在搅拌下将混合物置于氢气下；和(i)滤出钯/碳并且真空干燥以形成固体化合物1。步骤(f)和(i)中的所得固体也可通过色谱纯化。通常在适合惰性稀释剂中进行化合物1的结晶半钙盐的制备，惰性稀释剂的实例包括(但不限于)丙酮、乙腈、乙酸乙酯、甲基乙基酮、甲醇、乙醇、异丙醇、异丁醇、二氯甲烷、甲基叔丁基醚、环戊基甲基醚、己烷等和其混合物，其任选地含有水。惰性稀释剂的混合物(也称为溶剂系统)包括丙酮与水、乙腈与水、乙醇与乙酸乙酯、乙酸乙酯与己烷和低级醇(c1-6烷基-oh)与水，例如甲醇与水和异丙醇与水。尤其适合溶剂系统包括含有丙酸钙或其它钙盐的乙醇、乙醇:水和乙酸乙酯:乙醇。完成结晶后，可通过任何常规方法使结晶化合物从反应混合物中分离，如沉淀、过滤、浓缩、离心、在真空中干燥等。在一个实施例中，本发明涉及(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-4-(乙氧基草酰基氨基)-2-羟甲基-2-甲基戊酸的结晶形式。在另一实施例中，结晶形式是(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-乙氧基-2-氧代乙酰氨基)-2-(羟甲基)-2-甲基戊酸钙(1')。在另一实施例中，结晶形式1'可通过如下方法制备：(a)将(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-4-(乙氧基草酰基氨基)-2-羟甲基-2-甲基戊酸溶解于乙醇和n,n-二异丙基乙胺中以形成溶液a；(b)将三氟甲烷磺酸钙溶解于乙醇中以形成溶液b；(c)向溶液a中逐滴添加溶液b以形成浆液；(d)在室温下搅拌；和(e)分离所得固体，得到化合物1'。另一实施例包括第二结晶步骤。此处，第二再结晶方法进一步包含(f)冷却化合物1'到约5℃并且在剧烈搅拌下添加冷乙醇:水混合物；和(g)过滤并且在室温下干燥，得到化合物1'。结晶特性如粉末x射线衍射(pxrd)分析领域所熟知，pxrd图案的相对峰高取决于与样品制备和仪器几何模式有关的多个因素，而峰位置对实验细节相对不灵敏。如本文所述进行pxrd、差示扫描热量测定(dsc)、热解重量分析(tga)和动态湿气吸附(dms)评定(也称为湿气吸附-解吸附分析)。在一个方面中，本发明涉及结晶形式的(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-4-(乙氧基草酰基氨基)-2-羟甲基-2-甲基戊酸。在另一方面中，结晶形式是(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-乙氧基-2-氧代乙酰氨基)-2-(羟甲基)-2-甲基戊酸钙(1')。这一结晶形式1'通过pxrd图案表征，其中峰位置基本上符合图1所示。以面积计相对强度大于0.1％的峰列于下表中。这一图案展示2θ在3-25°范围内的尖锐衍射峰。*2θ值以值±0.20形式报道。因此，在一个实施例中，结晶形式1'通过7.18±0.2、7.38±0.2和7.97±0.2的2θ值处包含衍射峰的pxrd图案表征。在另一实施例中，结晶形式1'通过3.98±0.2、5.00±0.2、7.18±0.2、7.38±0.2、7.97±0.2、8.87±0.2和10.91±0.2的2θ值处包含衍射峰的pxrd图案表征。在另一实施例中，结晶形式1'进一步通过选自3.47±0.2、9.99±0.2、15.74±0.2、15.98±0.2和18.98±0.2的2θ值处具有一或多个其它衍射峰表征；并且在另一实施例中，结晶形式1'进一步通过具有三个或多于三个这类其它衍射峰表征。在一个实施例中，结晶形式1'通过基本上符合图2中所示的dsc热分析图表征。结晶形式1'通过以每分钟10℃的加热速率记录的dsc迹线表征，所述dsc迹线展示在约237℃到约241℃的温度下具有吸热热流的最大值。dsc热分析图说明熔融吸热线，其中峰在约239℃处，在233℃下开始，并且焓是约67j/g。第二吸热线体现分解和其它未知热事件。在一个实施例中，结晶形式1'通过图3中的tga图表征。tga图展示在约225℃的温度下开始分解。结晶化合物在熔融后分解，如约250℃后显著重量减轻所见，其也对应于dsc迹线中的第二吸热线。在一个实施例中，结晶形式1'通过图4中的dms等温线表征。这种形式是非吸湿性固体。在暴露于5％到90％相对湿度时观察到的总湿气增加小于1重量％。连续吸附-解吸附循环之间未发现显著滞后。吸附-解吸附循环后获得的固体展示与起始物质相同的pxrd图案，指示这个实验后无形式变化。结晶形式1'可通过图5中的plm图像表征，其展示这种形式是薄双折射晶体。也制备l-精氨酸(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-乙氧基-2-氧代乙酰氨基)-2-(羟甲基)-2-甲基戊酸盐(1″)的晶体。然而，这些晶体暴露于环境条件会引起缓慢潮解。结晶形式1″分别通过图6和7中的pxrd和dsc迹线表征。以每分钟10℃的加热速率记录dsc迹线并且其展示在约113℃到约117℃的温度下具有吸热热流最大值。dsc热分析图说明熔融吸热线，其中峰在约116.9℃处，在106.8℃下开始，并且焓是约70.3j/g。结晶形式1″也通过图8中的tga图表征，其中直到140℃观察到约6.5％重量减轻并且在140℃后继续观察到质量损失。结晶形式1″可通过图9中的plm图像表征，其展示这种形式是薄双折射晶体。效用持续进行个体中药物性能的活体外到活体内外推以进行改良(参见例如千叶(chiba)等人,aaps杂志(aapsj.),2009年6月；11(2):262-276)。在本发明中，评定活体外人类脑啡肽酶抑制剂活性(分析1)以测定化合物1的脑啡肽酶抑制活性。对于这种化合物，符合阈值pki≥9.0。然而，进一步进行其它活体内实验以更精确地预测化合物1在个体中的性能。评估前药的适用性的关键参数是确定前药转化为活性剂或活性代谢物的快速程度。在本发明中，作为酯前药的化合物1通过可具有高度物种依赖性的酶促反应(例如酯酶水解)转化为活性剂或活性代谢物比较化合物c2。出于所述原因，在向人类个体外推时优选在多个物种中评估转化速率。另外，有数种特性适用于评估是否足量的药物传递到血浆以达成所要治疗益处，例如对于具有受损的肾功能的个体，高口服生物可用性和低肾清除率。对于本发明，在大鼠、犬和猴物种中进行口服和静脉内药物动力学研究以测定相较于活性代谢物比较化合物c2化合物1的口服生物可用性(分析2)。另外，在大鼠和犬物种中进行口服和静脉内药物动力学研究以比较化合物1与其它化学类似酯前药或化合物(分析3)。化合物1抑制nep酶，因此预期适用于治疗和/或预防对nep抑制起反应的医学病状。因此，预期罹患通过抑制nep酶或通过增加其肽底物的含量而治疗的疾病或病症的患者可通过投与治疗有效量的化合物1来治疗。举例来说，预期化合物1通过抑制nep来增强由nep代谢的内源性肽的生物学作用，所述内源性肽如利钠肽、铃蟾素、舒缓素、降钙素、内皮素(endothelin)、脑啡肽、神经调压素、p物质和血管活性肠肽。因此，预期这种化合物例如对肾系统、中枢神经系统、生殖系统和胃肠系统具有其它生理作用。通过通常分类为分泌和生物转化的各种消除方法从个体体内去除药物。分泌涉及主要通过肾(肾脏)到膀胱到尿去除完整非挥发性药物，而其它分泌路径包括胆汁(肝脏)、汗液、唾液、乳汁(经由泌乳)或其它体液。挥发性药物(如醇和气体麻醉剂)经由肺分泌到呼出的气体中。另一方面，生物转化或药物代谢涉及药物在体内化学转化为代谢物并且通常是酶促过程。除此以外，药物以非酶促方式发生化学变化，例如酯水解。参与药物的生物转化的酶主要位于肝脏中。其它组织(如肾脏、肺、小肠和皮肤)也含有代谢酶。药物动力学研究也可用于研究个体的消除路径，例如经由随时间在尿中分泌所投与的药物获得的肾清除率。进行化合物1在犬模型中的肾分泌以评定作为消除路径的肾脏分泌(分析4)。这个消除路径对于具有受损的肾功能并且需要最低限度地通过肾脏分泌清除的疗法的个体很重要。在一个实施例中，个体中化合物1或其结晶形式经24小时的肾分泌是所投与剂量的约≤15％、≤10％、≤5％、≤3％、≤2％、≤1％或≤0.5％。如以下分析部分中所述，活体外nep酶分析中和多种动物物种中口服生物可用性和肾分泌的活体内测定中包括化合物1以及类似化学结构的比较化合物。意外地，观察到显著结果差异。尽管在一或多个分析中个别比较化合物展现类似于化合物1的特性，但同时仅化合物1展现高人类脑啡肽酶抑制活性、高口服生物可用性和低肾分泌，其有望在疾病治疗中产生特定效用。另外，为有效使用化合物1作为治疗剂，需要这种化合物的固态形式可容易地制造并且具有可接受的化学和物理稳定性，包括高熔点。化合物1的游离酸的晶体不可获得。最终制得化合物1的精氨酸和钙晶体，但精氨酸晶体在环境条件下易潮解并且难以进一步开发。另一方面，钙晶体是稳定的并且在约239℃下熔融并且可作为治疗剂用于进一步开发。心血管疾病预期化合物1通过增强血管活性肽(如利钠肽和缓激肽)的作用而适用于治疗和/或预防医学病状(如心血管疾病)。参见例如罗雷(roques)等人,(1993)药理学评论(pharmacol.rev).45:87-146和登普西(dempsey)等人,(2009)美国病理学杂志(amer.j.ofpathology)174(3):782-796。备受关注的心血管疾病包括高血压和心脏衰竭。高血压包括(以说明而非限制的方式)：原发性高血压，也称为原发性高血压或特发性高血压；继发性高血压；伴随有肾病的高血压；伴随有或不伴随有肾病的重度高血压；肺高血压，包括肺动脉高血压；和顽固性高血压。心脏衰竭包括(以说明而非限制的方式))：充血性心脏衰竭；急性心脏衰竭；慢性心脏衰竭，例如伴随有左心室射血分数降低的心脏衰竭(也称为收缩性心脏衰竭)或伴随有左心室射血分数保持的心脏衰竭(也称为舒张性心脏衰竭)；以及急性和慢性代偿失调性心脏衰竭。因此，本发明的一个实施例涉及一种用于治疗高血压、尤其原发性高血压或肺动脉高血压的方法，其包含向患者投与治疗有效量的化合物1。为治疗原发性高血压，治疗有效量通常是足以降低患者血压的量。其包括轻度到中度高血压和重度高血压。当用于治疗高血压时，化合物1可与其它治疗剂组合投与，所述其它治疗剂如醛固酮拮抗剂、醛固酮合成酶抑制剂、血管紧张素转化酶抑制剂和双重作用血管紧张素转化酶/脑啡肽酶抑制剂、血管紧张素转化酶2(ace2)活化剂和刺激剂、血管紧张素-ii疫苗、抗糖尿病剂、抗脂质剂、抗血栓形成剂、at1受体拮抗剂和双重作用at1受体拮抗剂/脑啡肽酶抑制剂、β1-肾上腺素激导性受体拮抗剂、双重作用β-肾上腺素激导性受体拮抗剂/α1-受体拮抗剂、钙通道阻断剂、利尿剂、内皮素受体拮抗剂、内皮素转化酶抑制剂、脑啡肽酶抑制剂、利钠肽等、利钠肽清除受体拮抗剂、氧化氮供体、非类固醇抗发炎剂、磷酸二酯酶抑制剂(尤其pde-v抑制剂)、前列腺素受体促效剂、肾素抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂和活化剂和其组合。在本发明的一个特定实施例中，本发明化合物与at1受体拮抗剂、钙通道阻断剂、利尿剂或其组合组合，并且用于治疗原发性高血压。在本发明的另一特定实施例中，本发明化合物与at1受体拮抗剂组合，并且用于治疗伴随有肾病的高血压。当用于治疗顽固性高血压时，所述化合物可以与如醛固酮合成酶抑制剂的其它治疗剂组合投与。为治疗肺动脉高血压，治疗有效量通常是足以降低肺血管阻力的量。疗法的其它目标是改良患者的运动能力。举例来说，在临床环境中，治疗有效量可以是改良患者舒适步行6分钟的时间段(涵盖约20-40米的距离)的能力的量。当用于治疗肺动脉高血压时，化合物可与其它治疗剂组合投与，所述其它治疗剂如α-肾上腺素激导性受体拮抗剂、β1-肾上腺素激导性受体拮抗剂、β2-肾上腺素激导性受体促效剂、血管紧张素转化酶抑制剂、抗凝剂、钙通道阻断剂、利尿剂、内皮素受体拮抗剂、pde-v抑制剂、前列腺素类似物、选择性血清素再吸收抑制剂和其组合。在本发明的一个特定实施例中，化合物1与pde-v抑制剂或选择性血清素再吸收抑制剂组合，并且用于治疗肺动脉高血压。本发明的另一实施例涉及一种用于治疗心脏衰竭、尤其充血性心脏衰竭(包括收缩性和舒张性充血性心脏衰竭)的方法，其包含向患者投与治疗有效量的化合物1。通常，治疗有效量是足以降低血压和/或改良肾功能的量。在临床环境中，治疗有效量可以是足以改良心脏血流动力学，例如降低楔压、右心房压、填充压和血管阻力的量。在一个实施例中，化合物1以静脉内剂型投与。当用于治疗心脏衰竭时，化合物可以与其它治疗剂组合投与，所述其它治疗剂如腺苷受体拮抗剂、晚期糖基化终点产物裂解剂、醛固酮拮抗剂、at1受体拮抗剂、β1-肾上腺素激导性受体拮抗剂、双重作用β-肾上腺素激导性受体拮抗剂/α1-受体拮抗剂、凝乳酶抑制剂、地高辛(digoxin)、利尿剂、内皮素转化酶(ece)抑制剂、内皮素受体拮抗剂、利钠肽等、利钠肽清除受体拮抗剂、氧化氮供体、前列腺素类似物、pde-v抑制剂、可溶性鸟苷酸环化酶活化剂和刺激剂和血管加压素受体拮抗剂。在本发明的一个特定实施例中，化合物1与醛固酮拮抗剂、β1-肾上腺素激导性受体拮抗剂、at1受体拮抗剂或利尿剂组合，并且用于治疗充血性心脏衰竭。腹泻预期化合物1作为nep抑制剂抑制内源性脑啡肽的降解，并且因此，这类化合物也可适用于治疗腹泻，包括传染性和分泌性/水性腹泻。参见例如鲍默(baumer)等人,(1992)肠道(gut)33:753-758；法新(farthing)(2006)消化疾病(digestivediseases)24:47-58；和马尔赛-科利亚多(1987)欧洲药理学杂志(eur.j.pharmacol).144(2):125-132。当用于治疗腹泻时，化合物1可与一或多种其它止泻剂组合。肾病预期化合物1通过增强血管活性肽(如利尿钠肽和缓激肽)的作用来增强肾功能(参见陈(chen)等人,(1999)循环(circulation)100:2443-2448；利普金(lipkin)等人,(1997)国际肾脏病杂志(kidneyint.)52:792-801；和迪索勒(dussaule)等人,(1993)临床科学(clin.sci.)84:31-39)，并且适用于治疗和/或预防肾受损个体的肾病。备受关注的肾病包括糖尿病性肾病、慢性肾病、蛋白尿，并且尤其包括急性肾脏损伤(例如由心血管手术、化学疗法或在医学成像中使用造影染料引起)或急性肾衰竭(参见沙库娃(sharkovska)等人,(2011)临床实验室(clin.lab.)57:507-515和纽瓦兹(newaz)等人,(2010)肾衰竭(renalfailure)32:384-390)。患有慢性肾病(ckd)的肾受损个体可根据国立肾脏基金会肾病预后质量倡议(nationalkidneyfoundationkidneydiseaseoutcomesqualityinitiative，nkfkdoqi)准则分级。确定慢性肾病后，即肾脏破坏或肾小球滤过率(gfr)<60ml/min/1.73m2≥3个月，疾病的阶段可根据kdoqickd分类指定。其包括第1阶段(gfr正常或增加的肾脏破坏)：gfr≥90；第2阶段(gfr轻度降低的肾脏破坏)：gfr60-89；第3阶段(gfr中等降低)：gfr30-59；第4阶段(gfr严重降低)：gfr15-29；和第5阶段(肾衰竭)：gfr<15(或透析)。gfr以单位ml/min/1.73m2定义。一个实施例包括一种治疗肾受损个体的方法，其包含投与治疗有效量的化合物1或其结晶形式，尤其结晶形式1'。这种方法进一步包括治疗患有高血压或心脏衰竭的肾受损个体。在用于治疗肾病时，化合物1或其结晶形式、尤其结晶形式1'可与其它治疗剂(如血管收缩素转化酶抑制剂、at1受体拮抗剂和利尿剂)组合投与。另一实施例包括一种治疗患有肾小球滤过率估算值(egfr)在60ml/min/1.73m2到15ml/min/1.73m2之间的慢性肾病的肾受损个体的方法，其包含投与患者治疗有效量的化合物1或其结晶形式，尤其结晶形式1'。另一实施例包括一种治疗患有肾小球滤过率估算值(egfr)≥90ml/min/1.73m2(第1阶段)或egfr<15ml/min/1.73m2(第5阶段)的慢性肾病的肾受损个体的方法，其包含投与患者治疗有效量的化合物1或其结晶形式，尤其结晶形式1'。以本发明目的来说，严重肾病归类为egfr<30ml/min/1.73m2。在另一实施例中，包括一种用化合物1或其结晶形式、尤其结晶形式1'治疗患有归类为第1阶段、第2阶段、第3阶段、第4阶段、第5阶段或覆盖这些阶段中的一或多个的egfr范围的慢性肾病的肾受损个体的方法。预防性疗法也预期化合物1通过增强利钠肽的作用而可适用于预防性疗法，由于所述利钠肽的抗肥厚性和抗纤维化性作用(参见普特(potter)等人,(2009)实验药理学手册(handbookofexperimentalpharmacology)191:341-366)，所述预防性疗法例如在心肌梗塞之后预防心机能不全的进展、在血管成形术之后预防动脉再狭窄、在血管手术之后预防血管壁变厚、预防动脉粥样硬化并且预防糖尿病性血管病。青光眼预期化合物1通过增强利钠肽的作用而可适用于治疗青光眼。参见例如狄赛特霍斯特(diestelhorst)等人,(1989)国际眼科学(internationalophthalmology)12:99-101。在用于治疗青光眼时，化合物1可与一或多种其它抗青光眼剂组合。疼痛缓解预期化合物1作为nep抑制剂可抑制内源性脑啡肽的降解，并且因此，这类化合物也可适用作镇痛剂。参见例如罗雷等人,(1980)自然(nature)288:286-288和坦纳瓦拉(thanawala)等人,(2008)当代药物靶体(currentdrugtargets)9:887-894。当用于治疗疼痛时，化合物1可与一或多种其它止痛药物组合，所述止痛药物如氨基肽酶n或二肽基肽酶iii抑制剂、非类固醇抗发炎剂、单胺再吸收抑制剂、肌肉松弛剂、nmda受体拮抗剂、类鸦片受体促效剂、5-ht1d血清素受体促效剂和三环抗抑郁剂。其它效用也预期化合物1由于其nep抑制特性而适用作止咳剂，以及适用于治疗伴随有肝硬化的门静脉血压过高(参见桑塞(sansoe)等人,(2005)肝脏病学杂志(j.hepatol.)43:791-798)、癌症(参见维塞利(vesely)(2005)调查医学杂志(j.investigativemed.)53:360-365)、抑郁症(参见洛伯(noble)等人,(2007)治疗目标专家评论(exp.opin.ther.targets)11:145-159)、月经异常、早产、子痫前症、子宫内膜异位症、生殖障碍(例如男性和女性不孕症、多囊性卵巢综合症、着床失败)以及男性和女性性功能障碍，包括男性勃起功能障碍和女性性兴奋障碍。更特定地说，预期化合物1适用于治疗女性性功能障碍(参见普赖德(pryde)等人,(2006)医药化学杂志(j.med.chem.)49:4409-4424)，其常被定义为女性患者对性表现很难或者不能满意。这涵盖各种不同女性性功能障碍，包括(以说明而非限制的方式)过低性欲障碍、性兴奋障碍、性高潮障碍和性疼痛障碍。当用于治疗这类病症、尤其女性性功能障碍时，本发明化合物可与一或多种以下第二药剂组合：pde-v抑制剂、多巴胺促效剂、雌激素受体促效剂和/或拮抗剂、雄激素和雌激素。也预期化合物1由于其nep抑制特性而具有消炎特性，并且预期其具有如此效用，尤其在与他汀(statin)组合使用时。近期研究表明，nep在胰岛素缺乏性糖尿病和膳食诱导的肥胖中起调控神经功能的作用。科佩(coppey)等人,(2011)神经药理学(neuropharmacology)60:259-266。因此，也预期化合物1由于其nep抑制特性而适用于防护由糖尿病或膳食诱导的肥胖造成的神经损伤。化合物1每剂投与量或每天投与总量可预先确定，或其可以基于个别患者，通过考虑诸多因素而确定，所述因素包括患者病状的性质和严重程度；所治疗病状；患者的年龄、重量和一般健康状况；患者对活性剂的耐受性；投与途径；药理学考虑因素，如所投与的化合物和任何第二药剂的活性、功效、药代动力学和毒理学量变曲线等。治疗患有疾病或医学病状(如高血压)的患者可以预先确定的剂量或由治疗医师确定的剂量开始，并且持续预防、改善、抑制或缓解疾病或医学病状的症状所必需的时间段。经历这类治疗的患者通常进行常规监测以确定疗法的有效性。举例来说，在治疗高血压中，血压测量值可以用于确定治疗的有效性。本文所述的其它疾病和病状的类似指征是熟知的，并且容易由治疗医师获得。由医师连续监测保证在任何给定时间投与最优量的化合物1，以及促进确定治疗的持续时间。当也投与第二药剂时，这一监测尤其有价值，因为第二药剂的选择、剂量和疗法持续时间也可能需要调节。以这种方式，可在治疗过程中调节治疗方案和给药时程，以投与展现所需有效性的最低量的活性剂或活性代谢物，并且此外，投与仅持续到成功治疗疾病或医学病状即可。化合物1也适用作用于制备化合物1的结晶形式(包括例如结晶形式1')的中间物。研究工具因为化合物1具有nep酶抑制活性，故其也适用作用于调查或研究具有nep酶的生物系统或样品的研究工具，例如以研究nep酶或其肽底物在其中发挥作用的疾病。具有nep酶的任何适合生物系统或样品均可以用于这类研究中，这类研究可在活体外或活体内进行。适用于这类研究的代表性生物系统或样品包括(但不限于)细胞、细胞提取物、质膜、组织样品、分离器官、哺乳动物(如小鼠、大鼠、天竺鼠、兔、犬、猪、人类等)等，其中哺乳动物备受关注。在本发明的一个特定实施例中，哺乳动物中的nep酶活性通过投与nep抑制量的化合物1而受抑制。当用作研究工具时，通常使包含nep酶的生物系统或样品与nep酶抑制量的化合物1接触。在将生物系统或样品暴露于化合物之后，使用常规程序和设备(如通过在结合分析中测量受体结合或在功能性分析中测量配体介导的变化)来测定抑制nep酶的作用。暴露包涵使细胞或组织与化合物接触，例如通过腹膜内、口服、静脉内、皮下或吸入投与等向哺乳动物投与化合物。这一测定步骤可涉及测量响应(定量分析)或可涉及进行观察(定性分析)。测量响应涉及例如使用常规程序和设备(如酶活性分析)以及在功能性分析中测量酶底物或产物介导的变化来测定化合物对生物系统或样品的作用。分析结果可用于确定得到所需结果所必要的化合物的活性程度以及量，即nep酶抑制量。所述确定步骤通常涉及测定抑制nep酶的作用。另外，化合物1可用作用于评估其它化合物的研究工具，并且因此也适用于筛选分析以发现例如具有nep抑制活性的新颖化合物。以这种方式，化合物1在分析中用作标准样品，以比较用测试化合物和化合物1所获得的结果以鉴别具有大致相等或优越活性的测试化合物(如果存在)。举例来说，将一种测试化合物或一组测试化合物的pki数据与化合物1的pki数据进行比较，以鉴别具有所需特性的测试化合物，例如pki值约等于或优于化合物1的测试化合物(如果存在)。本发明的这个方面包括产生比较数据(使用适当分析)与分析测试数据作为各别实施例以鉴别所关注的测试化合物。因此，可在生物分析中通过包含以下步骤的方法评估测试化合物：(a)用测试化合物进行生物分析，得到第一分析值；(b)用化合物1进行生物分析，得到第二分析值；其中步骤(a)在步骤(b)之前、之后或与步骤(b)同时进行；和(c)比较来自步骤(a)的第一分析值与来自步骤(b)的第二分析值。示范性生物分析包括nep酶抑制分析。本发明的再另一方面涉及一种研究包含nep酶的生物系统或样品的方法，所述方法包含(a)使生物系统或样品与化合物1接触；和(b)测定由所述化合物对所述生物系统或样品所引起的作用。医药组合物和调配物化合物1通常以医药组合物或调配物形式向患者投与。这类医药组合物可通过任何可接受投与途径向患者投与，包括(但不限于)口服、经直肠、经阴道、经鼻、吸入、局部(包括经皮)、经眼和肠胃外投与模式。此外，化合物1可以每天多次剂量(例如每天两次、三次或四次)，以单次日剂量或以单次周剂量(例如口服)投与。应了解，适用于特定投与模式的化合物1的任何形式(即，游离碱、游离酸、药学上可接受的盐、溶剂合物等)均可用于本文所述的医药组合物中。因此，在一个实施例中，本发明涉及一种包含药学上可接受的载剂和化合物1的医药组合物。必要时，组合物可含有其它治疗剂和/或调配剂。当论述组合物时，“化合物1”在本文中也可称为“活性剂”，以将其与调配物的其它组分(如载剂)进行区分。因此，应了解术语“活性剂”包括本发明化合物以及其药学上可接受的盐。本发明的医药组合物通常含有治疗有效量的化合物1。然而，所属领域的技术人员应认识到，医药组合物可含有大于治疗有效量(如呈散装组合物形式)或小于治疗有效量(即，经过设计用于多次投与以达成治疗有效量的个别单位剂量)。通常，组合物含有约0.01wt％-95wt％活性剂，包括约0.01wt％-30wt％，如约0.01wt％-10wt％，其中实际量取决于调配物本身、投与途径、给药频率等。在一个实施例中，适用于口服剂型的组合物例如可含有约5wt％-70wt％或约10wt％-60wt％活性剂。任何常规载剂或赋形剂可用于本发明的医药组合物中。特定载剂或赋形剂或载剂或赋形剂的组合的选择取决于用于治疗特定患者的投药模式，或医学病状或疾病病况的类型。在这点上，针对特定投药模式制备适合组合物完全处于医药领域的技术人员的范围内。另外，这类组合物中所用的载剂或赋形剂可购得。以进一步说明的方式，常规调配技术描述于雷明顿：医药科学和实践(remington:thescienceandpracticeofpharmacy),第20版,利平科特威廉姆斯和维尔金斯出版社(lippincottwilliams&white),巴尔的摩(baltimore),马里兰州(maryland)(2000)；和h.c.安塞尔(h.c.ansel)等人,医药剂型和药物递送系统(pharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems),第7版,利平科特威廉姆斯和维尔金斯出版社,巴尔的摩,马里兰州(1999)中。可用作药学上可接受的载剂的材料的代表性实例包括(但不限于)以下：糖，如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素，如微晶纤维素和其衍生物，如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；脂肪酸盐，如硬脂酸镁；粉末状黄蓍；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，如可可豆油和栓剂蜡；油，如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇，如丙二醇；多元醇，如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原质水；等张生理食盐水；林格氏溶液(ringer'ssolution)；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；压缩推进剂气体，如氯氟碳化物和氢氟碳化物；和医药组合物中所采用的其它无毒相容物质。在本发明的一个实施例中，药学上可接受的载剂是硬脂酸镁。举例来说，医药组合物可包含化合物1或结晶形式1'和硬脂酸镁，化合物1或结晶形式1'与硬脂酸镁的比率是约3:1到约10:1。化合物1或结晶形式1'与硬脂酸镁的其它比率包括(但不限于)1:1、5:1、15:1、20:1、25:1、30:1和50:1。通常通过将活性剂与药学上可接受的载剂和一或多种任选的成分充分并且紧密地混合或掺合来制备医药组合物。所得均匀掺合混合物可接着使用常规程序和设备来成形或装入片剂、胶囊、丸剂、罐、筒、分配器等中。在一个实施例中，医药组合物适用于口服投药。适合用于口服投药的组合物可呈以下形式：胶囊、片剂、丸剂、口含锭、扁囊剂、糖衣药丸、粉末、颗粒；在水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；水包油或油包水液体乳剂；酏剂或糖浆等；各自含有预定量的活性剂。当打算以固体剂型(胶囊、片剂、丸剂等)用于口服投药时，组合物通常包含活性剂和一或多种药学上可接受的载剂，如柠檬酸钠或磷酸二钙或硬脂酸镁。固体剂型也可包含：填充剂或增量剂，如淀粉、微晶纤维素、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露糖醇和/或硅酸；粘合剂，如羧甲基纤维素、海藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯胶；保湿剂，如甘油；崩解剂，如琼脂、碳酸钙、马铃薯或木薯淀粉、海藻酸、某些硅酸盐和/或碳酸钠；溶解延迟剂，如石蜡；吸收促进剂，如季铵化合物；湿润剂，如鲸蜡醇和/或单硬脂酸甘油酯；吸附剂，如高岭土和/或膨润土；润滑剂，如滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、月桂基硫酸钠和/或其混合物；着色剂；和缓冲剂。出于本发明的目的，术语“药学上可接受的载剂”包括如上述载剂、填充剂或增量剂、粘合剂、保湿剂、溶解延迟剂、湿润剂、吸收剂、润滑剂、着色剂和缓冲剂的所有术语。释放剂、湿润剂、包衣剂、甜味剂、调味剂和芳香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于医药组合物中。用于片剂、胶囊、丸剂等的示范性包衣剂包括用于肠溶衣的那些包衣剂，如邻苯二甲酸乙酸纤维素、聚邻苯二甲酸乙酸乙烯酯、邻苯二甲酸羟丙基甲基纤维素、甲基丙烯酸-甲基丙烯酸酯共聚物、偏苯三甲酸乙酸纤维素、羧甲基乙基纤维素、丁二酸乙酸羟丙基甲基纤维素等。药学上可接受的抗氧化剂的实例包括：水溶性抗氧化剂，如抗坏血酸、半胱氨酸盐酸盐、硫酸氢钠、偏亚硫酸钠、亚硫酸钠等；油溶性抗氧化剂，如棕榈酸抗坏血酸酯、丁基化羟基大茴香醚、丁基化羟基甲苯、卵磷脂、没食子酸丙酯、α-生育酚等；和金属螯合剂，如柠檬酸、乙二胺四乙酸、山梨糖醇、酒石酸、磷酸等。组合物也可使用例如不同比例的羟丙基甲基纤维素或其它聚合物基质、脂质体和/或微球体来加以调配，以提供活性剂的缓慢或控制释放。另外，本发明的医药组合物可含有乳浊剂，并且可经过调配以使得其仅在或优先在胃肠道的某些部分中释放活性剂，任选地以延迟方式释放。可使用的包埋组合物的实例包括聚合物质和蜡。活性剂也可呈微囊封形式，任选地与一或多种上文所描述的赋形剂一起。本发明的一个实施例包括一种呈胶囊、片剂、液体或悬浮液形式的口服剂型，其包含化合物1或结晶形式1'。本发明的另一实施例涉及一种口服剂型，其中个体中化合物1或结晶形式1'的释放是立即、受控或延迟释放。如果使用胶囊作为口服剂型，那么另一实施例包括包含明胶、多糖或合成聚合物的胶囊。在一特定实施例中，胶囊包含羟丙基甲基纤维素。本发明的适合胶囊材料选自明胶、纤维素衍生物、淀粉、淀粉衍生物、几丁聚糖和合成塑料。如果明胶用作胶囊材料，那么其可与选自聚乙二醇(peg)、甘油、山梨糖醇、聚丙二醇、peo-ppo嵌段共聚物和其它多元醇和聚醚的其它添加剂混合使用。在纤维素衍生物用作胶囊材料时，羟丙基甲基纤维素、羟丙基纤维素、甲基纤维素、羟甲基纤维素和羟乙基纤维素是优选聚合物。如果合成塑料用作胶囊材料，那么聚乙烯、聚碳酸酯、聚酯、聚丙烯和聚对苯二甲酸乙二酯是优选材料。尤其优选的是聚乙烯、聚碳酸酯或聚对苯二甲酸乙二酯。适合用于口服投药的液体剂型(以说明的方式)包括药学上可接受的乳液、微乳液、溶液、悬浮液、糖浆和酏剂。液体剂型通常包含活性剂和惰性稀释剂(如水)或其它溶剂、增溶剂和乳化剂，如乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苯甲酯、丙二醇、1,3-丁二醇、油(例如棉籽油、花生油、玉米油、胚芽油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油)、甘油、四氢呋喃醇、聚乙二醇、和脱水山梨糖醇的脂肪酸酯和其混合物。悬浮液可含有悬浮剂，如乙氧基化异硬脂基醇、聚氧化乙烯山梨糖醇和脱水山梨糖醇酯、微晶纤维素、偏氢氧化铝、膨润土、琼脂和黄蓍和其混合物。当打算用于口服投药时，本发明的医药组合物可以单位剂型包装。术语“单位剂型”是指适合于向患者给药的物理离散单位，即每个单元单独含有或与一或多个其它单元组合含有经计算可产生所需治疗效果的预定量的活性剂。举例来说，所述单位剂型可以是胶囊、片剂、丸剂等。在另一实施例中，本发明的组合物适合于吸入投与，并且通常呈喷雾剂或粉末形式。一般使用熟知的传递装置(如喷雾器、干粉或定量剂量吸入器)投与这类组合物。喷雾器装置产生高速气流，以使组合物以薄雾形式喷出而携加载患者的呼吸道中。一种示范性喷雾器调配物包含溶解于载剂中以形成溶液的活性剂，或包含经微米尺寸化并且与载剂组合以形成含有可吸入尺寸的微米尺寸化粒子的悬浮液的活性剂。干粉吸入器投与呈自由流动粉末形式的活性剂，所述活性剂在吸气期间分散在患者的气流中。示范性干粉调配物包含与赋形剂(如乳糖、淀粉、甘露糖醇、右旋糖、聚乳酸、聚乳酸交酯-共-乙交酯和其组合)干式掺合的活性剂。定量剂量吸入器使用压缩推进剂气体排出所测量的量的活性剂。示范性定量剂量调配物包含活性剂于液化推进剂(如氯氟碳化物或氢氟烷烃)中的溶液或悬浮液。这类调配物的任选的组分包括共溶剂，如乙醇或戊烷；和表面活性剂，如脱水山梨糖醇三油酸酯、油酸、卵磷脂、甘油和月桂基硫酸钠。这类组合物通常通过向含有活性剂、乙醇(如果存在)和表面活性剂(如果存在)的适合容器中添加经过冷却或经过加压的氢氟烷烃来制备。为制备悬浮液，将活性剂微米尺寸化，随后与推进剂组合。或者，悬浮液调配物可通过喷雾干燥活性剂的微米尺寸化粒子上的表面活性剂包衣来制备。随后将调配物装入气雾剂罐中，所述气雾剂罐形成吸入器的一部分。化合物1和其组合物也可肠胃外(例如通过皮下、静脉内、肌肉内或腹膜内注射)投与。为进行这类投与，活性剂以无菌溶液、悬浮液或乳液形式提供。用于制备这类调配物的示范性溶剂包括水、生理食盐水、电解质、低分子量醇(如丙二醇)和聚乙二醇、油、氨基酸、明胶、糖、脂肪酸酯(如油酸乙酯)等。肠胃外调配物也可含有一或多种抗氧化剂、增溶剂、稳定剂、防腐剂、湿润剂、乳化剂和分散剂。表面活性剂、其它稳定剂或ph调节剂(酸、碱或缓冲剂)和抗氧化剂尤其适用于为调配物提供稳定性以例如使化合物中可能存在的酯和酰胺键的水解减到最少或避免水解。可通过使用无菌可注射介质、灭菌剂、过滤、照射或加热使这些调配物无菌。代表性生理学上可接受的水性载剂包括(例如)注射用无菌水，usp；右旋糖注射，usp(例如2.5、5.0、10、20％右旋糖，包括5％右旋糖注射液(d5/w))；右旋糖和氯化钠注射液，usp(例如2.5到10％变化的右旋糖和0.12(19meq钠)到0.9％(154meq钠)变化的氯化钠)；甘露糖醇注射液，usp(例如5、10、15、20和25％甘露糖醇)；林格氏注射液，usp(例如每升147meq钠、4meq钾、4.5meq钙和156meq氯)；乳酸化林格氏注射液，usp(例如每升2.7meq钙、4meq钾、130meq钠和28meq乳酸根)；氯化钠注射液，usp(例如0.9％氯化钠)等。在投与患者时，化合物1通常以每毫克化合物1约0.5ml到约10ml水性载剂稀释，如每毫克约0.6到约8ml。在一个特定实施例中，肠胃外调配物包含环糊精水溶液作为药学上可接受的载剂。适合环糊精包括含有在1,4位置处通过如在淀粉酶、β-环糊精或环庚淀粉中的键连接的六个或多于六个α-d-葡萄吡喃糖单元的环状分子。示范性环糊精包括环糊精衍生物，如羟丙基环糊精和磺酸基丁醚环糊精，如羟丙基-β-环糊精和磺酸基丁醚β-环糊精。用于这类调配物的示范性缓冲剂包括基于羧酸的缓冲剂，如柠檬酸盐、乳酸盐和马来酸盐缓冲溶液。在本发明的一个实施例中，静脉内剂型包含缓冲溶液中的化合物1或结晶形式1'。在一个实施例中，化合物1或其医药组合物是冻干粉末。通常，冻干粉末是无菌的并且包装在密封小瓶或安瓿或类似容器中。化合物1也可使用已知经皮传递系统和赋形剂来经皮投与。举例来说，化合物1可与渗透增强剂(如丙二醇、聚乙二醇单月桂酸酯、氮杂环-2-酮等)混合，并且并入贴片或类似送递系统中。必要时，可在这类经皮组合物中使用其它赋形剂，包括胶凝剂、乳化剂和缓冲剂。第二药剂化合物1可适用于单独治疗疾病，或可与一或多种其它治疗剂组合以获得所需治疗效果。因此，在一个实施例中，本发明的医药组合物含有与化合物1共同投与的其它药物。举例来说，组合物可进一步包含一或多种药物(也称为“第二药剂”)。这类治疗剂为所属领域所熟知，并且包括腺苷受体拮抗剂、α-肾上腺素激导性受体拮抗剂、β1-肾上腺素激导性受体拮抗剂、β2-肾上腺素激导性受体促效剂、双重作用β-肾上腺素激导性受体拮抗剂/α1-受体拮抗剂、晚期糖基化终点产物裂解剂、醛固酮拮抗剂、醛固酮合成酶抑制剂、氨基肽酶n抑制剂、雄激素、血管紧张素转化酶抑制剂和双重作用血管紧张素转化酶/脑啡肽酶抑制剂、血管紧张素转化酶2活化剂和刺激剂、血管紧张素-ii疫苗、抗凝剂、抗糖尿病剂、止泻剂、抗青光眼剂、抗脂质剂、止痛剂、抗血栓形成剂、at1受体拮抗剂和双重作用at1受体拮抗剂/脑啡肽酶抑制剂和多功能血管紧张素受体阻断剂、缓激肽受体拮抗剂、钙通道阻断剂、凝乳酶抑制剂、地高辛、利尿剂、多巴胺促效剂、内皮素转化酶抑制剂、内皮素受体拮抗剂、hmg-coa还原酶抑制剂、雌激素、雌激素受体促效剂和/或拮抗剂、单胺再吸收抑制剂、肌肉松弛剂、利钠肽等、利钠肽清除受体拮抗剂、脑啡肽酶抑制剂、氧化氮供体、非类固醇抗发炎剂、n-甲基d-天冬氨酸受体拮抗剂、类鸦片受体促效剂、磷酸二酯酶抑制剂、前列腺素类似物、前列腺素受体促效剂、肾素抑制剂、选择性血清素再吸收抑制剂、钠通道阻断剂、可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂和活化剂、三环抗抑郁剂、血管加压素受体拮抗剂和其组合。这些药剂的特定实例详述于本文中。特定实施例包括医药组合物，其包含化合物1或其结晶形式和at1受体拮抗剂、血管收缩素转化酶抑制剂、磷酸二酯酶(pde)抑制剂、肾素抑制剂、利尿剂或其组合和任选的一或多种药学上可接受的载剂。因此，在本发明的另一方面中，医药组合物包含化合物1、第二活性剂和药学上可接受的载剂。第三、第四等活性剂也可包括在组合物中。在组合疗法中，化合物1的投与量以及第二药剂的量可小于单药疗法中通常投与的量。化合物1可与第二活性剂物理混合以形成含有两种药剂的组合物；或每种药剂可存在于各别并且不同的组合物中，所述组合物同时或在各别时间向患者投与。举例来说，可使用常规程序和设备将化合物1与第二活性剂组合，以形成包含化合物1和第二活性剂的活性剂的组合。另外，活性剂可与药学上可接受的载剂组合，以形成包含化合物1、第二活性剂和药学上可接受的载剂的医药组合物。在这个实施例中，通常混合或掺合组合物的组分以产生物理混合物。接着使用本文所述的任何途径以治疗有效量投与所述物理混合物。或者，活性剂可在向患者投与之前保持为各别并且不同的。在这个实施例中，药剂在投与之前不以物理方式混合在一起，而以各别组合物形式同时或在各别时间投与。这类组合物可分开包装或可一起包装在试剂盒中。当在各别时间投与时，第二药剂将通常在投与化合物1之后24小时以内投与，在从与投与化合物1同时到给药后约24小时的范围内的任何时间。这也称为依次投与。因此，化合物1与另一活性剂可使用两种片剂同时或依次口服投药，每种活性剂对应于一种片剂，其中依次可意指在投与化合物1后立即投与，或在某一预定时间后(例如一小时后或三小时后)投与。也预期第二药剂可在投与化合物1之后超过24小时投与。或者，可通过不同投与途径投与组合，即，一种口服投药而另一种通过吸入投与。在一个实施例中，试剂盒包含第一剂型，其包含化合物1；和至少一种其它剂型，其包含本文所阐述的第二药剂中的一或多种，其量足以进行本发明的方法。第一剂型和第二(或第三等)剂型一起包含用于治疗或预防患者的疾病或医学病状的治疗有效量的活性剂。当包括第二药剂时，其以治疗有效量存在以使得当与化合物1共同投与时，其通常投与的量产生治疗学上有益的效果。第二药剂可呈药学上可接受的盐、溶剂合物、光学纯立体异构体等的形式。第二药剂也可呈前药形式，例如具有已酯化的羧酸基的化合物。因此，本文中所列的第二药剂打算包括所有这类形式，并且可购得或可使用常规程序和试剂制备。在一个实施例中，化合物1与腺苷受体拮抗剂组合投与，所述腺苷受体拮抗剂的实例包括那昔茶碱(naxifylline)、罗咯茶碱(rolofylline)、slv-320、茶碱(theophylline)和托纳普茶碱(tonapofylline)。在一个实施例中，化合物1与α-肾上腺素激导性受体拮抗剂组合投与，所述α-肾上腺素激导性受体拮抗剂的实例包括多沙唑嗪(doxazosin)、哌唑嗪(prazosin)、坦索洛新(tamsulosin)和特拉唑嗪(terazosin)。化合物1也可与如下β1-肾上腺素激导性受体拮抗剂(“β1-阻断剂”)组合投与，其实例包括醋丁洛尔(acebutolol)、阿普洛尔(alprenolol)、氨磺洛尔(amosulalol)、阿罗洛尔(arotinolol)、阿替洛尔(atenolol)、苯呋洛尔(befunolol)、倍他洛尔(betaxolol)、贝凡洛尔(bevantolol)、比绍洛尔(bisoprolol)、波吲洛尔(bopindolol)、布新洛尔(bucindolol)、布库洛尔(bucumolol)、布非洛尔(bufetolol)、丁呋洛尔(bufuralol)、布尼洛尔(bunitrolol)、布拉洛尔(bupranolol)、巴布里丁(bubridine)、丁非洛尔(butofilolol)、卡拉洛尔(carazolol)、卡替洛尔(carteolol)、卡维地洛(carvedilol)、塞利洛尔(celiprolol)、塞他洛尔(cetamolol)、氯拉洛尔(cloranolol)、地来洛尔(dilevalol)、依泮洛尔(epanolol)、艾司洛尔(esmolol)、茚诺洛尔(indenolol)、拉贝洛尔(labetolol)、左布诺洛尔(levobunolol)、甲吲洛尔(mepindolol)、美替洛尔(metipranolol)、美托洛尔(metoprolol)(如丁二酸美托洛尔和酒石酸美托洛尔)、莫普洛尔(moprolol)、纳多洛尔(nadolol)、萘肟洛尔(nadoxolol)、奈必洛尔(nebivalol)、尼普地洛(nipradilol)、氧烯洛尔(oxprenolol)、喷布洛尔(penbutolol)、培布洛尔(perbutolol)、品多洛尔(pindolol)、普拉洛尔(practolol)、丙萘洛尔(pronethalol)、普萘洛尔(propranolol)、索他洛尔(sotalol)、硫氧洛尔(sufinalol)、塔林多尔(talindol)、特他洛尔(tertatolol)、替利洛尔(tilisolol)、噻吗洛尔(timolol)、托利洛尔(toliprolol)、希苯洛尔(xibenolol)和其组合。在一个特定实施例中，β1-拮抗剂选自阿替洛尔、比绍洛尔、美托洛尔、普萘洛尔、索他洛尔和其组合。通常，β1-阻断剂的投与量应足以每剂提供约2-900mg。在一个实施例中，化合物1与如下β2-肾上腺素激导性受体促效剂组合投与，其实例包括沙丁胺醇(albuterol)、比托特罗(bitolterol)、非诺特罗(fenoterol)、福莫特罗(formoterol)、茚达特罗(indacaterol)、异他林(isoetharine)、左旋沙丁胺醇(levalbuterol)、间羟异丙肾上腺素(metaproterenol)、吡布特罗(pirbuterol)、羟甲叔丁肾上腺素(salbutamol)、沙甲胺醇(salmefamol)、沙美特罗(salmeterol)、特布他林(terbutaline)、维兰特罗(vilanterol)等。通常，β2-肾上腺素激导性受体促效剂的投与量应足以每剂量提供约0.05-500μg。在一个实施例中，化合物1与如下晚期糖基化终点产物(age)裂解剂组合投与，其实例包括阿拉格布(alagebrium)(或alt-711)和trc4149。在另一实施例中，化合物1与如下醛固酮拮抗剂组合投与，其实例包括依普利酮(eplerenone)、螺内酯(spironolactone)和其组合。通常，醛固酮拮抗剂的投与量应足以提供每天约5-300mg。在一个实施例中，化合物1与如下氨基肽酶n或二肽基肽酶iii抑制剂组合投与，其实例包括苯丁抑制素(bestatin)和pc18(2-氨基-4-甲磺酰基丁硫醇、甲硫氨酸硫醇)。化合物1也可与如下血管紧张素转化酶(ace)抑制剂组合投与，其实例包括阿克普利(accupril)、阿拉普利(alacepril)、贝那普利(benazepril)、贝那普利拉(benazeprilat)、卡托普利(captopril)、西那普利(ceranapril)、西拉普利(cilazapril)、地拉普利(delapril)、依那普利(enalapril)、依那普利拉(enalaprilat)、福辛普利(fosinopril)、福辛普利拉(fosinoprilat)、咪达普利(imidapril)、赖诺普利(lisinopril)、莫西普利(moexipril)、蒙诺普利(monopril)、莫维普利(moveltipril)、喷托普利(pentopril)、培哚普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)、喹那普利拉(quinaprilat)、雷米普利(ramipril)、雷米普利拉(ramiprilat)、乙酸色拉新(saralasinacetate)、螺普利(spirapril)、替莫普利(temocapril)、群多普利(trandolapril)、佐芬普利(zofenopril)和其组合。在一个特定实施例中，ace抑制剂选自：贝那普利、卡托普利、依那普利、赖诺普利、雷米普利以及其组合。通常，ace抑制剂的投与量将足以提供每天约1-150mg。在另一实施例中，化合物1与如下双重作用血管紧张素转化酶/脑啡肽酶(ace/nep)抑制剂组合投与，其实例包括：ave-0848((4s,7s,12br)-7-[3-甲基-2(s)-磺酰基丁酰氨基]-6-氧代-1,2,3,4,6,7,8,12b-八氢吡啶并[2,1-a][2]-苯并氮呯-4-甲酸)；ave-7688(艾尔帕曲(ilepatril))和其母化合物；bms-182657(2-[2-氧代-3(s)-[3-苯基-2(s)-磺酰基丙酰氨基]-2,3,4,5-四氢-1h-1-苯并氮呯-1-基]乙酸)；cgs-35601(n-[1-[4-甲基-2(s)-磺酰基戊酰氨基]环戊基-羰基]-l-色氨酸)；法西多曲(fasidotril)；法西多利拉(fasidotrilate)；依那普利拉；er-32935((3r,6s,9ar)-6-[3(s)-甲基-2(s)-磺酰基戊酰氨基]-5-氧代全氢噻唑并[3,2-a]氮呯-3-甲酸)；杰帕曲拉；mdl-101264((4s,7s,12br)-7-[2(s)-(2-吗啉基乙酰基硫基)-3-苯基丙酰氨基]-6-氧代-1,2,3,4,6,7,8,12b-八氢吡啶并[2,1-a][2]苯并氮呯-4-甲酸)；mdl-101287([4s-[4α,7α(r*),12bβ]]-7-[2-(羧甲基)-3-苯基丙酰氨基]-6-氧代-1,2,3,4,6,7,8,12b-八氢吡啶并[2,1-a][2]苯并氮呯-4-甲酸)；奥马曲拉；rb-105(n-[2(s)-(巯基甲基)-3(r)-苯基丁基]-l-丙氨酸)；山帕曲拉；sa-898((2r,4r)-n-[2-(2-羟基苯基)-3-(3-巯基丙酰基)噻唑啶-4-基羰基]-l-苯丙氨酸)；sch-50690(n-[1(s)-羧基-2-[n2-(甲烷磺酰基)-l-赖氨酰基氨基]乙基]]-l-缬氨酰基-l-酪氨酸)；并且也可包括其组合。在一个特定实施例中，ace/nep抑制剂选自：ave-7688、依那普利拉、法西多曲、法西多利拉、奥马曲拉、山帕曲拉和其组合。在一个实施例中，化合物1与血管紧张素转化酶2(ace2)活化剂或刺激剂组合投与。在一个实施例中，化合物1与如下血管紧张素-ii疫苗组合投与，其实例包括atr12181和cyt006-angqb。在一个实施例中，化合物1与如下抗凝剂组合投与，其实例包括：香豆素，如华法林(warfarin)；肝素；和直接凝血酶抑制剂，如阿加曲班(argatroban)、比伐卢定(bivalirudin)、达比加群(dabigatran)和来匹卢定(lepirudin)。在又另一实施例中，化合物1与如下抗糖尿病剂组合投与，其实例包括可注射药物以及口服有效药物和其组合。可注射药物的实例包括胰岛素和胰岛素衍生物。口服有效药物的实例包括(但不限于)：双胍，如二甲双胍；升糖素拮抗剂；α-葡糖苷酶抑制剂，如阿卡波糖(acarbose)和米格列醇(miglitol)；二肽基肽酶iv抑制剂(dpp-iv抑制剂)，如阿格列汀(alogliptin)、地那列汀(denagliptin)、利拉利汀(linagliptin)、沙格列汀(saxagliptin)、西他列汀(sitagliptin)和维格列汀(vildagliptin)；美格替奈(meglitinide)，如瑞格列奈(repaglinide)；恶二唑啶二酮；磺酰脲，如氯磺丙脲(chlorpropamide)、格列美脲(glimepiride)、格列吡嗪(glipizide)、格列本脲(glyburide)和妥拉磺脲(tolazamide)；噻唑啶二酮，如吡格列酮(pioglitazone)和罗格列酮(rosiglitazone)；和其组合。在另一实施例中，化合物1与止泻治疗组合投与。代表性治疗选项包括口服复水溶液(ors)、洛哌丁胺(loperamide)、苯乙哌啶(diphenoxylate)和次水杨酸铋。在又另一实施例中，化合物1与如下抗青光眼剂组合投与，其实例包括：α-肾上腺素促效剂，如溴莫尼定(brimonidine)；β1-肾上腺素激导性受体拮抗剂；局部β1-阻断剂，如倍他洛尔、左布诺洛尔和噻吗洛尔；碳酸酐酶抑制剂，如乙酰唑胺(acetazolamide)、布尔佐胺(brinzolamide)或多佐胺(dorzolamide)；胆碱能促效剂，如西维美林(cevimeline)和dmxb-假木贼碱(dmxb-anabaseine)；肾上腺素化合物；缩瞳剂，如匹鲁卡品(pilocarpine)；和前列腺素类似物。在又一个实施例中，化合物1与如下抗脂质剂组合投与，其实例包括：胆固醇酯转移蛋白抑制剂(cetp)，如安塞曲匹(anacetrapib)、达塞曲匹(dalcetrapib)和托塞曲匹(torcetrapib)；他汀，如阿托伐他汀(atorvastatin)、氟伐他汀(fluvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)、普伐他汀(pravastatin)、罗素他汀(rosuvastatin)和辛伐他汀(simvastatin)；和其组合。在一个实施例中，化合物1与如下抗血栓形成剂组合投与，其实例包括：阿司匹林(aspirin)；抗血小板剂，如氯吡格雷(clopidogrel)、普拉格雷(prasugrel)和噻氯匹定(ticlopidine)；肝素和其组合。在一个实施例中，化合物1与at1受体拮抗剂(也称为血管紧张素ii1型受体阻断剂(arb))组合。代表性arb包括阿比沙坦(abitesartan)、阿齐沙坦(azilsartan)(例如阿齐沙坦酯(azilsartanmedoxomil))、本洛沙坦(benzyllosartan)、坎地沙坦(candesartan)、坎地沙坦西酯(candesartancilexetil)、依利沙坦(elisartan)、恩布沙坦(embusartan)、依诺他索沙坦(enoltasosartan)、依普罗沙坦(eprosartan)、exp3174、范沙坦(fonsartan)、福拉沙坦(forasartan)、格洛沙坦(glycyllosartan)、厄贝沙坦(irbesartan)、伊索特林(isoteoline)、洛沙坦(losartan)、美度米(medoxomil)、米法沙坦(milfasartan)、奥美沙坦(olmesartan)(例如奥美沙坦美度米(olmesartanmedoxomil))、奥普米沙坦(opomisartan)、普拉沙坦(pratosartan)、利匹沙坦(ripisartan)、沙普立沙坦(saprisartan)、色拉新(saralasin)、萨美新(sarmesin)、tak-591、他索沙坦(tasosartan)、替米沙坦(telmisartan)、缬沙坦(valsartan)、佐拉沙坦(zolasartan)和其组合。在一个特定实施例中，arb选自阿齐沙坦酯、坎地沙坦西酯、依普罗沙坦、厄贝沙坦、洛沙坦、奥美沙坦美度米、沙普立沙坦、他索沙坦、替米沙坦、缬沙坦和其组合。示范性盐和/或前药包括坎地沙坦西酯、甲磺酸依普罗沙坦、洛沙坦钾盐和奥美沙坦美度米。通常，arb以足以提供每剂量约4-600mg的量投与，其中示范性日剂量在每天20-320mg范围内。化合物1也可与如下双重作用药剂(如at1受体拮抗剂/脑啡肽酶抑制剂(arb/nep)抑制剂)组合投与，其实例包括均来自阿莱格雷蒂(allegretti)等人的美国专利第7,879,896号和第8,013,005号中所描述的化合物，如化合物4'-{2-乙氧基-4-乙基-5-[((s)-2-巯基-4-甲基戊酰基氨基)-甲基]咪唑-1-基甲基}-3'-氟联苯-2-甲酸。化合物1也可与如库尔茨(kurtz)和克莱因(klein)(2009)高血压研究(hypertensionresearch)32:826-834中所述的多功能血管紧张素受体阻断剂组合投与。在一个实施例中，化合物1与缓激肽受体拮抗剂(例如艾替班特(icatibant)(hoe-140))组合投与。预期这种组合疗法可提供预防血管性水肿或较高缓激肽水平的其它非所需后果的优点。在一个实施例中，化合物1与如下钙信道阻断剂组合投与，其实例包括氨氯地平(amlodipine)、阿尼帕米(anipamil)、阿拉尼平(aranipine)、巴尼地平(barnidipine)、苄环烷(bencyclane)、贝尼地平(benidipine)、苄普地尔(bepridil)、克仑硫卓(clentiazem)、西尼地平(cilnidipine)、桂利嗪(cinnarizine)、地尔硫卓(diltiazem)、依福地平(efonidipine)、依高地平(elgodipine)、依他苯酮(etafenone)、非洛地平(felodipine)、芬地林(fendiline)、氟桂利嗪(flunarizine)、加洛帕米(gallopamil)、伊拉地平(isradipine)、拉西地平(lacidipine)、乐卡地平(lercanidipine)、利多氟嗪(lidoflazine)、洛美利嗪(lomerizine)、马尼地平(manidipine)、米贝地尔(mibefradil)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼古地平(niguldipine)、尼鲁地平(niludipine)、尼伐地平(nilvadipine)、尼莫地平(nimodipine)、尼索地平(nisoldipine)、尼群地平(nitrendipine)、尼伐尔地平(nivaldipine)、哌克昔林(perhexiline)、普尼拉明(prenylamine)、里奥斯定(ryosidine)、司莫地尔(semotiadil)、特罗地林(terodiline)、泰尔帕米(tiapamil)、维拉帕米(verapamil)和其组合。在一个特定实施例中，钙通道阻断剂选自氨氯地平、苄普地尔、地尔硫卓、非洛地平、伊拉地平、拉西地平、尼卡地平、硝苯地平、尼古地平、尼鲁地平、尼莫地平、尼索地平、里奥斯定、维拉帕米和其组合。通常，钙通道阻断剂以足以提供每剂量约2-500mg的量投与。在一个实施例中，化合物1与如下凝乳酶抑制剂组合投与，如tpc-806和2-(5-甲酰氨基-6-氧代-2-苯基-1,6-二氢嘧啶-1-基)-n-[{3,4-二氧代-1-苯基-7-(2-吡啶氧基)}-2-庚基]乙酰胺(nk3201)。在一个实施例中，化合物1与如下利尿剂组合投与，其实例包括：碳酸酐酶抑制剂，如乙酰唑胺(acetazolamide)和双氯非那胺(dichlorphenamide)；环利尿剂，其包括磺酰胺衍生物(如乙酰唑胺、安布赛特(ambuside)、阿佐塞米(azosemide)、布美他尼(bumetanide)、布他唑胺(butazolamide)、氯米非那胺(chloraminophenamide)、氯非那胺(clofenamide)、氯帕胺(clopamide)、氯索隆(clorexolone)、二磺法胺(disulfamide)、依索唑胺(ethoxolamide)、呋塞米(furosemide)、美夫西特(mefruside)、醋甲唑胺(methazolamide)、吡咯他尼(piretanide)、托拉塞米(torsemide)、曲帕胺(tripamide)和希帕胺(xipamide))以及非磺酰胺利尿剂(如依他尼酸(ethacrynicacid))和其它苯氧基乙酸化合物(如替尼酸(tienilicacid)、茚达立酮(indacrinone)和喹卡酯(quincarbate))；渗透性利尿剂，如甘露糖醇；留钾利尿剂(potassium-sparingdiuretics)，其包括醛固酮拮抗剂(如螺内酯)和na+通道抑制剂(如氨氯吡脒(amiloride)和氨苯喋啶(triamterene))；噻嗪和类噻嗪利尿剂，如阿尔噻嗪(althiazide)、苄氟甲噻嗪(bendroflumethiazide)、苄氢氯噻嗪(benzylhydrochlorothiazide)、苄噻嗪(benzthiazide)、布噻嗪(buthiazide)、氯噻酮(chlorthalidone)、氯噻嗪(chlorothiazide)、环戊噻嗪(cyclopenthiazide)、环噻嗪(cyclothiazide)、依匹噻嗪(epithiazide)、乙噻嗪(ethiazide)、芬喹唑(fenquizone)、氟甲噻嗪(flumethiazide)、氢氯噻嗪(hydrochlorothiazide)、氢氟噻嗪(hydroflumethiazide)、吲达帕胺(indapamide)、甲氯噻嗪(methylclothiazide)、美替克仑(meticrane)、美托拉宗(metolazone)、对氟噻嗪(paraflutizide)、多噻嗪(polythiazide)、喹乙唑酮(quinethazone)、四氯噻嗪(teclothiazide)和三氯噻嗪(trichloromethiazide)；和其组合。在一个特定实施例中，利尿剂选自氨氯吡脒、布美他尼、氯噻嗪、氯噻酮、双氯非那胺、依他尼酸、呋塞米、氢氯噻嗪、氢氟噻嗪、吲达帕胺、甲氯噻嗪、美托拉宗、托拉塞米、氨苯喋啶和其组合。利尿剂以足以提供每天约5-50mg(更通常每天6-25mg)的量投与，其中常见剂量是每天6.25mg、12.5mg或25mg。化合物1也可与如下内皮素转化酶(ece)抑制剂组合投与，其实例包括膦酰二肽、cgs26303和其组合。在一个特定实施例中，化合物1与如下内皮素受体拮抗剂组合投与，其实例包括：影响内皮素a受体的选择性内皮素受体拮抗剂，如阿伏生坦(avosentan)、安立生坦(ambrisentan)、阿曲生坦(atrasentan)、bq-123、克拉生坦(clazosentan)、达卢生坦(darusentan)、西他塞坦(sitaxentan)和齐泊替坦(zibotentan)；和影响内皮素a与b受体的双重内皮素受体拮抗剂，如波生坦(bosentan)、马西替坦(macitentan)和替唑生坦(tezosentan)。在又另一实施例中，化合物1与一或多种hmg-coa还原酶抑制剂(也称为他汀)组合投与。代表性他汀包括(但不限于)阿托伐他汀、氟伐他汀、洛伐他汀、匹伐他汀(pitavastatin)、普伐他汀、罗素他汀和辛伐他汀。在一个实施例中，化合物1与如下单胺再吸收抑制剂组合投与，其实例包括去甲肾上腺素再吸收抑制剂，如阿托莫西汀(atomoxetine)、丁胺苯丙酮(buproprion)和丁胺苯丙酮代谢物羟基丁胺苯丙酮、麦普替林(maprotiline)、瑞波西汀(reboxetine)和维洛沙嗪(viloxazine)；选择性血清素再吸收抑制剂(ssri)，如西酞普兰(citalopram)和西酞普兰代谢物去甲西酞普兰(desmethylcitalopram)、达泊西汀(dapoxetine)、依地普兰(escitalopram)(例如草酸依地普兰)、氟西汀(fluoxetine)和氟西汀去甲基代谢物去甲氟西汀(norfluoxetine)、氟伏沙明(fluvoxamine)(例如马来酸氟伏沙明)、帕罗西汀(paroxetine)、舍曲林(sertraline)和舍曲林代谢物去甲舍曲林(demethylsertraline)；双重血清素-去甲肾上腺素再吸收抑制剂(snri)，如比西发定(bicifadine)、度洛西汀(duloxetine)、米那普仑(milnacipran)、奈法唑酮(nefazodone)和文拉法辛(venlafaxine)；和其组合。在另一实施例中，化合物1与如下肌肉弛缓剂组合投与，其实例包括：肌安宁(carisoprodol)、氯唑沙宗(chlorzoxazone)、环苯扎平(cyclobenzaprine)、二氟尼柳(diflunisal)、美他沙酮(metaxalone)、美索巴莫(methocarbamol)和其组合。在一个实施例中，化合物1与如下利钠肽或类似物组合投与，其实例包括：卡培立肽(carperitide)、cd-np(尼罗治疗剂(niletherapeutics))、cu-np、奈西立肽(nesiritide)、pl-3994(帕拉丁技术公司(palatintechnologies,inc.))、乌拉立肽(ularitide)、森德立肽(cenderitide)和奥佳华(ogawa)等人,(2004)生物化学杂志(j.biol.chem.)279:28625-31中所述的化合物。这些化合物也称为利钠肽受体-a(npr-a)促效剂。在另一实施例中，化合物1与如下利钠肽清除受体(npr-c)拮抗剂组合投与，如sc-46542、canf(4-23)和ap-811(维尔(veale)(2000)生物有机与药物化学快报(bioorgmedchemlett)10:1949-52)。举例来说，当与nep抑制剂塞奥芬组合时，ap-811展示协同作用(维格纳(wegner)(1995)临床与实验高血压(clin.exper.hypert.)17:861-876)。在另一实施例中，化合物1与如下脑啡肽酶(nep)抑制剂组合投与，其实例包括：ahu-377；坎沙曲；坎沙曲拉；右卡多曲(dexecadotril)((+)-n-[2(r)-(乙酰基巯基甲基)-3-苯基丙酰基]甘氨酸苯甲酯)；cgs-24128(3-[3-(联苯-4-基)-2-(膦酰基甲基氨基)丙酰氨基]丙酸)；cgs-24592((s)-3-[3-(联苯-4-基)-2-(膦酰基甲基氨基)丙酰氨基]丙酸)；cgs-25155(n-[9(r)-(乙酰基硫基甲基)-10-氧代-1-氮杂环癸-2(s)-基羰基]-4(r)-羟基-l-脯氨酸苯甲酯)；赫普沃斯(hepworth)等人的wo2006/027680中所述的3-(1-氨甲酰基环己基)丙酸衍生物(辉瑞公司(pfizerinc.))；jmv-390-1(2(r)-苯甲基-3-(n-羟基氨甲酰基)丙酰基-l-异亮氨酰基-l-亮氨酸)；依卡曲尔(ecadotril)；膦酰二肽；反向塞奥芬(retrothiorphan)；ru-42827(2-(巯基甲基)-n-(4-吡啶基)苯丙酰胺)；ru-44004(n-(4-吗啉基)-3-苯基-2-(磺酰基甲基)丙酰胺)；sch-32615((s)-n-[n-(1-羧基-2-苯乙基)-l-苯丙氨酰基]-β-丙氨酸)和其前药sch-34826((s)-n-[n-[1-[[(2,2-二甲基-1,3-二氧杂环戊-4-基)甲氧基]羰基]-2-苯乙基]-l-苯丙氨酰基]-β-丙氨酸)；萨洛芬(sialorphin)；sch-42495(n-[2(s)-(乙酰基磺酰基甲基)-3-(2-甲基苯基)丙酰基]-l-甲硫氨酸乙酯)；司皮诺芬(spinorphin)；sq-28132(n-[2-(巯基甲基)-1-氧代-3-苯丙基]白氨酸)；sq-28603(n-[2-(巯基甲基)-1-氧代-3-苯丙基]-β-丙氨酸)；sq-29072(7-[[2-(巯基甲基)-1-氧代-3-苯丙基]氨基]庚酸)；塞奥芬和其前药消旋卡多曲(racecadotril)；uk-69578(顺-4-[[[1-[2-羧基-3-(2-甲氧基乙氧基)丙基]环戊基]羰基]氨基]环己甲酸)；uk-447,841(2-{1-[3-(4-氯苯基)丙基氨甲酰基]-环戊基甲基}-4-甲氧基丁酸)；uk-505,749((r)-2-甲基-3-{1-[3-(2-甲基苯并噻唑-6-基)丙基氨甲酰基]环戊基}丙酸)；5-联苯-4-基-4-(3-羧基丙酰基氨基)-2-甲基戊酸和5-联苯-4-基-4-(3-羧基丙酰基氨基)-2-甲基戊酸乙酯(wo2007/056546)；卡德尔(khder)等人的wo2007/106708中所述的达鲁曲(daglutril)[(3s,2'r)-3-{1-[2'-(乙氧羰基)-4'-苯基丁基]-环戊-1-羰基氨基}-2,3,4,5-四氢-2-氧代-1h-1-苯并氮呯-1-乙酸](诺华公司(novartisag))；和其组合。在一个特定实施例中，nep抑制剂选自ahu-377、坎沙曲、坎沙曲拉、cgs-24128、膦酰二肽、sch-32615、sch-34826、sq-28603、塞奥芬和其组合。在一个特定实施例中，nep抑制剂是如达鲁曲或cgs-26303([n-[2-(联苯-4-基)-1(s)-(1h-四唑-5-基)乙基]氨基]甲基膦酸)的化合物，其具有作为内皮素转化酶(ece)与nep的抑制剂的活性。也可使用其它双重作用ece/nep化合物。nep抑制剂以足以提供每天约20-800mg的量投与，其中典型日剂量在每天50-700mg，更通常每天100-600mg或100-300mg范围内。在一个实施例中，化合物1与如下氧化氮供体组合投与，其实例包括尼可地尔(nicorandil)；有机硝酸酯，如异戊四醇四硝酸酯；和斯德酮亚胺(sydnonimine)，如林西多明(linsidomine)和吗多明(molsidomine)。在又另一实施例中，化合物1与如下非类固醇抗发炎剂(nsaid)组合投与，其实例包括：阿西美辛(acemetacin)、乙酰水杨酸(acetylsalicylicacid)、阿氯芬酸(alclofenac)、阿明洛芬(alminoprofen)、氨芬酸(amfenac)、氨普立糖(amiprilose)、阿洛普令(aloxiprin)、阿尼罗酸(anirolac)、阿帕宗(apazone)、阿扎丙宗(azapropazone)、贝诺酯(benorilate)、苯恶洛芬(benoxaprofen)、苯哌隆(bezpiperylon)、溴哌莫(broperamole)、布氯酸(bucloxicacid)、卡洛芬(carprofen)、环氯茚酸(clidanac)、双氯芬酸(diclofenac)、二氟尼柳、地弗他酮(diftalone)、依诺利康(enolicam)、依托度酸(etodolac)、依托昔布(etoricoxib)、芬布芬(fenbufen)、芬氯酸(fenclofenac)、芬克洛酸(fenclozicacid)、非诺洛芬(fenoprofen)、芬替酸(fentiazac)、非普拉宗(feprazone)、氟芬那酸(flufenamicacid)、氟苯柳(flufenisal)、氟洛芬(fluprofen)、氟比洛芬(flurbiprofen)、呋罗芬酸(furofenac)、异丁芬酸(ibufenac)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、吲哚洛芬(indoprofen)、伊索克酸(isoxepac)、伊索昔康(isoxicam)、酮洛芬(ketoprofen)、酮洛酸(ketorolac)、洛非咪唑(lofemizole)、氯诺昔康(lornoxicam)、甲氯芬那酸酯(meclofenamate)、甲氯芬那酸(meclofenamicacid)、甲芬那酸(mefenamicacid)、美洛昔康(meloxicam)、美色拉嗪(mesalamine)、咪洛芬(miroprofen)、莫非布宗(mofebutazone)、萘丁美酮(nabumetone)、萘普生(naproxen)、尼氟酸(niflumicacid)、奥沙普嗪(oxaprozin)、恶平酸(oxpinac)、羟布宗(oxyphenbutazone)、苯基丁氮酮(phenylbutazone)、吡罗昔康(piroxicam)、吡洛芬(pirprofen)、普拉洛芬(pranoprofen)、双水杨酸酯(salsalate)、舒多昔康(sudoxicam)、柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)、舒林酸(sulindac)、舒洛芬(suprofen)、替诺昔康(tenoxicam)、硫平酸(tiopinac)、噻洛芬酸(tiaprofenicacid)、硫恶洛芬(tioxaprofen)、托芬那酸(tolfenamicacid)、托美丁(tolmetin)、三氟米酯(triflumidate)、齐多美辛(zidometacin)、佐美酸(zomepirac)和其组合。在一个特定实施例中，nsaid选自依托度酸、氟比洛芬、布洛芬、吲哚美辛、酮洛芬、酮咯酸、美洛昔康、萘普生、奥沙普嗪、吡罗昔康和其组合。在一个实施例中，化合物1与如下n-甲基d-天冬氨酸(nmda)受体拮抗剂组合投与，其实例包括金刚烷胺(amantadine)、右甲吗喃(dextromethorphan)、右丙氧芬(dextropropoxyphene)、氯胺酮(ketamine)、凯托米酮(ketobemidone)、美金刚(memantine)、美沙酮(methadone)等。在再另一实施例中，化合物1与类鸦片受体促效剂(也称为类鸦片镇痛剂)组合投与。代表性类鸦片受体促效剂包括：丁丙诺啡(buprenorphine)、布托啡诺(butorphanol)、可待因(codeine)、二氢可待因(dihydrocodeine)、芬太尼(fentanyl)、氢可酮(hydrocodone)、氢吗啡酮(hydromorphone)、左洛啡烷(levallorphan)、左啡诺(levorphanol)、哌替啶(meperidine)、美沙酮、吗啡(morphine)、纳布啡(nalbuphine)、纳美芬(nalmefene)、纳洛芬(nalorphine)、纳洛酮(naloxone)、纳曲酮(naltrexone)、纳洛芬、氧可酮(oxycodone)、氧吗啡酮(oxymorphone)、戊唑星(pentazocine)、丙氧吩(propoxyphene)、曲马多(tramadol)和其组合。在某些实施例中，类鸦片受体促效剂选自可待因、二氢可待因、氢可酮、氢吗啡酮、吗啡、氧可酮、氧吗啡酮、曲马多和其组合。在一个特定实施例中，化合物1与磷酸二酯酶(pde)抑制剂(尤其pde-v抑制剂)组合投与。代表性pde-v抑制剂包括阿伐那非(avanafil)、罗地那非(lodenafil)、米罗地那非(mirodenafil)、西地那非(sildenafil)他达拉非(tadalafil)伐地那非(vardenafil)和乌地那非(udenafil)。在另一实施例中，化合物1与前列腺素类似物(也称为前列腺素或前列环素类似物)组合投与。代表性前列腺素类似物包括贝前列素钠(beraprostsodium)、比马前列素(bimatoprost)、依前列醇(epoprostenol)、伊洛前列素(iloprost)、拉坦前列素(latanoprost)、他氟前列素(tafluprost)、曲伏前列素(travoprost)和曲前列环素(treprostinil)，其中比马前列素、拉坦前列素和他氟前列素备受关注。在又另一实施例中，化合物1与如下前列腺素受体促效剂组合投与，其实例包括比马前列素、拉坦前列素、曲伏前列素等。化合物1也可与如下肾素抑制剂组合投与，其实例包括阿利吉仑(aliskiren)、依那吉仑(enalkiren)、瑞米吉仑(remikiren)和其组合。在另一实施例中，化合物1与如下选择性血清素再吸收抑制剂(ssri)组合投与，其实例包括：西酞普兰和西酞普兰代谢物去甲西酞普兰、达泊西汀、依地普兰(例如草酸依地普兰)、氟西汀和氟西汀去甲基代谢物去甲氟西汀、氟伏沙明(例如马来酸氟伏沙明)、帕罗西汀、舍曲林和舍曲林代谢物去甲舍曲林和其组合。在一个实施例中，化合物1与如下5-ht1d血清素受体促效剂组合投与，其实例包括曲普坦(triptan)，如阿莫曲普坦(almotriptan)、阿维曲普坦(avitriptan)、依来曲普坦(eletriptan)、夫罗曲普坦(frovatriptan)、那拉曲普坦(naratriptan)、利扎曲普坦(rizatriptan)、舒马曲普坦(sumatriptan)和佐米曲普坦(zolmitriptan)。在一个实施例中，化合物1与如下钠信道阻断剂组合投与，其实例包括卡马西平(carbamazepine)、磷苯妥英(fosphenytoin)、拉莫三嗪(lamotrignine)、利多卡因(lidocaine)、美西律(mexiletine)、奥卡西平(oxcarbazepine)、苯妥英(phenytoin)和其组合。在一个实施例中，化合物1与如下可溶性鸟苷酸环化酶刺激剂或活化剂组合投与，其实例包括阿他瓜特(ataciguat)、瑞司瓜特(riociguat)和其组合。在一个实施例中，化合物1与如下三环抗抑郁剂(tca)组合投与，其实例包括阿米替林(amitriptyline)、氧阿米替林(amitriptylinoxide)、布替林(butriptyline)、氯米帕明(clomipramine)、地美替林(demexiptiline)、地昔帕明(desipramine)、二苯西平(dibenzepin)、二甲他林(dimetacrine)、度硫平(dosulepin)、多塞平(doxepin)、丙咪嗪(imipramine)、氧米帕明(imipraminoxide)、洛非帕明(lofepramine)、美利曲辛(melitracen)、美他帕明(metapramine)、硝沙西平(nitroxazepine)、去甲替林(nortriptyline)、诺昔替林(noxiptiline)、哌泊非嗪(pipofezine)、丙吡西平(propizepine)、普罗替林(protriptyline)、奎纽帕明(quinupramine)和其组合。在一个实施例中，化合物1与如下血管加压素受体拮抗剂组合投与，其实例包括考尼伐坦(conivaptan)和托伐普坦(tolvaptan)。组合的第二治疗剂也可有助于使用本发明化合物1的其它组合疗法。举例来说，本发明化合物可与利尿剂和arb、或钙通道阻断剂和arb、或利尿剂和ace抑制剂、或钙通道阻断剂和他汀组合。特定实例包括ace抑制剂依那普利(呈马来酸盐形式)与利尿剂氢氯噻嗪的组合，其以商标出售；或钙通道阻断剂氨氯地平(呈苯磺酸盐形式)与arb奥美沙坦(呈美度米前药形式)的组合；或钙信道阻断剂与他汀的组合，其均也可与化合物1一起使用。其它治疗剂(如α2-肾上腺素激导性受体促效剂和血管加压素受体拮抗剂)也可有助于组合疗法。示范性α2-肾上腺素激导性受体促效剂包括氯压定(clonidine)、右旋美托咪啶(dexmedetomidine)和胍法新(guanfacine)。下列调配物说明本发明的代表性医药组合物。用于口服投药的示范性硬明胶胶囊充分掺合本发明化合物(50g)、440g喷雾干燥的乳糖和10g硬脂酸镁。接着将所得组合物装入硬明胶胶囊中(每胶囊500mg组合物)。或者，将化合物1(20mg)与淀粉(89mg)、微晶纤维素(89mg)和硬脂酸镁(2mg)充分掺合。接着使混合物穿过45号目美国筛，并且装入硬明胶胶囊中(每胶囊200mg组合物)。或者，充分掺合化合物1(30g)、第二药剂(20g)、440g喷雾干燥的乳糖和10g硬脂酸镁，并且如上文所述处理。用于口服投药的示范性明胶胶囊调配物将化合物1(100mg)与聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(50mg)和淀粉粉末(250mg)充分掺合。接着将混合物装入明胶胶囊中(每胶囊400mg组合物)。或者，将化合物1(70mg)和第二药剂(30mg)与聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯(50mg)和淀粉粉末(250mg)充分掺合，并且将所得混合物装入明胶胶囊中(每胶囊400mg组合物)。或者，将化合物1(40mg)与微晶纤维素(avicelph103；259.2mg)和硬脂酸镁(0.8mg)充分掺合。接着将混合物装入明胶胶囊(1号尺寸，白色，不透明)中(每胶囊300mg组合物)。用于口服投药的示范性羟丙基甲基纤维素(hpmc)胶囊将化合物1(50mg或100mg)直接装入hpmc胶囊中。用于口服投药的示范性片剂调配物使化合物1(10mg)、淀粉(45mg)和微晶纤维素(35mg)穿过20号目美国筛，并且充分混合。在50℃-60℃下干燥如此产生的颗粒，并且穿过16号目美国筛。将聚乙烯吡咯烷酮溶液(4mg于无菌水中的10％溶液)与羧甲基淀粉钠(4.5mg)、硬脂酸镁(0.5mg)和滑石(1mg)混合，接着使这种混合物穿过16号目美国筛。接着向颗粒中添加羧甲基淀粉钠、硬脂酸镁和滑石。在混合之后，在制锭机上压缩混合物，得到重量是100mg的片剂。或者，将化合物1(250mg)与微晶纤维素(400mg)、烟雾状二氧化硅(10mg)和硬脂酸(5mg)充分掺合。接着压缩混合物以形成片剂(每片剂665mg组合物)。或者，将化合物1(400mg)与玉米淀粉(50mg)、交联羧甲纤维素钠(25mg)、乳糖(120mg)和硬脂酸镁(5mg)充分掺合。接着压缩混合物以形成单刻痕片剂(每片剂600mg组合物)。或者，用明胶水溶液(20mg)将化合物1(100mg)与玉米淀粉(100mg)充分掺合。干燥混合物，并且研磨成细粉末。接着将微晶纤维素(50mg)和硬脂酸镁(5mg)与明胶调配物混合，粒化，并且压缩所得混合物以形成片剂(每片剂100mg本发明化合物)。用于口服投药的示范性悬浮液调配物混合下列成分以形成每10ml悬浮液含有100mg化合物1的悬浮液：用于口服投药的示范性液体调配物适合液体调配物是含有基于羧酸的缓冲剂(如柠檬酸盐、乳酸盐以及马来酸盐缓冲溶液)的调配物。举例来说，将化合物1(其可与dmso预混)与100mm柠檬酸铵缓冲剂掺合并且将ph调节到ph5，或与100mm柠檬酸溶液掺合并且将ph调节到ph2。这类溶液也可包括增溶性赋形剂(如环糊精)，例如溶液可包括10wt％羟丙基-β-环糊精。其它适合调配物包括含有或不含有环糊精的5％nahco3溶液。用于注射投与的示范性肠胃外静脉内调配物将化合物1(0.2g)与0.4m乙酸钠缓冲溶液(2.0ml)掺合。视需要使用0.5n盐酸水溶液或0.5n氢氧化钠水溶液将所得溶液的ph调节到ph4，接着添加足够注射用水以提供20ml的总体积。接着经由无菌过滤器(0.22微米)过滤混合物，得到适合于注射投与的无菌溶液。以下调配物说明本发明的代表性医药组合物。调配物实例a适用于制备可注射溶液的冷冻溶液如下制备：代表性程序：将赋形剂(如果存在)溶解于约80％注射用水中，添加活性化合物1或1'并且溶解。用1m氢氧化钠将ph调节到3到4.5，并且随后用注射用水将体积调节到最终体积的95％。检验ph值并且必要时进行调节，并且用注射用水将体积调节到最终体积。随后经由0.22微米过滤器无菌过滤调配物并且在无菌条件下置于无菌小瓶中。将小瓶加盖、作标记并且冷冻储存。调配物实例b适用于制备可注射溶液的冻干粉末或结晶固体如下制备：代表性程序：将赋形剂和/或缓冲剂(如果存在)溶解于约60％注射用水中。添加活性化合物1或1'，溶解，用1m氢氧化钠将ph调节到3到4.5并且用注射用水将体积调节到最终体积的95％。检验ph值并且必要时进行调节，并且用注射用水将体积调节到最终体积。随后经由0.22微米过滤器无菌过滤调配物并且在无菌条件下置于无菌小瓶中。随后使用适当冻干循环将调配物冻干。将是加盖(任选地在部分真空或干燥氮气下)，作标记并且冰冻储存。调配物实例c用于静脉内投与患者的可注射溶液由以上调配物实例b如下制备：代表性程序：用20ml无菌水复原调配物实例b(例如含有10到1000mg活性化合物1或1')的冻干粉末，并且用80ml无菌生理食盐水于100ml输注袋中进一步稀释所得溶液。随后将经过稀释的溶液经30到120分钟静脉内投与患者。用于吸入投与的示范性组合物将化合物1(0.2mg)微米尺寸化，接着与乳糖(25mg)掺合。接着将这种掺合混合物装入明胶吸入筒中。举例来说，使用干粉吸入器投与所述筒的内含物。或者，将微米尺寸化的化合物1(10g)分散在通过将卵磷脂(0.2g)溶解于去矿物质水(200ml)中所制备的溶液中。喷雾干燥所得悬浮液，接着微米尺寸化以形成包含平均直径小于约1.5μm的粒子的微米尺寸化组合物。接着将微米尺寸化组合物装入含有经过加压的1,1,1,2-四氟乙烷的定量剂量吸入器筒中，组合物的量在用吸入器投与时足以提供每剂量约10μg到约500μg本发明化合物。或者，将化合物1(25mg)溶解于柠檬酸盐缓冲(ph5)的等张生理食盐水(125ml)中。搅拌混合物并且进行超声处理直到化合物溶解。检查溶液的ph，并且必要时通过缓慢添加1nnaoh水溶液将ph调节到ph5。使用每剂量提供约10μg到约500μg化合物1的喷雾器装置投与溶液。实例提供以下制备和实例以说明本发明的特定实施例。然而，除非特定指明，否则这些特定实施例并不打算以任何方式限制本发明的范围。除非另外指明，否则以下缩写具有以下含义，并且本文所使用但未定义的任何其它缩写均具有其通常接受的标准含义：除非另外提及，否则所有材料(如试剂、起始材料和溶剂)均购自商业供货商(如西格玛-阿尔德里奇(sigma-aldrich)、福鲁卡(fluka)riedel-de等)，并且不经过进一步纯化即使用。除非另外提及，否则反应在氮气气氛下进行。通过薄层色谱(tlc)、分析型高效液相色谱(anal.hplc)和质谱分析监测反应进程，其细节在特定实例中给出。一般来说，用于分析型hplc的溶剂如下：溶剂a是98％h2o/2％mecn/1.0ml/ltfa；溶剂b是90％mecn/10％h2o/1.0ml/ltfa。如例如在每一制备中特别描述来处理反应物；通常通过萃取和其它纯化方法(如温度依赖性和溶剂依赖性结晶和沉淀)来纯化反应混合物。另外，通过制备型hplc通常使用微吸收(microsorb)c18和微吸收bds柱填充物和常规洗脱剂来常规纯化反应混合物。通常通过液相色谱质谱(lcms)来测量反应进程。通过核奥氏效应光谱法(nuclearoverhausereffectspectroscopy，noe)进行异构体表征。通过质谱和1h-nmr光谱法常规进行反应产物的表征。为进行nmr测量，将样品溶解于氘化溶剂(cd3od、cdcl3或dmso-d6)中，并且在标准观察条件下用瓦里安双子(variangemini)2000仪器(400mhz)获得1h-nmr光谱。通常用应用生物系统(appliedbiosystems)(加利福尼亚州福斯特市(fostercity,ca))api150ex型仪器或安捷伦(agilent)(加利福尼亚州帕罗奥多市(paloalto))1200lc/msd型仪器使用电喷雾电离法(esms)来进行化合物的质谱鉴别。测量技术粉末x射线衍射使用布鲁克d8-高级型(brukerd8-advance)x射线衍射仪来进行粉末x射线衍射分析。x射线源是cu-kα辐射，其中输出电压是40kv并且电流是40ma。所述仪器以布拉格-布伦塔诺(bragg-brentano)几何模式操作并且使用格贝尔(goebel)镜以获得平行x射线束。射束的任何发散由源处的0.2°垂直发散狭缝和源和检测器处的索勒狭缝(sollerslit)(2.5°)限制。为进行测量，将少量粉末(5-25mg)轻轻压于零背景硅样品固持器上，以形成平滑表面并且进行x射线暴露。以耦合的θ-2θ模式以2°到35°的2θ扫描样品，其中步长是0.02°并且扫描速度是每步0.3秒。通过布鲁克衍射套装(diffracsuite)软件控制数据采集并且通过杰德(jade)软件(7.5.1版)分析。用刚玉(corundum)标准物在±0.02°2θ角内校准仪器。应记住数据收集中所用的布拉格-布伦塔诺几何模式倾向择优定向(preferredorientation)。在这些条件下，衍射峰的相对强度可能不代表获自球形粒子的理想化分布或从单一晶体数据模拟的衍射图案的真实相对强度。也可能一些峰在一些衍射图案中由于过度择优定向而无法观察到。示差扫描热量测定使用具有热分析(thermalanalyst)控制器的ta仪器(tainstruments)q-100型模块进行dsc测量。收集数据并且使用ta仪器通用分析软件分析。将样品精确称量于经覆盖铝板中。在5℃下进行5分钟等温平衡阶段后，使用10℃/分钟的线性加热匀变将样品从0℃加热到275℃。热解重量分析使用具有高分辨能力的ta仪器q-500型模块进行tga测量。使用ta仪器热分析控制器收集数据并且使用ta仪器通用分析软件分析。将称量的样品置于铂板上并且以10℃的加热速率从环境温度到200℃扫描。在使用期间用氮气流吹扫其余部分和炉室。偏光显微术为进行偏光显微术(plm)研究，在具有正交偏光过滤器的光学显微镜(奥林巴斯(olympus)bx51)下检验样品。用由帕克斯它(paxit)成像软件(6.4版)控制的帕克斯科姆(paxcam)摄影机收集图像。于玻璃盖玻片上使用轻质矿物油作为浸渍介质制备样品。取决于粒子尺寸，使用4×、10×或20×物镜加以放大。动态湿气吸附评定使用vti大气压微量天平sga-100系统(vti公司(vticorp.),佛罗里达州海厄利亚市(hialeah,fl)33016)进行dms测量。使用称量的样品并且在开始分析时湿度是最低可能值(接近0％相对湿度)。在5-90％的整个湿度范围中，dms分析由5％相对湿度/步的扫描速率组成。dms操作在25℃下以等温方式进行。合成程序和比较实例合成以下化合物并且评估nep酶抑制活性：制备1：(2s,4r)-4-氨基-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-2-羟甲基-2-甲基戊酸苯甲酯(化合物7)将(3s,5r)-5-(5'-氯-2'-氟-联苯-4-基甲基)-3-羟甲基-3-甲基-吡咯烷-2-酮(2)(201.0g，578mmol)与dcm(4020ml)组合，得到均匀透明棕色溶液，随后在搅拌下冷却到0℃。添加3,4-二氢-2h-吡喃(118ml，1.3mol)和4-甲基苯磺酸(34.8g，202mmol)并且经2小时加热混合物到18.5℃，随后在18.5℃下搅拌过夜(>98％转化率)。用饱和nahco3水溶液淬灭反应物并且使每一相分离。用na2so4干燥有机层，随后过滤，继而去除溶剂，得到浓稠深棕色粗物质(约300g)，将其溶解于dipe(2l)中并且在5℃下搅拌过夜，得到白色浆液。过滤浆液并且经2天干燥固体，得到化合物3(113.8g)。干燥滤液，得到浓稠油状物，将其溶解于dipe(约100ml)中并且在5℃下搅拌过夜以分离额外化合物3(总产量225g)。在搅拌下将化合物3(208g，482mmol)溶解于thf(1912ml，23mol)中，得到透明均匀溶液。用氮气吹扫混合物，随后冷却到-10℃。逐滴添加1mnahmds的thf溶液(539ml，539mmol)并且搅拌混合物30分钟。逐滴添加二碳酸二叔丁酯(131g，602mmol)溶解于thf(393ml，4.8mol)中的溶液并且在室温下搅拌所得混合物过夜。用nh4cl饱和水溶液(5.0l)淬灭反应物并且添加etoac(3.1l)。分离每一相并且用nacl饱和水溶液(5.0l)洗涤有机层。分离每一相并且经mgso4干燥有机层。去除溶剂，得到浓稠油状物，经两天进一步干燥后，得到呈发泡固体状的化合物4(265g)。将化合物4(265g，498mmol)溶解于thf(1.7l)中，得到均匀透明浅棕色溶液。添加1.0mlioh的水溶液(1.5l，1.5mol)并且在室温下搅拌所得混合物超过4小时。6小时后反应完成，但在15℃下仍搅拌混合物过夜。添加etoac(1.7l)，用nh4cl饱和水溶液(1.7l)洗涤混合物并且分离每一相。用nacl饱和水溶液洗涤有机层，分离，经na2so4干燥，随后过滤并且干燥，得到呈发泡灰白色到黄色固体状的化合物5(300g)(由于残余etoac而过量)。将化合物5(277.0g，498mmol)溶解于dmf(970ml)中，得到无色溶液。添加k2co3(103g，747mmol)并且搅拌所得混合物15分钟。一次性添加苯甲基溴(71.1ml，598mmol)并且在室温下搅拌混合物过夜；20小时后完全转化。添加nh4cl(6l)和etoac(1l)并且分离每一相。用nacl饱和水溶液(6l)洗涤有机层并且经na2so4干燥，继而去除溶剂，得到粗化合物6(335g)，其直接用于下一步骤中。将3mhcl(1.7l，5.0mol)的cpme溶液与化合物6(319.0g，498mmol)组合，并且在室温下搅拌所得混合物超过24小时，得到浆液(>99％转化率)。再添加cpme(1.0l)并且搅拌所得浆液1小时。过滤混合物并且用cpme(500ml)冲洗湿滤饼。过滤并且干燥，得到呈白色饼状的化合物7(190g)。实例1：(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-4-(乙氧基草酰基氨基)-2-羟甲基-2-甲基戊酸(化合物1)将etoh(576μl，9.9mmol)溶解于dcm(3ml)中。添加草酰氯(1.0ml，12.1mmol)并且在室温下搅拌所得溶液30分钟。在不加热下蒸发溶剂，得到溶液，将其直接用于下一步骤中。将(2s,4r)-4-氨基-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-2-羟甲基-2-甲基戊酸苯甲酯(7)(1.0g，2.2mmol)溶解于dcm(3ml)中。依序添加先前获得的溶液和dipea(958μl，5.5mmol)。在室温下搅拌所得溶液15分钟，此时lc/ms展示所要产物的质量。在真空中去除溶剂并且通过正相色谱(20-95％etoac/己烷)纯化粗残余物，得到化合物8(1.0g，1.9mmol)，将其直接用于下一步骤中。将化合物8(1.0g，1.9mmol)与10wt％钯/碳(350mg，185μmol)、acoh(5ml)和etoac(5ml)组合。将混合物置于氢气下并且在室温下搅拌2小时，此时lc/ms展示完成去除保护基苯甲基。使用0.2μmptfeacrodisccr过滤器滤出钯并且在真空中去除溶剂。通过逆相色谱纯化粗残余物，得到化合物1(400mg)。msm/z[m+h]+c23h25clfno6的计算值,466.14；实验值466。结晶(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-乙氧基-2-氧代乙酰氨基)-2-(羟甲基)-2-甲基戊酸钙(化合物1')将化合物1(30g，64.4mmol)溶解于200标准酒精度etoh(100ml)中并且随后在室温下将dipea(11.25ml，64.4mmol)添加到这种混合物中。将三氟甲烷磺酸钙(10.89g，32.2mmol)溶解于etoh(20ml)中并且逐滴添加到含有化合物1的混合物中以经由约1小时的时程形成浓稠浆液。随后在室温下搅拌浓稠浆液两天。缓慢过滤所得浆液并且经两天干燥，得到33g>99％纯化合物1'。通过首先冷却化合物1'(33g，19.80mmol)到5℃进行第二再浆化方法。随后添加冷etoh:水(7:3)混合物(300ml)并且剧烈搅拌所得浆液4天。随后缓慢过滤浆液并且在连续去结块下干燥24小时。随后在室温下于空气中再干燥浆液18小时，得到29.5g>99％化合物1'的纯固体。通过如本文所述的pxrd、dsc和tga分析这种产物，并且所产生的数据呈现于图1-3中。结晶l-精氨酸(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-乙氧基-2-氧代乙酰氨基)-2-(羟甲基)-2-甲基戊酸盐(化合物1″)将化合物1(181.6mg)溶解于玻璃瓶中的200标准酒精度etoh(0.5ml)中，得到透明溶液。在-20℃下冷却溶液约10分钟。在各别玻璃瓶中，将l-精氨酸(68mg)溶解于0.2ml水中并且在5℃下冷却溶液约10分钟。将含有化合物1的透明溶液缓慢转移到l-精氨酸溶液中。再将0.2ml200标准酒精度etoh添加到预先含有化合物1的小瓶中，并且将内含物进一步添加到含有l-精氨酸溶液的小瓶中。将使用刚描述的类似程序获自先前反应的l-精氨酸晶体的晶种添加到组合溶液中并且将整个混合物在轻微搅拌下保持在5℃下，在1到2天得到结晶悬浮液。过滤化合物1″的晶体并且通过如本文所述的pxrd、dsc和tga分析并且所产生的数据呈现于图6-8中。制备2：(2s,4r)-4-叔丁氧基羰基氨基-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-2-羟甲基-2-甲基戊酸乙酯(化合物10)将(2s,4r)-5-(4-溴苯基)-4-叔丁氧基羰基氨基-2-羟甲基-2-甲基戊酸(1.3g，3.1mmol)与na2co3(993mg，9.4mmol)、水(0.2ml)和二恶烷(1.5ml)组合。将反应容器加盖，吹洗并且置于氮气下。快速添加pd(pph3)4(541mg，468μmol)并且再次吹洗容器。在90℃下加热混合物45分钟，此时lcms展示反应完成。用1nhcl/水酸化有机层到ph约4并且用etoac萃取。分离有机层，用nacl饱和水溶液洗涤并且经mg2so4干燥。在真空中去除溶剂并且通过逆相色谱纯化粗残余物，得到化合物9。将化合物9(1.0g，2.1mmol)溶解于etoh(4ml)和4nhcl的二恶烷溶液(4ml)中并且在60℃下搅拌3小时。蒸发溶剂并且将粗残余物溶解于dcm中。依序添加(boc)2o(472μl，2.031mmol)、et3n(566μl，4.1mmol)和dmap(5mg)。搅拌反应混合物3小时。蒸发粗物质，用dcm湿磨并且不经进一步纯化即过滤，得到化合物10(800mg)。实例2：(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-2-羟甲基-2-甲基-4-(草酰基氨基)戊酸(比较化合物c2)将(2s,4r)-4-叔丁氧基羰基氨基-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-2-羟甲基-2-甲基戊酸乙酯(10)(2.6g，5.3mmol)与mecn(5ml)和4nhcl的二恶烷溶液(4ml)组合并且搅拌15分钟。通过离心蒸发去除溶剂，得到化合物11，将其直接用于下一步骤。向粗化合物11(2.1g，5.3mmol)于dcm(10ml)中的溶液中添加2-氯-2-氧代乙酸乙酯(1.3ml，11.7mmol)，继而缓慢添加et3n(2.6ml，18.7mmol)。搅拌所得混合物15分钟并且监测反应的完成。通过急骤色谱(0-100％etoac/己烷)纯化粗产物，得到化合物12，将其直接用于下一步骤中。将化合物12(2.2g，3.7mmol)与thf(5ml)和naoh(3.7ml，37.0mmol)组合，继而添加水(10ml)。搅拌所得混合物过夜。蒸发溶剂，添加acoh并且通过逆相色谱纯化产物，得到比较化合物c2(540mg)。msm/z[m+h]+的计算值c21h21clfno6,438.10；实验值438.2。比较化合物c2描述于休斯等人的美国专利第8,691,868号的实例11-2中。制备3：(3s,5r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基甲基)-3-羟甲基-3-甲基吡咯烷-2-酮(化合物21)将(r)-2-氨基-3-(4-溴苯基)丙酸(3300g，13.5mol，1.0当量)于mecn(46.2l)中的溶液置于用惰性氮气气氛吹扫并维持的反应烧瓶中。在-10℃下分数批添加naoh(1081g，27.0mol，2.0当量)于水(46.2l)中的溶液。向其中添加二碳酸二叔丁酯(2948g，13.51mol，1.0当量)于mecn(6.6l)中的溶液。在室温下搅拌所得溶液过夜，随后在真空下浓缩。用45l水/冰稀释所得溶液。用hcl(1mol/l)将溶液ph值调节到2。用dcm(50l×3)萃取所得溶液并且合并有机层。用nacl饱和水溶液(50l)洗涤所得混合物，随后经mgso4干燥并且在真空中浓缩，得到呈白色固体状的化合物13(3720g)。将化合物13(530g，1.54mol，1.0当量)于二恶烷(9.54l)中的溶液与(5-氯-2-氟苯基酸(348g，2.0mol，1.3当量)、na2co3(228g，2.2mol，1.4当量)于水(1.1l)中的溶液和pd(pph3)4(8.9g，7.7mmol，0.01当量)于用惰性氮气气氛吹扫并维持的反应烧瓶中组合。在油浴中加热所得溶液到回流后维持2.5小时，随后用水/冰浴冷却到室温。用etoac(15l)稀释所得溶液，用1nhcl(5l)和nacl饱和水溶液(5l×4)洗涤。随后经mgso4干燥合并的有机相并且在真空中浓缩。随后用pe(1l×2)洗涤残余物，得到呈棕色油状的化合物14(510g)。将化合物14(510g，1.3mol，1.0当量)于dcm(5l)中的溶液与2,2-二甲基-1,3-二恶烷-4,6-二酮(205g，1.4mol，1.1当量)和4-二甲基氨基吡啶(237g，1.9mol，1.5当量)于用惰性氮气气氛吹扫并维持的反应烧瓶中组合。在-10℃下在搅拌下逐滴添加dcc(294g，1.4mol，1.1当量)于dcm(600ml)中的溶液。在室温下搅拌所得溶液过夜。过滤固体并且用1nhcl(2l)和nacl饱和水溶液(3l)洗涤滤液。经mgso4干燥合并的有机相。过滤固体，得到化合物15作为滤液，将其不经过进一步纯化即直接用于下一步骤中。将化合物15的dcm溶液(7l，粗物质)与acoh(600ml)在用惰性氮气气氛吹扫并维持的反应烧瓶中组合。在-5℃下分数批添加nabh4(88.8g，2.4mol，1.8当量)。在-5℃下搅拌所得溶液3小时。随后通过逐滴添加nacl饱和水溶液(1l)淬灭反应物。用nacl饱和水溶液(2l)稀释所得溶液并且用水(2l×2)、饱和nahco3水溶液(1l)和nacl饱和水溶液(2l)洗涤所得混合物。经mgso4干燥合并的有机相并且在真空中浓缩，得到呈黄色油状的化合物16(520g)。将化合物16(520g，1.0mol，1.0当量)于丙酮/dmf(1:1)(5.2l)中的溶液与na2co3(163g，1.5mol，1.5当量)和甲基碘(219g，1.5mol，1.5当量)于用惰性氮气气氛吹扫并维持的反应烧瓶中组合。在室温下搅拌所得溶液过夜，随后用水(15l)稀释。搅拌1小时后，通过过滤收集固体。将残余物溶解于dcm(5l)中。经mgso4干燥合并的有机相并且在真空中浓缩，得到呈黄色固体状的化合物17(520g)。将化合物17(520g，1.0mol，1.0当量)于cpme(2.6l)中的溶液置于用惰性氮气气氛吹扫并维持的反应烧瓶中。在-5℃下添加hcl于cpme中的4n溶液(2.6l)。在室温下搅拌所得溶液过夜，随后在真空中浓缩到所述体积的一半(得到化合物18)。通过过滤收集固体，随后用etoac与dipe的1:2混合物洗涤，得到呈灰白色固体状的化合物19(220g)。将化合物19(218g，602.5mmol，1.0当量)于thf(4l)和n-甲基吗啉(170g，1.7mol，2.8当量)中的溶液置于用惰性氮气气氛吹扫并维持的反应烧瓶中。在-5℃下在搅拌下逐滴添加氯甲酸2-甲基丙酯(164.4g，1.2mol，2.0当量)。在-5℃下搅拌所得溶液20分钟。随后在-5℃下在搅拌下逐滴添加nabh4(91.5g，2.4mol，4.0当量)于水(400ml)中的溶液。在室温下再搅拌所得溶液1小时。随后通过逐滴添加1nhcl(2.6l)淬灭反应物，并且搅拌所得混合物1小时，随后在真空中浓缩。随后再搅拌残余混合物1小时，接着通过过滤收集固体。用水洗涤固体，溶解于thf中，经na2so4干燥并且在真空中浓缩，得到呈白色固体状的化合物21(170g)。制备4：(2s,4r)-4-叔丁氧基羰基氨基-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-2-羟甲基-2-甲基戊酸苯甲酯(化合物23)将(3s,5r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基甲基)-3-羟甲基-3-甲基吡咯烷-2-酮(21)(5.0g，14.4mmol)溶解于thf(10ml)中并且置于氮气下。将溶液置于冰浴中。添加nahmds(31.6ml，31.6mmol)并且在0℃到室温下搅拌混合物10分钟。随后添加(boc)2o(7.3ml，31.6mmol)并且在室温下搅拌混合物1小时，此时lc/ms展示反应完成。向这种粗溶液中添加10nnaoh(21.6ml，216mmol)于水中的溶液，达到ph约12。再添加thf(约10ml)并且在室温下搅拌溶液过夜，此时lc/ms展示反应完成。依序添加etoac和1nhcl的溶液直到达到ph5为止。萃取有机层，经mgso4干燥，过滤并且蒸发。通过正相色谱(50-100％etoac/己烷)纯化粗残余物，得到化合物22(2.5g)。将化合物22(550mg，1.2mmol)、k2co3(179mg，1.3mmol)和苯甲基溴(154μl，1.3mmol)于dmf(6ml)中组合并且在室温下搅拌3-4小时，此时lc/ms展示反应完成。在真空中去除溶剂并且通过正相色谱纯化粗残余物，得到化合物23(453mg)。实例3：(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-2-羟甲基-2-甲基-4-(草酰基氨基)戊酸乙酯(比较化合物c3)将acoh(376μl，6.6mmol)添加到(2s,4r)-4-叔丁氧基羰基氨基-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-2-羟甲基-2-甲基戊酸苯甲酯(23)(730mg，1.3mmol)的溶液中，继而添加钯(140mg，131μmol)。在氢气下搅拌所得混合物3小时，此时lcms展示反应完成。使用0.2μmptfe阿克偌蒂斯克(acrodisc)cr过滤器过滤混合物并且浓缩，得到呈透明无色粘性液体状的化合物24(599mg)。将4nhcl的二恶烷溶液(4.8ml，19.3mmol)添加到化合物24(599mg，1.3mmol)于etoh(5ml)中的溶液中。在80℃下搅拌所得混合物3小时，随后在真空中浓缩，得到透明无色液体。通过逆相色谱(含有0.05％tfa的20-90％mecn的水溶液)纯化粗液体，得到白色胶状盐酸盐形式的化合物25(455mg)。在0℃下将叔丁醇(574μl，6.0mmol)添加到草酰氯(772μl，9.0mmol)于dcm(3ml)中的溶液中，并且在室温下搅拌混合物30分钟。随后在真空中浓缩反应混合物，得到呈透明无色液体状的2-氯-2-氧代乙酸叔丁酯(403mg)。将液体溶解于dcm(2.5ml)中，得到1.0mdcm溶液。将dipea(261μl，1.5mmol)添加到化合物25(236mg，599μmol)于dcm(3.0ml)中的溶液中，继而添加2-氯-2-氧代乙酸叔丁酯(1mdcm溶液；659μl，659μmol)，并且在室温下搅拌混合物15分钟。随后添加tfa(3.0ml)并且在室温下搅拌混合物30分钟。在真空中浓缩混合物，得到透明淡黄色液体。通过逆相色谱(含有0.05％tfa的20-90％mecn的水溶液)纯化粗液体，得到呈白色固体状的比较化合物c3(174mg)。msm/z[m+h]+的计算值c23h25clfno6,466.14；实验值466。制备5：(s)-2-(4-溴苯甲基)-5-氧代吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(化合物28)在-5℃下向(r)-2-氨基-3-(4-溴苯基)丙酸(50g，0.2mol)于mecn(700ml)中的溶液中添加naoh(16.4g，0.4mol)于水(700ml)中的溶液。搅拌10分钟后，添加(boc)2o(44.7g，0.2mol)于mecn(100ml)中的溶液。使混合物升温到室温并且搅拌过夜。蒸发mecn后，用dcm(800ml)稀释残余物并且在-5℃下用1mhcl酸化到ph2。用dcm(3×200ml)萃取水相。用nacl饱和水溶液(500ml)洗涤合并的有机层，经na2so4干燥并且浓缩，得到呈白色固体状的化合物13(66.5g)。lc-ms:366[m+na],709[2m+na]。在-5℃下在氮气下经1小时向化合物13(66.5g，193μmol)、麦氏酸(meldrum'sacid)(33.4g，232mmol)和dmap(37.7g，309mmol)于无水dcm(600ml)中的溶液中逐滴添加dcc(47.9g，232mmol)于无水dcm(200ml)中的溶液。在-5℃下搅拌混合物8小时，随后冷冻过夜。观察到二环己基脲的晶体。过滤混合物，用5％khso4(5×200ml)和nacl饱和水溶液(200ml)洗涤，随后在冷藏下经无水mgso4干燥过夜。随后蒸发溶液，得到呈淡黄色固体状的粗化合物26(91g)。lc-ms:492[m+na],961[2m+na]。在-5℃下在氮气下向粗化合物26(91g，193mmol)于无水dcm(1l)中的溶液中添加acoh(127.5g，2.1mol)。在-5℃下搅拌混合物30分钟，随后经1小时以小份添加nabh4(18.3g，483mmol)。在-5℃下再搅拌1小时后，添加nacl饱和水溶液(500ml)。用nacl饱和水溶液(2×300ml)和水(2×300ml)洗涤有机层，经mgso4干燥，过滤并且浓缩，得到粗产物，通过用et2o洗涤进一步纯化，得到呈淡黄色固体状的化合物27(68g)。lc-ms:478[m+na],933[2m+na]。在氮气下使化合物27(68g，149mmol)于无水甲苯(500ml)中的溶液回流3小时。蒸发溶剂后，通过色谱(己烷:etoac＝10:1)纯化残余物，得到呈淡黄色油状的化合物28(38g)。lc-ms:376[m+na],729[2m+na]。制备6：(2r,4r)-4-氨基-5-(4-溴苯基)2-羟基戊酸乙酯(化合物33)在-5℃下在氮气下向(s)-2-(4-溴苯甲基)-5-氧代吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(28)(38g，107mmol)于无水dcm(250ml)中的溶液中添加tfa(20ml，0.27mol)。使混合物升温到室温并且搅拌过夜。蒸发溶剂后，用etoac(300ml)稀释残余物，并且用nahco3饱和水溶液(3×200ml)、水(200ml)、nacl饱和水溶液(250ml)洗涤，经na2so4干燥并且浓缩，得到呈淡黄色固体状的粗化合物29(24g)。lc-ms:254[m+h]。在0℃下在氮气下经30分钟向nah(8.6g，250mmol)于无水thf(200ml)中的溶液中逐滴添加化合物29(24g，94mmol)于无水thf(200ml)中的溶液。使混合物升温到室温，并且搅拌2小时。冷却到0℃后，经30分钟逐滴添加特戊酰氯(18g，150mmol)。使混合物升温到室温并且搅拌过夜。用nh4cl饱和水溶液(300ml)淬灭反应物并且用etoac(3×200ml)萃取。用nacl饱和水溶液(300ml)洗涤合并的有机层，经mgso4干燥，过滤并且浓缩，得到粗产物，通过色谱(己烷:etoac＝25:1)进一步纯化，得到呈淡黄色固体状的化合物30(18g)。lc-ms:360(m+na)。在-78℃下在氮气下经30分钟向化合物30(18g，53mmol)于无水thf(250ml)中的溶液中逐滴添加nahmds(47.7ml，96mmol)。在-78℃下搅拌90分钟后，经30分钟逐滴添加(+)-(8,8-二氯樟脑基磺酰基)-恶吖丙啶(31.6g，106mmol)的溶液。在78℃下搅拌2小时后，用nh4cl饱和水溶液(400ml)淬灭反应物并且用etoac(3×300ml)萃取。用nacl饱和水溶液(300ml)洗涤合并的有机层，经mgso4干燥，过滤并且浓缩，得到粗产物，通过色谱(己烷:etoac＝15:1)进一步纯化，得到呈淡黄色固体状的标题化合物31(8.9g)。lc-ms:376(m+na)。在100℃下加热化合物31(8.9g，25mmol)于浓hcl(81ml，81mmol)中的溶液16小时。随后浓缩混合物，得到粗产物，通过用et2o洗涤进一步纯化，得到呈淡黄色固体盐酸盐形式的化合物32(7g)。lc-ms:323(m+h)。在室温下将化合物32(7g，22mmol)于etoh(10ml)中的溶液与8mhcl的etoh溶液(120ml，960mmol)组合。在50℃下加热混合物16小时，随后浓缩。通过用et2o洗涤进一步纯化粗产物，得到呈淡黄色固体盐酸盐形式的化合物33(6g)。lc-ms:352(m+h)。制备7：氯-氧代-乙酸叔丁酯(化合物34)在0℃下在氮气下将草酰氯(232μl，2.8mmol)与叔丁醇(228μl)在乙醚(6.7ml)中组合。在室温下搅拌所得混合物30分钟。在真空下蒸发溶剂以形成化合物34。制备8：(2r,4r)-5-(4-溴苯基)-4-(叔丁氧基乙二酰基-氨基)-2-羟基戊酸乙酯(化合物36)将乙二酰氯(401μl，4.7mmol)于dcm(8ml)中的溶液与叔丁醇(454μl，4.7mmol)组合。逐滴添加et3n(198μl，1.4mmol)，并且搅拌所得溶液5分钟。随后将这种溶液逐滴添加到(2r,4r)-4-氨基-5-(4-溴苯基)2-羟基戊酸乙酯(35)(150mg，474μmol)和et3n(198μl，1.4mmol)于dcm(5ml)中的溶液中并且搅拌直到反应完成为止。蒸发溶剂并且通过正相色谱(20-100％etoac/己烷)纯化粗物质，得到化合物36。实例4：(2r,4r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-2-羟基-4-(草酰基氨基)戊酸乙酯(比较化合物c4)将(2r,4r)-5-(4-溴苯基)-4-(叔丁氧基乙二酰基-氨基)-2-羟基戊酸乙酯(36)(48.5mg，109μmol)与5-氯-2-氟苯基酸(22.8mg，131μmol)和k2co3(45.2mg，327μmol)于叔丁醇(2ml)和水(0.3ml)中的溶液组合。添加dpp-pd(0.28毫摩尔/克负载；39mg，11μmol)并且在80℃下加热混合物15分钟，此时lc/ms展示所要产物。过滤混合物，浓缩滤液并且通过制备型hplc纯化，得到比较化合物c4(20mg)。msm/z[m+h]+的计算值c21h21clfno6,438.10；实验值438.0。比较化合物c4描述于休斯等人的美国专利第8,691,868号的实例5-6中。制备9：(2r,4r)-4-氨基-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-2-羟基戊酸乙酯(化合物42)在室温下在氮气下向(s)-2-(4-溴苯甲基)-5-氧代吡咯烷-1-甲酸叔丁酯(28)(25g，70.6mmol)于1,4-二恶烷(500ml)中的溶液中添加5-氯-2-氟苯基酸(24.6g，141mmol)、pd(pph3)4(4.1g，3.5mmol)和k2co3(17.8g，141mmol)于水(90ml)中的溶液。将混合物加热到60℃并且搅拌过夜。添加水(500ml)并且蒸发溶剂。用etoac(3×200ml)萃取混合物。用nacl饱和水溶液(300ml)洗涤合并的有机层并且过滤。浓缩滤液，得到粗产物，通过色谱纯化，得到呈淡黄色固体状的化合物37(22.7g)。lc-ms:829.2[2m+na+]。在0℃下在氮气下向化合物37(4.9g，12.1mol)于dcm(100ml)中的溶液中添加tfa(4.5ml，60.7mmol)，并且搅拌1小时。使混合物升温到室温后维持1.5小时。蒸发溶剂后，用etoac(100ml)稀释残余物，随后用nahco3饱和水溶液(3×100ml)、水(2×100ml)、nacl饱和水溶液(100ml)洗涤，随后经na2so4干燥。过滤混合物并且浓缩滤液，得到粗化合物38(与各别批次合并，总共16.9g)。lc-ms:304[m+h]。在0℃下在氮气下向nah(2.4g，695mmol)于thf(200ml)中的溶液中逐滴添加化合物38(8.5g，278mmol)于thf(50ml)中的溶液。使混合物升温到室温并且搅拌2小时。冷却到0℃后，经30分钟逐滴添加特戊酰氯(5g，41.7mmol)。使混合物升温到室温并且搅拌9.5小时。用nh4cl饱和水溶液(250ml)淬灭反应物并且用etoac(3×400ml)萃取。经na2so4干燥合并的有机层并且浓缩，得到粗产物，通过色谱纯化，得到呈黄色固体状的化合物39(18g)。lc-ms:388[m+h+]。在-78℃下在氮气下向化合物39(9g，23.2mmol)于thf(200ml)中的溶液中逐滴添加nahmds(20.9ml，41.8mmol)。在-78℃下搅拌1小时后，逐滴添加(+)-(8,8-二氯樟脑基磺酰基)恶吖丙啶(10.4g，34.8mmol)于thf(50ml)中的溶液。在-78℃下搅拌1小时后，用nh4cl饱和水溶液(50ml)淬灭反应物并且用etoac(3×400ml)萃取。用1mhcl(400ml)、nahco3饱和水溶液(400ml)和nacl饱和水溶液(400ml)洗涤合并的有机层，经na2so4干燥并且浓缩，得到粗产物，通过色谱纯化，得到呈白色半固体状的化合物40(8.8g)。lc-ms:426.1[m+na+]。将化合物40(8.8g，21.8mmol)于etoh(12ml)中的溶液添加到浓hcl(200ml)中，在100℃下加热并且搅拌过夜。随后浓缩混合物，得到粗产物，通过用et2o(100ml)洗涤纯化，得到呈固体盐酸盐形式的化合物41(7.5g)。lc-ms:338[m+h+]。在50℃下加热化合物41(7.5g，20.1mmol)于etoh/hcl(100ml)中的溶液过夜。浓缩混合物并且通过用et2o(200ml)洗涤纯化粗产物，得到呈白色固体盐酸盐形式的化合物42(6.5g)。lc-ms:366.1[m+h+]。实例5：(2r,4r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-4-(乙氧基草酰基氨基)-2-羟基戊酸(比较化合物c5)将1.0nhcl(6ml)添加到(2r,4r)-4-氨基-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-2-羟基戊酸乙酯(42)(114mg，313μmol)并且在90℃下搅拌混合物24小时，随后在减压下浓缩。将两性离子产物与et3n(157μl，1.1mmol)于dcm(6ml)中的溶液组合，继而在0℃下添加乙基乙二酰氯(34.9μl，313μmol)于dcm(2ml)中的溶液，并且在室温下搅拌所得混合物30分钟。添加nahco3饱和水溶液(5ml)，并且在室温下搅拌混合物1小时。用dcm(3×3ml)萃取混合物，浓缩并且通过制备型hplc纯化残余物，得到比较化合物c5(5mg)。msm/z[m+h]+的计算值c21h21clfno6,438.10；实验值438.2。比较化合物c5描述于休斯等人的美国专利第8,691,868号的实例5-14中。实例6：(2r,4r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-2-羟基-4-(草酰基氨基)戊酸(比较化合物c6)将(2r,4r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-4-(乙氧基草酰基氨基)-2-羟基戊酸(c5)与1mlioh的水溶液(2.5ml，2.5mmol)组合。在室温下搅拌混合物1小时，此时lcms展示反应完成。在真空中去除溶剂，得到比较化合物c6(20.8mg)。msm/z[m+h]+的计算值c19h17clfno6,410.07；实验值410.0。比较化合物c6描述于休斯等人的美国专利第8,691,868号的实例5-5中。实例7：(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟-[1,1'-联苯]-4-基)-4-(2-乙氧基-2-氧代乙酰氨基)-2-(羟甲基)-2-甲基戊酸钙(1')的晶体的稳定性研究医药开发的一个挑战与发现具有适当高熔点的药物的稳定结晶形式有关。本发明的挑战是不可获得化合物1的游离酸的晶体。此外，多种晶体筛选失败，除了获得(2s,4r)-5-(5'-氯-2'-氟联苯-4-基)-4-(乙氧基草酰基氨基)-2-羟甲基-2-甲基戊酸的两种精氨酸和钙晶体以外。然而，精氨酸晶体(参见实例1)在环境条件下易潮解并且难以进一步开发。另一方面，钙晶体是稳定的并且在约239℃下熔融。出于所述原因，在下文报道的温度和相对湿度(rh)％下进行化合物1'的加速稳定性研究。a分析＝(质量物质/总质量)*100＝％(w/w)。b纯度＝(纯物质的auc/不纯物质的auc)*100＝％(a/a)。cnt＝未测试。这些数据展示化合物1'在测试的温度和相对湿度下多达至少三个月保持相对稳定。分析在下述分析中评估化合物1和比较化合物c2、c3、c4、c5和c6。下表说明可由一或多种在其结构上的各个位置裂解的化合物形成的代谢物。化合物或前药→活性代谢物化合物1比较化合物c2比较化合物c3比较化合物c2比较化合物c4比较化合物c6比较化合物c5比较化合物c6分析1：抑制剂对人类和大鼠nep的效能的活体外定量分析使用下述活体外分析测定对人类和大鼠脑啡肽酶(ec3.4.24.11；nep)的抑制活性。从大鼠肾脏中提取nep活性由成年史泊格多利(spraguedawley)大鼠的肾脏制备大鼠nep。用冷磷酸盐缓冲生理食盐水(pbs)洗涤整个肾脏，并且在冰冷裂解缓冲液(1％曲拉通(triton)x-114、150mmnacl、50mm三(羟基甲基)氨基甲烷(tris)ph7.5；波迪尔(bordier)(1981)生物化学杂志256:1604-1607)中以每克肾脏5ml缓冲液的比率进行培育。使用宝创(polytron)手持式组织研磨机在冰上使样品均匀化。在3℃下于旋桶式转子(swingingbucketrotor)中以1000×g将匀浆离心5分钟。将离心块再悬浮于20ml冰冷裂解缓冲液中，并且在冰上培育30分钟。接着使样品(15-20ml)在25ml冰冷垫缓冲液(6％w/v蔗糖、50mmph7.5tris、150mmnacl、0.06％、曲拉通x-114)上分层，加热到37℃后维持持续3-5分钟，并且在室温下于旋桶式转子中以1000×g离心3分钟。吸出上两层，留下含有富集的膜部分的粘稠油状沉淀物。添加甘油到50％的浓度，并且将样品储存在-20℃下。使用bca检测系统以牛血清白蛋白(bsa)作为标准物来定量蛋白质浓度。酶抑制分析以市售方式获得重组人类nep(r&d系统(r&dsystems),明尼苏达州明尼阿波利斯市(minneapolis,mn)，目录号1182-zn)。使用荧光肽底物mca-d-arg-arg-leu-dap-(dnp)-oh(梅代罗斯(medeiros)等人,(1997)巴西医学和生物学研究的杂志(braz.j.med.biol.res.)30:1157-62；阿娜斯派(anaspec),加利福尼亚州圣何塞市(sanjose))。在37℃下，在384孔白色不透明培养板中，使用于分析缓冲液(50mmhepes，ph7.5，100mmnacl，0.01％聚乙二醇脱水山梨糖醇单月桂酸酯(吐温(tween)-20)，10μmznso4)中10μm浓度的荧光肽底物进行分析。对应酶的使用浓度使得在37℃下20分钟之后1μm底物发生定量蛋白分解。在10μm到20pm的浓度范围内分析测试化合物。将测试化合物添加到酶中，并且在37℃下培育30分钟，随后通过添加底物引发反应。在37℃下培育20分钟后，通过添加冰醋酸达到3.6％(v/v)的最终浓度来终止反应。在荧光计上用分别设定是320nm和405nm的激发和发射波长读取培养板。通过使用以下公式对数据进行非线性回归来获得抑制常数(格拉夫帕德软件公司(graphpadsoftware,inc.),加利福尼亚州圣地亚哥市(sandiego))：v＝v0/[1+(i/k')]其中v是反应速率，v0是不受抑制的反应速率，i是抑制剂浓度，并且k'是表观抑制常数。化合物大鼠pki人类pki19.19.1c29.59.2c35.75.4c48.17.8c59.79.7c69.89.7这些数据展示化合物1类似于比较化合物c2对大鼠和人类nep具有效能，而比较化合物c3相较于比较化合物c2对大鼠和人类nep酶具有极低效能。同样，比较化合物c5类似于比较化合物c6对大鼠和人类nep具有效能，而比较化合物c4相较于比较化合物c6对大鼠和人类nep酶具有低效能。化合物1、c2、c5和c6对大鼠和人类nep酶具有显著活性，并且满足适用作上述医疗用途的pki≥9.0的活性阈值。分析2：大鼠、犬和猴中的口服药物动力学研究每只大鼠、犬或猴药物动力学研究以测试化合物的调配物开始。将适当质量的每种测试化合物添加到一定量的媒剂(例如5％碳酸氢钠、5％右旋糖的水溶液)中以使得每种化合物的最终浓度适当于以2ml/kg给与。尽管均匀悬浮液为口服给药可接受，但静脉内给药溶液在给药之前经过无菌过滤(0.2μm)以确保不投与粒子。在大鼠研究中，从哈兰(harlan)实验室(印第安纳州印第安纳波利斯市(indianapolis,in))获得预插管8到10周龄雄性史泊格-多利大鼠(每种途径3只)。大鼠接受给药溶液的单次口服管饲或单次静脉内(经由外侧尾部静脉)给与。最后一剂通常是0.5-3mg/kg。经由植入颈静脉中的导管在给药后3分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时和24小时收集连续血液样品。手动或使用自动血液取样器进行取样。将样品收集于含有氟化钠、草酸钾和巴拉松(paraoxon)(分别是抗凝血剂和酯酶抑制剂)的微量采血管中，并且通过冷冻离心加工成血浆。在犬研究中，使圈养在亚哲力士(agilux)实验室(马萨诸塞州伍斯特市(worcester,ma))并且体重是7-12kg的雄性米格鲁犬(beagledog)(每种途径3只)接受单次口服管饲剂量的给药溶液。最后一剂通常是0.1-2mg/kg。经由直接静脉穿刺在给药后3分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时和24小时收集连续血液样品。将所有样品手动收集于含有氟化钠、草酸钾和巴拉松的微量采血管中并且通过冷冻离心加工成血浆。在猴研究中，使圈养在xenometrics(堪萨斯州史迪威市(stilwell,ks))并且体重是4-5kg的雄性食蟹猕猴(cynomolgusmonkey)(每种途径3只)接受单次口服管饲剂量的给药溶液。最后一剂是2mg/kg。在剂量投与之前和给药后5分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、8小时、12小时和24小时从头静脉或隐静脉收集连续血液样品。将所有样品收集于含有草酸钾、氟化钠和巴拉松的管中并且通过冷冻离心加工成血浆。用3倍体积的含有适合内标的mecn萃取血浆样品。将萃取物于3倍体积的含有1％甲酸的水中复原并且经由hplc偶合的ms/ms分析。使用菲尼克斯(phoenix)软件(法赛特公司(pharsightcorp.)，密苏里州圣路易斯市(st.louis,mo))分析血浆浓度-时间数据以计算药物动力学参数。口服生物可用性(％f)表示在与整个剂量直接投与全身循环的静脉内给药比较时，口服给与后到达全身循环的剂量的百分比。其等于口服给与后浓度-时间曲线下面积与静脉内给与后浓度-时间曲线下面积的比率，所述比率对途径之间剂量的任何差异进行标准化。aauc最终是时间0到给药后观察到最后一个可定量浓度的时间的血浆浓度相对于时间曲线下面积，其通过线性梯形法估算b通过auc最终除以所投与剂量标准化这些数据展示，在测试的所有三个动物模型中，比较化合物c2(化合物1的活性代谢物)具有低口服生物可用性，而化合物1具有相对高口服生物可用性。分析3：大鼠和犬中的静脉内/口服药物动力学研究每只大鼠或犬药物动力学研究以测试化合物的调配物开始。将适当质量的每种测试化合物添加到一定量的媒剂(例如5％碳酸氢钠、5％右旋糖的水溶液)中以使得每种化合物的最终浓度适当于以2ml/kg给与。尽管均匀悬浮液为口服给药可接受，但静脉内给与溶液在给药之前经过无菌过滤(0.2μm)以确保不投与粒子。在大鼠研究中，从哈兰实验室(印第安纳州印第安纳波利斯市)获得预插管8到10周龄雄性史泊格-多利大鼠(每种途径3只)。大鼠接受给药溶液的单次口服管饲或单次静脉内(经由外侧尾部静脉)给与。最后一剂通常是0.5-3mg/kg。经由植入颈静脉中的导管在给药后3分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时和24小时收集连续血液样品。手动或使用自动血液取样器进行取样。将样品收集于含有氟化钠、草酸钾和巴拉松的微量采血管中并且通过冷冻离心加工成血浆。在犬研究中，使圈养在亚哲力士实验室(马萨诸塞州伍斯特市)并且体重是7-12kg的雄性米格鲁犬(每种途径3只)接受单次口服管饲或单次静脉内(经由留置导管)剂量的给药溶液。最后一剂通常是0.1-2mg/kg。经由直接静脉穿刺在给药后3分钟、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、12小时和24小时收集连续血液样品。将所有样品手动收集于含有氟化钠、草酸钾和巴拉松的微量采血管中并且通过冷冻离心加工成血浆。用3倍体积的含有适合内标的mecn萃取血浆样品。将萃取物于3倍体积的含有1％甲酸的水中复原并且经由hplc偶合的ms/ms分析。使用菲尼克斯软件(法赛特公司，密苏里州圣路易斯市)分析血浆浓度-时间数据以计算药物动力学参数。大鼠药物动力学数据aauc最终是时间0到给药后观察到最后一个可定量浓度的时间的血浆浓度相对于时间曲线下面积，其通过线性梯形法估算b口服生物可用性以口服投药前药后活性分子的auc最终除以静脉内投与活性分子后的auc最终计算，其对所投与剂量的任何差异进行标准化，表示为百分比形式。这些大鼠数据展示本发明化合物(即化合物1)相较于化合物c3、c5或c4产生显著较大的其活性代谢物的全身暴露(代谢物生物可用性值分别是>100％、21％、11％和9％)。活性代谢物化合物或前药活性auc最终/前药auc最终c21未检测到前药c2c31.2c6c5未检测到前药c6c417对于化合物1和比较化合物c5，未检测到前药，因此可假定在大鼠中活体内发生前药化合物到活性代谢物的完全转化。这些化合物均具有大于比较化合物c4(17)或比较化合物c3(1.2)的代谢物暴露比。这些前药通过酯水解裂解，相较于在犬或人类中，其通常在大鼠中更快速地发生。出于所述原因，酯水解的大鼠模型并不总能预测人类中的裂解。因此，前药(如本发明的前药)也应在犬中评估以获得其它预测数据来估算在人类中的裂解速率。犬药物动力学数据这些犬数据展示本发明化合物(即化合物1)所产生的其活性代谢物的口服生物可用性类似于比较化合物c4并且所述生物可用性比化合物c3或c5大得多(值分别是44％、46％、0％和29％)。活性代谢物化合物或前药活性auc最终/前药auc最终c21177c2c30c6c513c6c41.2这些犬数据展示，相较于所测试的其它化合物或前药中的任一种，本发明的前药(即化合物1)产生显著较大的相对于其活性代谢物分子的相对暴露(即auc最终)。这类快速并且大量的前药水解为本发明化合物提供显著并且出乎意料的优势。在犬中，化合物1比比较化合物c5的裂解有效得多，从而产生超过10倍暴露比率改良(177相对于13)。此外，化合物1的裂解在与比较化合物c3比较时甚至更有效(暴露比是177相对于0)。这种差异的大小尚未能基于对比较化合物c5的水解程度的比较(如与c4比较(13相对于1.2))来预测。分析4：化合物1在雄性米格鲁犬中的肾分泌确保适当长期药物给与和患者中的适当稳态药物浓度的重要因素是药物清除率。一般来说，药物清除率降低产生较高的药物浓度和较大的药物作用。为了解化合物1的肾清除率，如下所述在雄性米格鲁犬中评定单次静脉内给药后尿中所回收的所投与剂量的百分比。体重是9.58-10.42kg的雄性米格鲁犬(n＝3)接受静脉内给与1.0mg/kg化合物1。于5％nahco3的d5w溶液中调配化合物1。将犬禁食过夜并且在剂量投与前用五肽胃泌素(60μg/ml，0.1ml/kg，肌肉内)预处理约30分钟以刺激胃分泌。给药后约4小时将食物返回。收集尿样品，在收集期间用冷冰包装包围。24小时后，记录样品重量，将样品充分混合，获得等分试样并且在生物分析之前冷冻(-80℃)。通过lc/ms/ms测定化合物1的犬尿浓度。将尿研究样品(用血浆稀释)涡旋并且将50μl置于96孔板中。用具有内标金黄素的乙腈萃取样品。将萃取物离心，将上清液转移到新96孔板中并且将1份样品稀释于4份含0.2％甲酸的水中。将样品(12μl)注射于沃特世超高效液相色谱过程分析仪(watersacquity)uplcbehc18(50×2.1mm，1.7μm)柱上，其中流速是0.9ml/min。移动相a由95:5:0.1(v:v:v)水:乙腈:甲酸组成，并且移动相b由50:50:0.1(v:v:v)甲醇:乙腈:甲酸组成。化合物1分析范围是0.001到5.00μg/ml。24小时的收集期中所分泌的尿的平均量和尿中所分泌的投与剂量的大致百分比报道于下表中。a三个测定值的平均值犬中化合物1的肾分泌大致是<所投与剂量的0.5％。这一数据表明化合物1在雄性米格鲁犬中具有低肾分泌。当前第1页12